Измерение β окисления жирных кислот в суспензии свежеизолированных гепатоцитов мыши
Summary
Окисление жирных кислот β является важным метаболическим путем, ответственным за выработку энергии во многих различных типах клеток, включая гепатоциты. Здесь мы описываем метод измерения β окисления жирных кислот в свежевыделенных первичных гепатоцитах с использованием 14С-меченой пальмитиновой кислоты.
Abstract
Окисление жирных кислот β является ключевым метаболическим путем для удовлетворения энергетических потребностей печени и обеспечения субстратов и кофакторов для дополнительных процессов, таких как кетогенез и глюконеогенез, которые необходимы для поддержания гомеостаза глюкозы всего тела и поддержки функции внепеченочных органов в состоянии голодания. Окисление жирных кислот β происходит в митохондриях и пероксисомах и регулируется с помощью нескольких механизмов, включая поглощение и активацию жирных кислот, уровни экспрессии ферментов и доступность кофакторов, таких как коэнзим А и NAD+. В анализах, которые измеряют β окисления жирных кислот в гомогенатах печени, лизис клеток и общее добавление супрафизиологических уровней кофакторов маскируют эффекты этих регуляторных механизмов. Кроме того, целостность органелл в гомогенатах трудно контролировать и может значительно варьироваться между препаратами. Измерение β окисления жирных кислот в интактных первичных гепатоцитах преодолевает вышеуказанные подводные камни. Этот протокол описывает метод измерения β окисления жирных кислот в суспензии свежеизолированных первичных гепатоцитов мыши, инкубированных с 14С-меченой пальмитиновой кислотой. Избегая от нескольких часов до нескольких дней культивирования, этот метод имеет преимущество в лучшем сохранении уровней экспрессии белка и активности метаболического пути исходной печени, включая активацию β окисления жирных кислот, наблюдаемого в гепатоцитах, выделенных у мышей натощак, по сравнению с кормлеными мышами.
Introduction
Окисление жирных кислот β является важным процессом в липидном обмене, обеспечивая катаболический путь для балансировки синтеза и потребления жирных кислот из рациона. Этот процесс генерирует энергию для нескольких органов, включая сердечную мышцу, кору почек и печень натощак, и использует жирные кислоты, полученные из рациона, липолиза жировой ткани и внутренних запасов триглицеридов 1,2.
Окисление жирных кислот через β путь окисления приводит к последовательному укорочению жировой ациловой цепи двумя углеродами одновременно, высвобождаемыми в виде ацетил-КоА, и этот процесс происходит как в митохондриях, так и в пероксисомах. В то время как большинство жирных кислот подвергаются только β окислению, некоторые из них окисляются при различных углеродах, прежде чем войти в этот путь. Например, 3-метилзамещенные жирные кислоты, такие как фитановая кислота, подвергаются удалению одного углерода путем α-окисления в пероксисомах перед попаданием в β путь окисления. Аналогичным образом, некоторые жирные кислоты сначала превращаются в дикарбоновые жирные кислоты путем окисления концевой метильной группы (ω-окисление) в эндоплазматическом ретикулуме, прежде чем предпочтительно окисляются в пероксисомах путем β-окисления3.
Независимо от конкретной органеллы, жирная кислота должна быть сначала преобразована в тиоэстер коэнзима А (КоА), или ацил-КоА, для окисления через β путь окисления. β-окисление длинноцепочечных ацил-КоА в митохондриальном матриксе требует карнитинового челнока для их транслокации, где карнитин пальмитоилтрансфераза 1 (CPT1) катализирует превращение ацил-КоА в ацилкарнитины и является ферментом, ограничивающим скорость в этом процессе4. После перемещения в митохондриальный матрикс ацил-КоА повторно формируются и служат субстратами для митохондриального механизма β окисления. В состоянии голодания ацетил-КоА, образующийся в результате β-окисления в печеночных митохондриях, в основном направляется на кетогенез. Пероксисомы служат основным местом для β окисления очень длинноцепочечных, разветвленных и дикарбоновых жирных кислот. Пероксисомы не требуют карнитинового шаттла для импорта субстратов жирных кислот, вместо этого импортируя соответствующие ацил-КоА через активность транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC) ABCD1-35. Внутри пероксисом ацил-КоА затем окисляются специальным набором ферментов, отличных от митохондриальных жирных кислот β механизма окисления. Как митохондрии, так и пероксисомы также требуют поставок NAD+ и свободного КоА для окисления жирных ацильных цепей. Было показано, что уровни CoA в печени увеличиваются в ответ на голодание, поддерживая повышенную скорость окисления жирных кислот, которое происходит в этом состоянии6. Кроме того, повышенная деградация КоА в пероксисомах приводит к селективному снижению окисления пероксисомальных жирных кислот7. Поэтому процесс окисления жирных кислот внутри клетки регулируется уровнями экспрессии и активностью ферментов, участвующих в активации, транспорте и окислении жирных кислот, а также концентрациями кофакторов и других метаболитов в нескольких субклеточных компартментах.
Процедуры с использованием тканевых гомогенатов для измерения окисления жирных кислот разрушают клеточную архитектуру, регулирующую и поддерживающую этот процесс, что приводит к сбору данных, которые не точно отражают метаболизм in vivo. В то время как методы, использующие покрытые первичные гепатоциты, сохраняют эту систему, культивирование изолированных клеток в течение длительных периодов времени приводит к потере профиля экспрессии генов in vivo, который присутствовал в клетках, когда они все еще жили в животном 8,9. Следующий протокол описывает способ выделения первичных гепатоцитов и анализа их способности к β окисления жирных кислот сразу после выделения и в суспензии с использованием [1-14С]пальмитиновой кислоты. Анализ основан на измерении радиоактивности, связанной с кислоторастворимыми метаболитами (ASM) или продуктами, такими как ацетил-КоА, полученными β окисления [1-14C]пальмитиновой кислоты10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время перфузии печени крайне важно избегать введения пузырьков воздуха, так как они блокируют микрокапилляры в печени, предотвращая или ограничивая буферную циркуляцию и в целом снижая выход гепатоцитов и жизнеспособность20,21. Меры предосторожности, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R35GM119528 Роберте Леонарди.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
