מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים
Summary
חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.
Abstract
חמצון β של חומצות שומן הוא מסלול מטבולי מרכזי כדי לענות על דרישות האנרגיה של הכבד ולספק מצעים וקו-פקטורים לתהליכים נוספים, כגון קטוגנזה וגלוקונאוגנזה, החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ולתמיכה בתפקוד איברים חוץ-כבדיים במצב של צום. חומצת שומן β-חמצון מתרחשת בתוך המיטוכונדריה והפרוקסיזומים ומווסתת באמצעות מנגנונים מרובים, כולל ספיגה והפעלה של חומצות שומן, רמות ביטוי אנזימים וזמינות של קו-פקטורים כגון קו-אנזים A ו-NAD+. במבחנים המודדים חומצות שומן β-חמצון בהומוגנטים של הכבד, ליזה של תאים והתוספת הנפוצה של רמות סופראפיזיולוגיות של קו-פקטורים מסווים את ההשפעות של מנגנוני ויסות אלה. יתר על כן, שלמות האברונים בהומוגנטים קשה לשליטה ויכולה להשתנות באופן משמעותי בין ההכנות. המדידה של חומצת שומן β חמצון בהפטוציטים ראשוניים שלמים מתגברת על המלכודות הנ”ל. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת חומצת שומן β-חמצון בתרחיף של הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה, עם 14חומצה פלמיטית עם תווית C. על ידי הימנעות משעות עד ימים של תרבית, לשיטה זו יש יתרון בכך שהיא משמרת טוב יותר את רמות ביטוי החלבון ואת פעילות המסלולים המטבוליים של הכבד המקורי, כולל הפעלת חומצת שומן β חמצון שנצפתה בהפטוציטים שבודדו מעכברים בצום בהשוואה לעכברים שניזונו.
Introduction
חמצון β של חומצות שומן הוא תהליך חיוני בחילוף החומרים של השומנים, המספק מסלול קטבולי לאיזון סינתזת חומצות השומן וצריכתן מהתזונה. תהליך זה מייצר אנרגיה עבור איברים רבים, כולל שריר הלב, קליפת הכליות והכבד הצום, ומשתמש בחומצות שומן המתקבלות מהתזונה, ליפוליזה של רקמת השומן ומאגריהטריגליצרידים הפנימיים 1,2.
חמצון של חומצת שומן דרך מסלול החמצון β גורם לקיצור רציף של שרשרת האציל השומנית על ידי שני פחמנים בו זמנית, המשתחררים כאצטיל-CoA, ותהליך זה מתרחש הן במיטוכונדריה והן בפרוקסיזומים. בעוד שרוב חומצות השומן עוברות רק חמצון β, חלקן מתחמצנות בפחמנים שונים לפני שהן נכנסות למסלול זה. לדוגמה, חומצות שומן בתחליפי 3-מתיל, כגון חומצה פיטנית, עוברות הסרה של פחמן אחד על ידי חמצון α בפרוקסיזומים לפני שהן נכנסות למסלול החמצון β. באופן דומה, חומצות שומן מסוימות מומרות תחילה לחומצות שומן דיקרבוקסיליות על ידי חמצון של קבוצת המתיל הטרמינלית (ω-חמצון) ברשתית האנדופלסמית לפני שהן עוברות חמצון מועדף בפרוקסיזומים על ידי חמצון β3.
ללא קשר לאברון הספציפי, יש להמיר תחילה חומצת שומן לתיואסטר קו-אנזים A (CoA), או אציל-CoA, כדי להתחמצן דרך מסלול החמצון β. β-חמצון של אציל-CoAs ארוכי שרשרת במטריצה המיטוכונדרית דורש את מעבורת קרניטין לטרנסלוקציה שלהם, כאשר קרניטין פלמיטואיל-טרנספראז 1 (CPT1) מזרז את ההמרה של אציל-CoAs לאציל-קרניטין והוא האנזים המגביל את הקצב בתהליך זה4. לאחר שהם עוברים טרנסלוקציה למטריצה המיטוכונדרית, האציל-CoAs נוצרים מחדש ומשמשים כמצעים למכונות החמצון β המיטוכונדריה. במצב של צום, האצטיל-CoA המיוצר באמצעות חמצון β במיטוכונדריה בכבד מתועל בעיקר לקטוזגנזה. פרוקסיזומים משמשים כאתר העיקרי לחמצון β של חומצות שומן ארוכות מאוד, שרשרת מסועפת ודיקרבוקסיליות. פרוקסיזומים אינם דורשים ממעבורת קרניטין לייבא מצעי חומצות שומן, ובמקום זאת מייבאים את הכתב אציל-CoAs באמצעות פעילותם של מובילי הקלטת הקושרים ATP (ABC) ABCD1-35. בתוך הפרוקסיזומים, אציל-CoAs מתחמצנים לאחר מכן על-ידי קבוצה ייעודית של אנזימים, הנבדלים מחומצת השומן המיטוכונדרית β-חמצון.” גם מיטוכונדריה וגם פרוקסיזומים דורשים אספקה של NAD+ ו-CoA חופשי כדי לחמצן שרשראות אציל שומניות. רמות CoA בכבד הוכחו כגוברות בתגובה לצום, מה שתומך בקצב המוגבר של חמצון חומצות שומן המתרחש במצב זה6. יתר על כן, פירוק מוגבר של CoA בפרוקסיזומים גורם לירידה סלקטיבית בחמצון חומצות שומן פרוקסיסומליות7. לכן, התהליך של חמצון חומצות שומן בתוך התא מווסת על ידי רמות הביטוי והפעילויות של אנזימים המעורבים בהפעלה, הובלה וחמצון של חומצות שומן, כמו גם ריכוזים של קו-פקטורים ומטבוליטים אחרים לאורך תאים תת-תאיים מרובים.
פרוצדורות המשתמשות בהומוגנטים של רקמות למדידת חמצון חומצות שומן הורסות את הארכיטקטורה התאית המסדירה ותומכת בתהליך זה, מה שמוביל לאיסוף נתונים שאינם משקפים במדויק את חילוף החומרים in vivo. בעוד שטכניקות המשתמשות בהפטוציטים ראשוניים מצופים משמרות את המערכת הזו, גידול תאים מבודדים לפרקי זמן ממושכים גורם לאובדן פרופיל ביטוי הגנים in vivo שהיה קיים בתאים כאשר הם עדיין חיו בתוך החיה 8,9. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לבודד הפטוציטים ראשוניים ולבחון את יכולתם לחומצת שומן β-חמצון מיד לאחר הבידוד ובתרחיף, באמצעות [1-14C]חומצה פלמיטית. הבדיקה מבוססת על מדידת הרדיואקטיביות הקשורה למטבוליטים המסיסים בחומצה (ASM) או למוצרים, כמו אצטיל-CoA, המיוצרים על ידי חמצון β של [1-14C] חומצה פלמיטית10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך זלוף הכבד, חשוב להימנע מהכנסת בועות אוויר, שכן הן חוסמות את המיקרו-קפילרים בכבד, מונעות או מגבילות את זרימת החיץ ומפחיתות באופן כללי את תפוקת הפטוציטים ואת הכדאיות20,21. אמצעי זהירות, כגון בדיקה מדוקדקת של קו הכניסה הממולא במאגר לפני התותח של ה-IVC והימנעו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R35GM119528 לרוברטה לאונרדי.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
