Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Vetzuur β-oxidatie is een essentieel proces in het lipidenmetabolisme en biedt een katabole route om de vetzuursynthese en inname uit het dieet in evenwicht te brengen. Dit proces genereert energie voor meerdere organen, waaronder de hartspier, de nierschors en de nuchtere lever, en maakt gebruik van vetzuren verkregen uit het dieet, vetweefsellipolie en interne triglyceridenvoorraden ^1,2.

Oxidatie van vetzuur door de β-oxidatieroute resulteert in de sequentiële verkorting van de vetacylketen door twee koolstofatomen tegelijk, vrijgegeven als acetyl-CoA, en dit proces vindt zowel in de mitochondriën als in de peroxisomen plaats. Hoewel de meeste vetzuren slechts β-oxidatie ondergaan, worden sommige geoxideerd bij verschillende koolstofatomen voordat ze deze route betreden. Bijvoorbeeld, 3-methyl-gesubstitueerde vetzuren, zoals fytaanzuur, ondergaan verwijdering van één koolstof door α-oxidatie in de peroxisomen voordat ze de β-oxidatieroute betreden. Evenzo worden sommige vetzuren eerst omgezet in dicarbonzuren door oxidatie van de terminale methylgroep (ω-oxidatie) in het endoplasmatisch reticulum voordat ze bij voorkeur worden geoxideerd in de peroxisomen door β-oxidatie³.

Ongeacht het specifieke organel, moet een vetzuur eerst worden omgezet in een co-enzym A (CoA) thioester, of acyl-CoA, om te worden geoxideerd via de β-oxidatieroute. β-oxidatie van lange-keten acyl-CoA’s in de mitochondriale matrix vereist de carnitine shuttle voor hun translocatie, waar carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) de omzetting van acyl-CoA’s naar acylcarnitines katalyseert en het snelheidsbeperkende enzym in dit proces is⁴. Eenmaal getransloceerd naar de mitochondriale matrix, worden de acyl-CoA’s opnieuw gevormd en dienen ze als substraten voor de mitochondriale β-oxidatiemachines. In nuchtere toestand wordt het acetyl-CoA geproduceerd door β-oxidatie in hepatische mitochondriën voornamelijk gekanaliseerd naar ketogenese. Peroxisomen dienen als de primaire plaats voor de β-oxidatie van zeer lange keten, vertakte keten en dicarbonzuren. Peroxisomen vereisen niet dat de carnitineshuttle vetzuursubstraten importeert, maar importeert in plaats daarvan de correspondent acyl-CoA’s via de activiteit van de ATP-binding cassette (ABC) transporters ABCD1-3⁵. Binnen de peroxisomen worden acyl-CoA’s vervolgens geoxideerd door een speciale set enzymen, verschillend van de mitochondriale vetzuur- β-oxidatiemachines. Zowel mitochondriën als peroxisomen vereisen ook een voorraad NAD ⁺ en vrij CoA om vette acylketens te oxideren. Het is aangetoond dat de CoA-niveaus in de lever toenemen als reactie op vasten, ter ondersteuning van de verhoogde snelheid van vetzuuroxidatie die in deze toestand optreedt⁶. Bovendien resulteert een verhoogde CoA-afbraak in de peroxisomen in een selectieve afname van peroxisomale vetzuuroxidatie⁷. Daarom wordt het proces van vetzuuroxidatie in de cel gereguleerd door de expressieniveaus en activiteiten van enzymen die betrokken zijn bij de activering, transport en oxidatie van vetzuren, evenals de concentraties van cofactoren en andere metabolieten in meerdere subcellulaire compartimenten.

Procedures met behulp van weefselhomogenaten om vetzuuroxidatie te meten, vernietigen de cellulaire architectuur die dit proces reguleert en ondersteunt, wat leidt tot een verzameling gegevens die het in vivo metabolisme niet nauwkeurig weergeeft. Hoewel technieken met behulp van vergulde primaire hepatocyten dit systeem behouden, resulteert het kweken van geïsoleerde cellen gedurende langere tijd in een verlies van het in vivo genexpressieprofiel dat aanwezig was in de cellen toen ze nog in het dier leefden ^8,9. Het volgende protocol beschrijft een methode om primaire hepatocyten te isoleren en hun capaciteit voor vetzuur β-oxidatie onmiddellijk na isolatie en in suspensie te testen, met behulp van [^1-14C] palmitinezuur. De test is gebaseerd op de meting van de radioactiviteit geassocieerd met de zuuroplosbare metabolieten (ASM) of producten, zoals acetyl-CoA, geproduceerd door de β-oxidatie van [^1-14C]palmitinezuur^10,11.