Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

Метилирование ДНК является важным эпигенетическим маркером, который регулирует экспрессию генов и структуру хроматина. Метилирование происходит преимущественно в cpG динуклеотидах — цитозине, за которым следует гуанозин; метильную группу добавляют к 5-позиции цитозина. Правильные паттерны метилирования ДНК и, следовательно, правильная экспрессия генов необходимы для соответствующего клеточного развития и функционирования. Многие болезненные состояния были связаны с изменениями нормальной картины метилирования ^1,2,3. Например, существует связь между инициацией и прогрессированием рака и изменениями в паттерне метилирования ДНК. Как правило, раковые клетки демонстрируют более низкие общие уровни метилцитозина, что способствует нестабильности генома. При этом метилцитозин, присутствующий в геноме, концентрируется в промоторных областях генов-супрессоров опухолей, что приводит к глушению генов этих важных белков. Примечательно, что эпигенетические изменения являются динамичными и обратимыми, в отличие от мутаций ДНК, связанных с опухолевым генезом. Это сделало белки, участвующие в эпигенетической регуляции генов, интересными лекарственными мишенями ^2,4.

ДНК-метилтрансферазы (DDNMT) являются белками, ответственными за генерацию и поддержание паттернов метилирования ДНК. Три каталитически активных изофермента, DNMT1, DNMT3a и DNMT3b, существуют у людей. Во время разработки и дифференцировки de novo метилтрансферазы, DNMT3a и DNMT3b, устанавливают паттерны метилирования. Оба фермента могут связывать каталитически неактивный белок DNMT3L с образованием комплексов, которые проявляют повышенную активность ^1,5. После деления клеток дочерние клетки содержат гемиметилированную ДНК — ДНК, содержащую метилцитозин только в одной нити дуплекса — потому что вновь синтезированная ДНК лишена меток метилирования. Основная функция DNMT1 заключается в метилировании этой гемиметилированной ДНК, тем самым восстанавливая полную картину метилирования ^1,5.

Связи между активностью DNMT и раком хорошо известны. Сверхэкспрессия DNMT1, либо транскрипционными, либо посттрансляционными механизмами, является следствием нескольких общих онкогенных путей 6,7,8,9. Генетические подходы к снижению активности DNMT1 с использованием гипоморфных аллелей приводят к уменьшению образования опухоли у мышей Apc^(Min)10. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые нокдают DNMT1, ингибируют неоплазию в клеточной культуре и моделях опухолей мышей ^11,12. Таким образом, ингибирование активности DNMT1 кажется многообещающим подходом к терапии рака. Однако роли, которые играют изоферменты DNMT3, не так просты. Мутации DNMT3a обнаруживаются при остром миелоидном лейкозе¹³ и миелодиспластическом синдроме¹⁴. Было показано, что по меньшей мере одна из идентифицированных мутаций снижает активность метилирования ДНК фермента¹⁵. Тем не менее, DNMT3b чрезмерно экспрессируется при раке молочной железы¹⁶ и колоректальном раке¹⁷. Поскольку различные изоферменты DNMT играют различную роль в канцерогенезе, идентификация изофермент-специфических ингибиторов будет иметь решающее значение. Мало того, что эти соединения будут полезны для разработки терапевтических средств, но изофермент-специфические ингибиторы также будут бесценным инструментом для анализа роли каждого изофермента DNMT в этиологии рака.

В литературе сообщалось о нескольких ингибиторах DNMT. Известные ингибиторы DNMT можно разделить на два класса: нуклеозидные и ненуклеозидные. Нуклеозидные ингибиторы обычно являются аналогами цитидина. Эти соединения включены в ДНК и ковалентно улавливают DNMTs. 5-азацитидин и 5-аза-2′-дезоксицитидин были одобрены для лечения миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза ^4,18. Высокая токсичность, низкая биодоступность и химическая нестабильность этих соединений представляют проблемы. Текущая работа изучает эффективность следующего поколения нуклеозидных ингибиторов; SGI-110, полученный из 5-аза-2′-дезоксицитидина, является одним из примеров^19,20. Нуклеозидные ингибиторы не являются изофермент-специфическими и инактивируют любой встречающийся изофермент DNMT. Таким образом, обработка нуклеозид-деметилирующим агентом приводит к истощению всех изоферментов DNMT ^4,18. Ненуклеозидные ингибиторы не нужно включать в ДНК, чтобы оказывать их ингибирующее действие. Вместо этого эти молекулы связываются непосредственно с DDNMT, вводя возможность для изофермент-специфического ингибирования. На сегодняшний день было обнаружено несколько ненуклеозидных ингибиторов, включая SGI-1027²¹, гидралазин²², прокаинамид²³, RG108 и производные²⁴, а также натуральные продукты, (-)-эпигаллокатехин 3-галлат (EGCG)²⁵ и лаккаевую кислоту A^26,27. Большинство ненуклеозидных ингибиторов, обнаруженных на сегодняшний день, не являются изофермент-селективными или демонстрируют слабые предпочтения для одного изофермента DNMT. Кроме того, необходимо улучшить эффективность этих молекул, особенно в клетках ^4,18. Таким образом, существует необходимость в открытии или разработке более мощных, изофермент-селективных ингибиторов DNMT.

Препятствием для открытия новых низкомолекулярных ингибиторов DNMT являются трудоемкие анализы, традиционно используемые для изучения активности DNMT²⁸. Анализы обычно прерывистые с несколькими шагами. Ферментативная активность DNMT по-прежнему регулярно анализируется с использованием радиоактивного S-аденозилметионина (SAM)29,30,31,32,33,34. Также были разработаны нерадиоактивные анализы метилирования ДНК. Например, описаны анализы с использованием метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции и электрофореза для разделения продуктов пищеварения^35,36. Эти типы прерывистых, многоступенчатых анализов не поддаются открытию лекарств. С середины 2000-х годов было разработано несколько анализов метилирования ДНК с более высокой пропускной способностью²⁸. Сцинтилляционный бесконтактный анализ использовался для скрининга ингибиторов DNMT1³⁷. Другой анализ с использованием метил-чувствительной рестрикционной эндонуклеазы был использован для скрининга ингибиторов DNMT3a^25,38. Хотя оба анализа позволили получить более высокую пропускную способность, чем традиционные анализы метилирования ДНК, анализы требуют нескольких этапов и не позволяют наблюдать активность метилирования в режиме реального времени. Совсем недавно был описан непрерывный кинетический анализ, который связывает образование S-аденозилгомоцистеина (SAH), одного из продуктов реакции метилирования, со спектроскопическим изменением при 340 нм, связанным с окислением NADPH³⁹. Этот анализ использует три фермента связи для генерации спектроскопического сигнала.

Мы разработали анализ метилирования ДНК на основе флуоресценции, связанный с эндонуклеазой, который использует один коммерчески доступный фермент связи и может генерировать данные в режиме реального времени (рисунок 1). В качестве субстрата используется олигонуклеотид шпильки, содержащий три метилцитозина. СУБСТРАТНАЯ ДНК содержит флуорофор на 5′ конце и гаситель на 3′ конце. Метилирование гемиметилированного сайта CpG генерирует участок расщепления для эндонуклеазы Gla I — полностью метилированного GCGC. Расщепление продукта олигонуклеотид gla I высвобождает флуорофор из гасителя и генерирует флуоресценцию в режиме реального времени. Анализ может быть использован для изучения активности любой изоформы DNMT; однако более высокая активность наблюдается при DNMT1, так как этот изофермент преимущественно метилирует гемиметилированную ДНК ^1,5. Еще более устойчивая активность наблюдается, если домен автоингибаторной последовательности таргетирования фокусов репликации (RFTS) удаляется из DNMT1. Этот домен, обнаруженный в N-концевой регуляторной области, связывается с каталитическим сайтом и предотвращает связывание ДНК. Удаление первых ~ 600 аминокислот приводит к усеченному ферменту, который значительно более активен, чем фермент полной длины (~ 640-кратное увеличение k_cat/K_m)⁴⁰. Эта активированная форма фермента, называемая RFTS-отсутствующим DNMT1 (аминокислоты 621–1616), позволяет легче идентифицировать ингибиторы из-за его повышенной каталитической мощности. В этой статье представлен протокол для использования RFTS-отсутствующего DNMT1 в анализах для скрининга потенциальных ингибиторов малых молекул. С помощью непрерывного анализа, связанного с эндонуклеазой, начальную скорость определяют в присутствии и отсутствии нескольких малых молекул. Каждый потенциальный ингибитор исследуется в двух концентрациях для поиска концентрационно-зависимого ингибирования DNMT1. Процент активности, наблюдаемый в присутствии малых молекул, был рассчитан в каждом случае.

Рисунок 1: Анализ метилирования ДНК. В качестве субстрата используется гемиметилированная шпилька ДНК с флуорофором на 5′ конце и гасителем на 3′ конце. DNMT1 катализирует перенос метильной группы из S-аденозилметионина в неметилированный сайт CpG, генерируя S-аденозилгомоцистеин и полностью метилированную ДНК. Продукт ДНК содержит участок расщепления эндонуклеазы Gla I, которая расщепляет полностью метилированные участки GCGC. Расщепление ДНК продукта высвобождает 5′ флуорофор из 3′ гасителя, генерируя флуоресценцию. Сокращения: Fl = флуорофор; Q = quencher; DNMT1 = ДНК-метилтрансфераза 1; SAM = S-аденозилметионин; SAH = S-аденозилгомоцистеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.