DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA metilasyonu, gen ekspresyonunu ve kromatin yapısını düzenleyen önemli bir epigenetik işarettir. Metilasyon ağırlıklı olarak CpG dinükleotidlerinde meydana gelir – sitozin ve ardından guanosin; metil grubu, sitozinin 5 pozisyonuna eklenir. Uygun hücresel gelişim ve fonksiyon için doğru DNA metilasyon paternleri ve dolayısıyla uygun gen ekspresyonu gereklidir. Birçok hastalık durumu, normal metilasyon paterni ^1,2,3’teki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin, kanser başlangıcı ile ilerlemesi ve DNA metilasyon paternindeki değişiklikler arasında bir bağlantı vardır. Tipik olarak, kanser hücreleri, genom instabilitesine katkıda bulunan daha düşük genel metilsitozin seviyeleri sergiler. Aynı zamanda, genomda bulunan metilsitozin, tümör baskılayıcı genlerin promotör bölgelerinde yoğunlaşır ve bu da bu önemli proteinlerin gen susturulmasına yol açar. Özellikle, epigenetik değişiklikler, tümörigenez ile ilişkili DNA mutasyonlarının aksine, dinamik ve geri dönüşümlüdür. Bu, epigenetik gen regülasyonunda yer alan proteinleri ilginç ilaç hedefleri ^2,4 haline getirmiştir.

DNA metiltransferazlar (DNMT’ler), DNA metilasyon paternlerinin üretilmesinden ve korunmasından sorumlu proteinlerdir. Katalitik olarak aktif üç izozim, DNMT1, DNMT3a ve DNMT3b, insanlarda bulunur. Gelişim ve farklılaşma sırasında, de novo metiltransferazlar, DNMT3a ve DNMT3b, metilasyon paternleri oluşturur. Her iki enzim de katalitik olarak inaktif DNMT3L proteinini, artan aktivite ^1,5 sergileyen kompleksler oluşturmak için bağlayabilir. Hücre bölünmesini takiben, yavru hücreler hemimetillenmiş DNA içerir – dubleksin sadece bir ipliğinde metilsitozin içeren DNA – çünkü yeni sentezlenen DNA metilasyon izlerinden yoksundur. DNMT1’in ana işlevi, bu hemimetillenmiş DNA’yı metillemek ve böylece tam metilasyon paterni ^1,5’i yeniden ^{oluşturmaktır}.

DNMT aktivitesi ve kanser arasındaki bağlantılar iyi kurulmuştur. DNMT1’in transkripsiyonel veya post-translasyonel mekanizmalarla aşırı ekspresyonu, birkaç yaygın onkojenik yolun^bir sonucudur 6,7,8,9. Hipomorfik aleller kullanarak DNMT1 aktivitesini düşürmeye yönelik genetik yaklaşımlar, Apc ^(Min) farelerde tümör oluşumunun azalmasına neden olur¹⁰. DNMT1’i deviren antisens oligonükleotidler hücre kültüründe neoplaziyi inhibe eder ve fare tümörü modelleri^11,12. Bu nedenle, DNMT1 aktivitesini inhibe etmek umut verici bir kanser tedavisi yaklaşımı gibi görünmektedir. Bununla birlikte, DNMT3 izozimlerinin oynadığı roller o kadar basit değildir. DNMT3a mutasyonları akut miyeloid lösemi¹³ ve miyelodisplastik sendrom^14’te bulunur. Tanımlanan mutasyonlardan en az birinin,^{enzim 15’in} DNA metilasyon aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, DNMT3b meme kanseri¹⁶ ve kolorektal kanser^17’de aşırı eksprese edilir. Çeşitli DNMT izozimleri karsinogenezde farklı roller oynarken, izozime özgü inhibitörlerin tanımlanması kritik öneme sahip olacaktır. Bu bileşikler sadece terapötiklerin gelişimi için yararlı olmakla kalmayacak, aynı zamanda izozime özgü inhibitörler de her DNMT izoziminin kanser etiyolojisindeki rolünü incelemek için paha biçilmez bir araç olacaktır.

Literatürde çeşitli DNMT inhibitörleri bildirilmiştir. Bilinen DNMT inhibitörleri iki sınıfa ayrılabilir: nükleozid ve nükleozid olmayan. Nükleozid inhibitörleri tipik olarak sitidin analoglarıdır. 5-azasitidin ve 5-aza-2′-deoksisitidin miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid lösemi ^4,18’in tedavisi için onaylanmıştır. Bu bileşiklerin yüksek toksisitesi, düşük biyoyararlanımı ve kimyasal instabilitesi sorun yaratmaktadır. Devam eden çalışmalar, yeni nesil nükleozid inhibitörlerinin etkinliğini incelemektedir; 5-aza-2′-deoksisitidinden türetilen SGI-110, bir örnek ^19,20’dir. Nükleozid inhibitörleri izozime özgü değildir ve karşılaşılan herhangi bir DNMT izozimini inaktive eder. Bu nedenle, bir nükleozid demetilasyon ajanı ile tedavi, tüm DNMT izozimlerinin ^4,18 tükenmesine neden olur. Nükleozid olmayan inhibitörlerin, inhibitör etkilerini göstermek için DNA’ya dahil edilmeleri gerekmez. Bunun yerine, bu moleküller doğrudan DNMT’lere bağlanır ve izozime özgü inhibisyon olasılığını ortaya çıkarır. SGI-1027 21, hidralazin 22, prokainamid^{23, RG108} ve türevleri 24 ve doğal ürünler, (-)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 ve lakkaik asit A^26,27 dahil olmak üzere bugüne kadar çeşitli nükleozid olmayan inhibitörler keşfedilmiştir. Bugüne kadar keşfedilen nükleozid olmayan inhibitörlerin çoğu izozim seçici değildir veya bir DNMT izozimi için zayıf tercihler göstermektedir. Ek olarak, bu moleküllerin gücünün, özellikle ^4,18 hücrelerinde iyileştirilmesi gerekir. Bu nedenle, daha güçlü, izoenzim seçici DNMT inhibitörlerini keşfetmeye veya geliştirmeye ihtiyaç vardır.

DNMT’lerin yeni küçük molekül inhibitörlerini keşfetmenin önündeki bir engel, DNMT aktivitesini incelemek için geleneksel olarak kullanılan zahmetli tahlillerdir²⁸. Tahliller genellikle birden fazla adımda süreksizdir. DNMT’lerin enzimatik aktivitesi hala radyoaktif S-adenosil metiyonin (SAM) 29,30,31,32,33,34 kullanılarak rutin olarak test edilmektedir. DNA metilasyonu için radyoaktif olmayan testler de geliştirilmiştir. Örneğin, sindirim ürünlerini ayırmak için metile duyarlı kısıtlama endonükleazları ve elektroforez kullanan tahliller^35,36 tanımlanmıştır. Bu tür süreksiz, çok adımlı analizler ilaç keşfine kolayca uygun değildir. 2000’li yılların ortalarından bu yana, daha yüksek verime sahip birkaç DNA metilasyon testi geliştirilmiştir²⁸. DNMT1 inhibitörlerini taramak için bir sintilasyon yakınlık testi kullanıldı³⁷. DNMT3a inhibitörleri 25,38’i taramak için metile duyarlı bir kısıtlama endonükleazı kullanan başka bir tahlil kullanıldı. Her iki tahlil de geleneksel DNA metilasyon tahlillerinden daha yüksek verime izin verirken, tahliller birden fazla adım gerektirir ve metilasyon aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin vermez. Daha yakın zamanlarda, metilasyon reaksiyonunun bir ürünü olan S-adenosilhomosistein (SAH) oluşumunu, NADPH oksidasyonu³⁹ ile ilişkili 340 nm’deki spektroskopik değişimle eşleştiren sürekli bir kinetik tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil, spektroskopik bir sinyal üretmek için üç bağlantı enzimi kullanır.

Ticari olarak temin edilebilen tek bir kuplaj enzimi kullanan ve gerçek zamanlı olarak veri üretebilen floresan bazlı endonükleaz kuplajlı DNA metilasyon testi geliştirdik (Şekil 1). Substrat olarak üç metilsitozin içeren bir saç tokası oligonükleotid kullanılır. Substrat DNA’sı 5′ ucunda bir florofor ve 3′ ucunda bir söndürücü içerir. Hemimetile CpG bölgesinin metilasyonu, endonükleaz Gla I – tamamen metillenmiş GCGC için bölünme bölgesini oluşturur. Gla I ürün oligonükleotidinin bölünmesi, floroforu söndürücüden serbest bırakır ve gerçek zamanlı olarak floresan üretir. Tahlil, DNMT’nin herhangi bir izoformunun aktivitesini incelemek için kullanılabilir; Bununla birlikte, DNMT1 ile daha yüksek aktivite gözlenir, çünkü bu izoenzim tercihen hemimetillenmiş DNA ^1,5’i metilleştirir. Otoinhibitör Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi (RFTS) etki alanı DNMT1’den kaldırılırsa daha da sağlam etkinlik gözlenir. N-terminal düzenleyici bölgede bulunan bu alan, katalitik bölgeye bağlanır ve DNA bağlanmasını önler. İlk ~ 600 amino asidin uzaklaştırılması, tam uzunluktaki enzimden önemli ölçüde daha aktif olan kesilmiş bir enzimle sonuçlanır (k_cat / K_m’de ~ 640 kat artış)⁴⁰. RFTS’den yoksun DNMT1 (amino asitler 621-1616) olarak adlandırılan enzimin bu aktif formu, artan katalitik gücü nedeniyle inhibitörlerin daha kolay tanımlanmasını sağlar. Bu makale, potansiyel küçük molekül inhibitörlerini taramak için RFTS’den yoksun DNMT1’i testlerde kullanmak için bir protokol sunmaktadır. Endonükleaz ile eşleşmiş sürekli tahlil kullanılarak, başlangıç hızı birkaç küçük molekülün varlığında ve yokluğunda belirlenir. Her potansiyel inhibitör, konsantrasyona bağımlı DNMT1 inhibisyonunu aramak için iki konsantrasyonda incelenir. Küçük moleküllerin varlığında gözlenen yüzde aktivitesi her durumda hesaplandı.

Şekil 1: DNA metilasyon testi. Substrat olarak 5′ ucunda bir florofor ve 3′ ucunda bir söndürücü bulunan hemimetillenmiş bir saç tokası DNA’sı kullanılır. DNMT1, metil grubunun S-adenosilmetioninden metillenmemiş CpG bölgesine transferini katalize ederek S-adenosilhomosistein ve tamamen metillenmiş DNA üretir. DNA ürünü, tamamen metillenmiş GCGC bölgelerini parçalayan endonükleaz Gla I için bölünme bölgesini içerir. Ürün DNA’sının bölünmesi, 3′ söndürücüden 5′ floroforu serbest bırakarak floresan üretir. Kısaltmalar: Fl = florofor; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; SAM = S-adenosilmetiyonin; SAH = S-adenosilhomosistein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.