Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage
Summary
Ce protocole décrit un test rapporteur minigène pour surveiller l’impact des mutations du site de l’épissure 5’sur l’épissage et développe un suppresseur U1 snRNA pour le sauvetage de l’inhibition de l’épissage induite par mutation. Les constructions de l’ARNN U1 rapporteur et suppresseur sont exprimées dans les cellules HeLa, et l’épissage est analysé par extension d’amorce ou RT-PCR.
Abstract
Au cours de l’expression des gènes, l’étape vitale de l’épissage pré-ARNm implique la reconnaissance précise des sites d’épissure et l’assemblage efficace de complexes splicéosomiques pour joindre les exons et éliminer les introns avant l’exportation cytoplasmique de l’ARNm mature. L’efficacité de l’épissage peut être altérée par la présence de mutations sur les sites d’épissure, l’influence de facteurs d’épissage trans-agissants ou l’activité thérapeutique. Ici, nous décrivons le protocole pour un test cellulaire qui peut être appliqué pour surveiller l’efficacité d’épissage d’un exon donné. Le test utilise un rapporteur de minigène 3-exon/2-intron codé en plasmide adaptable, qui peut être exprimé dans les cellules de mammifères par transfection transitoire. Après la transfection, l’ARN cellulaire total est isolé et l’efficacité de l’épissage des exons dans l’ARNm rapporteur est déterminée par extension de l’amorce ou par réaction en chaîne semi-quantitative transcriptase inverse-polymérase (RT-PCR). Nous décrivons comment l’impact des mutations du site d’épissure 5′ associées à la maladie peut être déterminé en les introduisant dans le rapporteur; et comment la suppression de ces mutations peut être réalisée par co-transfection avec un petit ARN nucléaire U1 (snRNA) portant des mutations compensatoires dans sa région 5′ qui se base avec les sites d’épissure 5′ aux jonctions exon-intron dans les pré-ARNm. Ainsi, le rapporteur peut être utilisé pour la conception de particules thérapeutiques en U1 afin d’améliorer la reconnaissance des sites d’épissure mutants de 5′. L’insertion de sites régulateurs à action cis, tels que des séquences d’amplificateur d’épissage ou de silencieux, dans le rapporteur peut également être utilisée pour examiner le rôle du SNNP U1 dans la régulation médiée par un facteur d’épissage alternatif spécifique. Enfin, les cellules exprimant le rapporteur peuvent être incubées avec de petites molécules pour déterminer l’effet de thérapies potentielles sur l’épissage constitutif de l’ARNm ou sur les exons porteurs de sites d’épissure mutants de 5′. Dans l’ensemble, le test rapporteur peut être appliqué pour surveiller l’efficacité de l’épissage dans diverses conditions afin d’étudier les mécanismes fondamentaux d’épissage et les maladies associées à l’épissage.
Introduction
L’épissage pré-ARNm est une étape de traitement essentielle qui élimine les introns non codants et ligature avec précision les exons codants pour former de l’ARNm mature. La reconnaissance des séquences consensuelles aux jonctions exon-intron, appelées site d’épissure 5′ et site d’épissure 3′, par les composants de la machine d’épissage initie le processus d’épissage. La petite ribonucléoprotéine nucléaire U1 (snRNP) reconnaît le site d’épissure 5′ par appariement de base de l’ARNNc U1 au pré-ARNm1. Les mutations génétiquement héréditaires qui modifient les séquences du site d’épissure 5′ sont associées à de nombreuses maladies2,3. On prévoit que la perte de l’appariement de base de l’ARNN U1 avec les sites d’épissure 5′ mutants provoque un épissage aberrant, ce qui peut compromettre la traduction de la transcription affectée. Une approche thérapeutique potentielle pour corriger les défauts d’épissage implique la suppression des mutations par l’ARNN U1 modifié portant des changements nucléotidiques compensatoires dans sa région 5′ qui se base avec le site d’épissure 5′. De tels snRNA U1 modifiés, également appelés snRNA U1 spécifiques aux exons, se sont révélés efficaces pour inverser les défauts d’épissage, entraînant une augmentation de l’expression protéique de l’ARNm sauvé4,5,6,7,8.
Ici, nous décrivons le test de complémentation SnRNP U1, un test d’épissage cellulaire basé sur un rapporteur qui permet d’évaluer l’effet des mutations 5′-ss sur l’épissage d’un exon et peut également être utilisé pour le développement d’ARNs U1 modifiés pour permettre le sauvetage de l’inclusion d’exons. Nous fournissons également des protocoles pour la surveillance des transcriptions du rapporteur épissé par extension d’amorce et RT-PCR, et pour déterminer l’expression des snRNA U1 modifiés par extension d’amorce et RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test peut être adapté pour l’analyse d’épissage dans des lignées cellulaires autres que HeLa, cependant, les facteurs affectant l’efficacité de la transfection, tels que la confluence cellulaire et la quantité d’ADN peuvent devoir être optimisés. Le rapport de construction rapporteur/U1 est un autre paramètre critique qui peut devoir être déterminé en fonction des niveaux d’expression observés dans d’autres types de cellules. La qualité de l’ARN extrait est essentielle pour l’analyse de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds versés à S.S. par les National Institutes of Health (R21CA170786 et R01GM127464) et à l’American Cancer Society (l’Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) et à S.S. et W.M. du Valley Research Partnership Program (P1-4009 et VRP77). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
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