Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Bakteriler, kurumsal inceleme kurulu onaylı 19MR0011 (UTD) ve STU 032016-006 (UTSW) çalışmalarının bir parçası olarak rızalı kadınlardan toplanan idrardan kültürlendi. 1. Değiştirilmiş gelişmiş idrar kültürü NOT: Tüm kültür adımları steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm cihazları, çözümleri ve medyayı sterilize edin. Çalışma alanını% 70 etanol ile temizleyin, ardından bir Bunsen brülörü kurun ve kirlenme olasılığını azaltmak için aleve yakın dikkatlice çalışın. Alternatif olarak, steril bir ortamı korumak için sınıf II biyogüvenlik kabini kullanılabilir. Potansiyel patojenik mikroplara maruz kalmamak için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin. Kaplama gliserol stoklu idrar ve koloni izolasyonu Gliserol stoklu idrarı oda sıcaklığında (RT) çözün. Çözüldükten sonra, örneği karıştırmak için 5 sn boyunca girdaplayın. Steril mikrosantrifüj tüplerinde, steril 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile idrarın 1:3 ve 1:30 seyreltmelerini 100 μL’lik son hacme hazırlayın.NOT: Gliserol stoklu idrar, 500 μL seyreltilmemiş idrar ve steril gliserolün 500 μL’si cryovials’te karıştırılarak ve -80 °C’de depolanarak hazırlanır. Kullanmadan önce 15 dakika boyunca 37 °C’de önceden ısıtın agar plakaları. Yaygın üriner bakteri cinslerine uygun ortam türleri ve kültür koşulları için lütfen Şekil 1’e bakın. Seyreltilmiş idrarı kaplamadan önce pipetleme ile iyice karıştırın, seyreltilmiş idrarın 100 μL plakasını istenen agar plakasına koyun ve steril cam boncuklar kullanarak numuneyi yayın. Plaka 100 μL 1x PBS seyreltici ayrı bir plaka üzerinde büyüme kontrolü yok olarak.NOT: Yaygın üropatojenik türleri kültürlemeye çalışıyorsanız (örneğin, Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterococcus faecalis, vb.), üropatojenik bakteri türlerinin kolay tanımlanmasını sağladığından kromojenik agar(Malzeme Masası)kullanılması önerilir (Şekil 1). Colistin Nalidixic Acid (CNA) veya MRS agar, seçici olmayan agarlarda titiz türleri geride kalabilen Gram negatif üropatojenler içerdiği bilinen idrardan titiz Gram-pozitif türleri (örneğin Lactobacillus spp.) izole etmek için yararlıdır. Üropatojenler için 24 saat ve titiz bakteriler için 3-5 gün süreyle 35 °C’de istenen atmosferik durumda ters çevrilmiş plakayı kuluçkaya yatırın (Şekil 1). Kuluçka süresinden sonra plakaları inkübatörden çıkarın. Her plakadan benzersiz bir renk, morfoloji veya hemolitik desenler sergileyen kolonileri seçin. Bakteri kolonisini steril bir döngü kullanarak ilgili agar üzerine yeniden çizin ve iyi izole edilmiş koloniler elde etmek için plakayı istenen atmosferde 2-5 gün boyunca inkübte edin.NOT: Birincil kültür için BAP kullanıyorsanız, kromojenik agar üzerindeki kolonların yamalması, numunedeki bakteri popülasyonunun heterojenliği hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. Sıvı et suyunda kültleme ve gliserol stoklayan bakteriyel izolatlar Ana koloninin morfolojisine uyan izole koloniler elde edildikten sonra, tek bir koloni seçin ve steril bir aşılama döngüsü kullanarak 3 mL sıvı suyuna aşılayın. Yaygın üriner mikrobiyota cinsinin büyümesini destekleyebilen et suyu için Şekil 1’e bakın. Agar plakalarını parafilm ile kapatın ve 2-4 gün boyunca 4 °C’de saklayın. Sıvı kültürleri, kültür gözle görülür şekilde bulanık olana kadar 1-5 gün boyunca istenen atmosferik koşullarda kuluçkaya yatırın. Büyüme gözlendikten sonra, kültürü girdap ve daha sonra 2 mL cryovial içinde 500 μL steril% 50 gliserol için geceleme kültürünün 1 mL’sini ekleyin; mühürleyin ve ters çevrilerek hafifçe karıştırın. Her koloni için iki gliserol stok hazırlayın (biri yedek olarak hizmet eder) ve -80 °C’de saklayın. 2. Bakteri türlerinin 16S rRNA geni Sanger dizilimi ile tanımlanması NOT: Mikrobiyal kimlik alternatif olarak Uçuş Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF)20’ninMatris Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Süresi kullanılarak doğrulanabilir. Koloni-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 12,5 μL 2x Taq Polimeraz Ana Karışımı ekleyerek PCR tüplerinde 25 μL PCR reaksiyonu hazırlayın, 0,5 μL 10 μM 8F astar, 0,5 μL 10 μM 1492R astar (Malzeme Tablası) ve 11,5 μL çekirdeksiz su21.NOT: Birden fazla numune için PCR yapıyorsanız, Taq Polymerase karışımı, astarlar ve steril nükleaz içermeyen suyun reaksiyon ana karışımını yapın. Daha sonra her PCR tüpüne aliquot 25 μL. Koloni-PCR gerçekleştirmek için steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak iyi izole edilmiş bir koloniyi yeniden çizgiden çekin. 2.1.1. adımda hazırlanan PCR reaksiyon karışımında koloniyi yeniden kullanın. Yavaşça karıştırın. Tüpün altındaki sıvıyı 2000 x g’dahızlı bir dönüşle toplayın.NOT: Numunenin hava kabarcıkları içermemesine dikkat edin. Yalnızca PCR reaksiyon karışımını içeren şablonsuz denetim (NTC) örneği ekleyin. Numune tüplerini termosiklete yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 3 dakika boyunca 95 °C; 40 döngü: 30 s için 95 °C, 30 s için 51 °C ve 1 dk 30 sn için 72 °C; 10 dakika için 72 °C; 10 °C’de tutun. Jel ekstraksiyonu ve türlerin tanımlanması PCR çalışmasının tamamlanmasının ardından, PCR ürününü 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) tamponunda hazırlanan% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin. Jeli dökmeden önce ethidium bromür (EtBr) ekleyin. Ardından, en az 20 μL numune hacmine sahip kuyular için taraklar kullanarak jeli atın.DİkKAT: EtBr kanserojen olduğundan şüphelenilen bir intercalating ajandır. Kullanırken her zaman eldiven ve KKD giyin ve EtBr içeren malzemeleri kurumun yönergelerine göre atın. Jel ayarlandığında, jeli 0,5x TBE tamponu ile dolu elektroforez tankına yerleştirin ve tarağı çıkarın. 1 kb’lık merdiveni ilk kuyuya ve PCR reaksiyonunun 10-20 μL’lik kısmını sonraki kuyulara yükleyin. Çözülene kadar 100-140 V’ta çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve NTC kuyusunda bulunmayan ~1,5 kb’da açıkça tanımlanmış bir bandın varlığını onaylayın.DİkKAT: UV ışınları cilde ve gözlere zararlıdır, jeli görselleştirirken uygun bir koruma kullanın ve uygun KKD giyin.NOT: Koloni PCR bazı bakteriler için başarısız olabilir; izole gDNA’dan PCR ile devam alternatif bir seçenektir22. ~1,5 kb bantları jilet kullanarak çıkarın ve jel kesimlerini temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Üreticinin talimatlarına göre jel çıkarma protokolüne devam edin (Malzeme Masası). Saflaştırılmış DNA’nın konsantrasyonunu mikrovolum spektrofotometre ile ölçün.NOT: 10 > ng/μL konsantrasyonu istenir ve 1.7-2.0 arasında A260/280 kabul edilebilir. Her örnek için biri 8F, diğeri de seçilen sanger sıralama hizmetinin yönergelerine göre nükleaz içermeyen suda 1492R astarı kullanarak iki Sanger dizileme reaksiyonları hazırlayın. Sıralama verileri alındıktan sonra, DNA dizilerini NCBI Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) web sitesine (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi yükleyin, Nükleotid BLAST (blastn) öğesini seçin, rRNA/ITS veritabanı 16S ribozomal RNA dizilerini (Bakteri ve Arkea) seçin ve Megablast programını çalıştırın. İzole, veritabanından bir başvuruya en yüksek kalitede isabetle tanımlanabilir.NOT: Bazı bakteri türleri 16S rRNA dizilerinde yüksek kimlik sergiler ve sadece bu yöntemle ayırt edilemez olabilir. Speciation, aynı cinsin üyelerini güvenle ayırt etmek için DNA homolojisi ve biyokimyasal analizler gerektirecektir23. 3. Genomik DNA’nın çıkarılması (gDNA) NOT: Bu bölümde, çeşitli bakteri türlerinden kaliteli genomik DNA’nın yüksek verimle çıkarılması için Malzeme Tablosunda atıfta bulunulan gDNA ekstraksiyon kitinde sağlanan reaktifler ve spin sütunları kullanılmaktadır. Aşağıda önerilen değişiklikler ve talimatlar verilmiştir. Üreticinin talimatlarına göre kit reaktifleri hazırlayın. İyi izole edilmiş kolonilerdeki bakterileri ortama aşılayarak ve yeterli büyüme gözleninnceye kadarŞekil 1’debelirtilen sıcaklık ve atmosferik basınçta inkübasyon yaparak uygun steril et suyunda 3-10 mL kültürler hazırlayın ( Şekil 1). Kuluçkadan sonra, bir spektrofotometre kullanarak kültürün 600 nm (OD600)optik yoğunluğunu ölçün24. Gece kültürlerini 1:10 oranında seyrelterek numuneyi niceleme için hazırlayın. Ölçüm için steril kültür medyasından bir boşluk da ekleyin. Örnek okumadan boş okumayı çıkararak ve on seyreltme faktörüyle çarparak optik yoğunluğu hesaplayın. OD600 ölçümünü ve türler için önceden oluşturulmuş bir OD600 ila CFU / mL oranını kullanarak, 2 x 109 hücre elde etmek için kaç mililitre kültürün gerekli olduğunu hesaplayın. Gerekli kültür hacmini pelet için 5000 x g’da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı emişin ve peleti 200 μL soğuk TE tamponunda yeniden uygulayın (prosedürün başında buzda ön soğukluk). Numuneyi 5000 x g’da 2 dakika santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve ardından peleti 180 μL Enzimatik Lizis Tamponunda (ELB) yeniden çıkarın ve önceden kaynatılmış RNase A (10 mg/mL) ekleyin. Gram-pozitif bakterilerin verimli lizisi için 18 μL mutanolysin (25 kU/mL) ekleyin. Vortex iyi ve sonra 2 saat boyunca rotator üzerinde 37 °C’de örnekleri kuluçkaya yatırın.NOT: Üreticinin protokolünde açıklanan ELB’nin hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriler için kullanılması önerilir. Üreticinin talimatlarına göre devam edin.NOT: İstenirse ek gDNA verimi elde etmek için bir veya iki kez daha elution adımlarını tekrarlayın. Bölüm 4’te belirtildiği gibi çıkarılan gDNA’nın kalitesini değerlendirin ve 1 hafta içinde kullanılacaksa gDNA’yı 4 °C’de saklayın. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için gDNA’yı -20 °C’de tutun. 4. Çıkarılan gDNA’nın kalitesinin değerlendirilmesi Jel elektroforez ile kaliteyi değerlendirmek için, 2.2 alt bölümünde açıklandığı gibi% 1 agarose jel hazırlayın. Numuneyi temiz bir tüpte hazırlayın: parafilm üzerinde 1-2 μL çıkarılan gDNA ve 3 μL 2x yükleme boyasını karıştırın. Jeli yüklendikten sonra çalıştırın ve UV ışığı altında görselleştirin.NOT: Başarılı gDNA ekstraksiyonu jelin üst kısmındaki ayrık bir bant ve minimum lekeleme ile belirgin olacaktır (Şekil 2A). Lekeleme kesmenin göstergesidir. GDNA bandı belirgin değilse ve/veya bulaştırma önemliyse, gDNA ekstraksiyonu tekrarlayın. RNase A ve Proteinaz K’de kuluçka sürelerini azaltmayı düşünün. 1,5-3 kb civarında iki bant gözlenirse, bu RNA kontaminasyonını gösterir (Şekil 2B). Taze RNase A hazırlayın ve ekstraksiyonu tekrarlayın. Kaliteyi mikrovolum spektrofotometresi ile değerlendirmek için gDNA konsantrasyonunu ve absorbans oranı A260/280’i mikrovolum spektrofotometre ile ölçün. 1.7-2.0 arasında 50 >/μL ve A260/280 konsantrasyonları kabul edilebilir.NOT: Düşük gDNA verimi düşük giriş, yüksek giriş, çekirdeklerin kirlenmesi, yetersiz lizizden kaynaklanabilir. Aralığın üzerindeki absorbans oranları RNA kontaminasyonını gösterir. gDNA kalitesi düşükse ekstraksiyonu tekrarlayın. Kaliteyi florometre ile değerlendirmek için, Yüksek Hassasiyetli test kiti ve florometre cihazı(Malzeme Masası)kullanarak gDNA konsantrasyonunun ölçülmesi için üreticinin talimatlarını izleyin. Konsantrasyon >50 ng/μL arzu edilir. 5. Eşleştirilmiş uçlu yeni nesil kısa okuma dizilimi ve kütüphane hazırlığı NOT: Kısa okuma dizilimi, çeşitli enstrümanlarda farklı okuma uzunluklarında ve yönlerinde gerçekleştirilebilir. Bakteriyel WGS için 150 bp (300 döngü) eşleştirilmiş uçlu dizileme önerilir. Hem kütüphane hazırlama hem de sıralama, temel tesislere veya ticari laboratuvarlara dış kaynaklı olabilir. Sıralama kitaplığını üreticinin talimatlarına görehazırlayın( Malzeme Masası ). Üreticinin önerilen son yükleme kitaplığı konsantrasyonuna uyun; ancak, önerilen bir değişiklik, NextSeq enstrümanlarında en iyi okuma oluşturma için havuza havuza alan kitaplığı 1,8 pM’de yüklemektir. İsteğe bağlı olsa da, havuza alınan kitaplık parçası dağılımını değerlendirmek ve parça boyutunun ortalama 600 bp olduğundan emin olmak için bir Biyoanalyzer (Malzeme Tablosu)kullanın. 6. Nanopore MinION sıralı kütüphane hazırlığı Sıralama kitaplığını üreticinin protokolüne görehazırlayın( Malzeme Masası ). İki barkod genişletme kiti kullanmak, tek bir akış hücresinde 24 numuneye kadar çoklama sağlar. Kütüphane hazırlığının, 24 numunenin çoklandığında bir seferde 12 örnek olmak üzere iki bölümde yapılması önerilir. 24 numunenin tümü aşağıda açıklandığı gibi birikebilir.NOT: Numuneler, Yerel Barkod Ligasyonu’nun bitirilmesinden sonra bir gecede 4 °C’de saklanabilir – bu, gerekirse protokolde bir durma noktası sağlar. Kütüphane hazırlık protokolünün Yerel barkod ligasyon bölümünün sonunda, her numunenin eşitlikçi miktarlarının mümkün olan maksimum DNA kütlesine (ng) kadar birleştirilmesi önerilir. Bunu yapmak için, barkod ligasyonunu izleyen tüm numuneleri, üreticinin talimatlarına göre bir florometre (Malzeme Tablosu)kullanarak ölçün. En düşük dsDNA konsantrasyonuna sahip numunenin hacmini tahmin edin ve sonra bu örnekte bulunan toplam dsDNA’yı hesaplayın. Birlikte havuza alınacak diğer tüm örneklerin eşitlikçi miktarlarını belirlemek için bu numarayı kullanın.NOT: Ekinoler hesaplama havuzalanmış dsDNA miktarını en üst düzeye çıkaracağından ve böylece yüksek hacimli bir havuz (>65 μL) elde edeceğinden, havuzu konsantre etmek için temizlik gereklidir. dsDNA havuz temizleme ve konsantrasyonu DNA havuzuna 2,5x hacimli paramanyetik boncuk (Malzeme Masası)ekleyin ve ardından içeriği karıştırmak için tüpü hafifçe hareket ettirin. Tüpü RT’de 5 dakika boyunca rotatora yerleştirin. Peletin rahatsız olmamasına dikkat ederek 250 μL taze hazırlanmış% 70 etanol (çekirdeksiz suda) ekleyin. Etanol aspirat ve bir kez etanol yıkama tekrarlayın. İkinci aspirasyondan sonra, numuneyi 2000 x g’da aşağı çevirin ve mıknatısa geri yerleştirin. Pipet herhangi bir artık etanol kapalı ve numune yaklaşık 30 s için kurumaya izin verin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve peletin 60-70 μL çekirdeksiz suya yeniden harcayın. RT’de 2 dakika kuluçkaya yaslanın. Elute temizleninceye kadar numuneyi mıknatıs üzerinde pelet ve ardından elute’yi çıkarın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Konsantre havuzu bir florometre kullanarak ölçün ve ardından adaptör ligasyon adımına ilerlemek için bir aliquot hazırlayın: numunenin 700 ng’lik kısmını 65 μL son hacimde hazırlayın. İlk çalıştırma tamamlandıktan sonra ikinci bir çalıştırmanın tamamlanması için havuzun geri kalanını 4 °C’de tutun. Üreticinin talimatıyla adaptör ligasyonuna devam edin ve örneği akış hücresine yükleyin. Sıralama çalıştırmasını başlatın.NOT: Numune yüklemesinden önce akış hücresi astar bağlantı noktasından hava ve ~200 μL depolama tamponu aspirat. Bu, başarılı akış hücresi astarlama ve numune yükleme için kritik öneme sahiptir. Akış hücresinin astar bağlantı noktasından çözeltileri çizip biriktirirken bir p1000 pipet ve uç kullanın. Kitaplığı üreticinin talimatlarına göre sıralayın. Sıralama için işletim yazılımını açın ve Başlat’ı tıklatın. Deneme için bir ad girin, önerilen bir isimlendirme çalışma tarihini ve kullanıcı adını içerir. Kit Seçimine Devam Et ‘itıklatın, kullanılan uygun kitaplık hazırlık kitini ve barkod genişletme paketlerini seçin ve ardından Çalıştırmaya Devam Seçenekleri’ni tıklatın. İkinci bir çalışma için yeterli kitaplık hazırlamayı planlıyorsanız çalışma uzunluğunu 48 h’ye ayarlayın (aksi takdirde varsayılan olarak 72 saat bırakın). Basecalling’e Devam Et ‘itıklatın. Temel arama seçeneği Config: Fast Basecalling’i kontrol edin ve Barcoding’in Etkin olarak ayarlandığından emin olun, böylece çıkış FASTQ dosyaları barkod dizilerinden kırpılır ve barkoda dayalı ayrı dizinlere dönüştürülür. Çıktıya Devam ‘ıtıklatın. Çıktı sıralama verilerinin kaydedileceği yeri seçin. Yalnızca FASTQ çıkışını kaydediyorsa yaklaşık 30-50 Gb veri ve FAST5 çıkışını da kaydediyorsanız >500 Gb veri bekleyin. Süzme seçeneği Qscore: 7 | işaretini kaldırın Readlength: Bölüm 7.2’de açıklanan filtrelemeye devam etmeyi planlıyorsanız filtresiz, aksi takdirde işaretli bırakın ve Readlength’i 200 olarak ayarlayın. Kurulumu Çalıştırmaya Devam Et’i tıklatın ve tüm ayarları gözden geçirin. Ayarlar doğruysa, Başlat’a tıklayın, aksi takdirde Geri’ye tıklayın ve gerekli ayarlamaları yapın. İstenirse, akış hücresi üreticinin talimatlarına göre yıkanabilir ve kalan havuzla birlikte yeniden yüklenebilir. İlk çalıştırma tamamlandıktan ve akış hücresi yıkandıktan sonra kalan havuz için 6.2’deki adımları yineleyin.NOT: İkinci çalıştırmayı ayarlarken, bias voltajını daha önce 48 saatin üzerindeki çalıştırmalarda kullanılan akış hücreleri için üreticinin önerilerine göre -250 mV olarak ayarlayın. 7. Okumaların değerlendirilmesi ve hazırlanması NOT: Şekil 4 ‘te önerilen bir dizin yapısı gösterilmektedir. Aşağıdaki hesaplama adımlarına geçmeden önce Masaüstündebulunan dizinleri oluşturun, yani Long_Reads, Short_Reads ve Trimmed_Reads. Kısa okumalar (Şekil 3)NOT: Kısa okumalar FASTQ biçiminde oluşturulur. Dosyalar FASTQ başına en fazla 4000 okuma içerir. Bunlar genellikle fermuarlı (arşiv .gz) ve birden fazla dosya halinde düzenlenir. Platforma bağlı olarak, barkodlar genellikle kırpılır. Bazı programlar sıkıştırılmış biçimde dosyaları kabul ederken, diğerleri içe aktarmadan önce çıkarmalarını gerektirebilir. Okumalar, genom montajı sırasında veri doğruluğunu sağlamak için kalite kontrol (QC) adımlarını geçmelidir. CLC Genomics Workbench kullanılamıyorsa, Trimmomatic gibi kısa okumaları kırpmak ve QC kısa okumaları için alternatif programlar kullanılabilir25 veya Kırpma için Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) ve okuma kalitesini değerlendirmek için FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) kırpın. Okuma sayısının ortalama okuma uzunluğu ile çarpılması ve genom boyutuna bölünmesiyle tahmin edilen ortalama kısa okuma kapsamının 100x > olması önerilir.Genomics Workbench yazılımını (Malzeme Tablosu) açın ve tüm eşleştirilmiş uçlu kısa okuma FASTQ dosyalarını içe aktarın. Eşleştirilmiş dosyalar otomatik olarak oluşturulur. Üst araç çubuğundaki Yeni’yi tıklatıp Klasör’ü seçerek CLC_Data altında yeni bir klasör oluşturun … dosyaları depolamak için. Klasörü istediğiniz gibi adlandırın, önerilen bir kural örnek kimliği kullanıyor. Üst araç çubuğunda, İçe Aktar düğmesine tıklayın ve Illumina’yı seçin … Örneğe karşılık gelen tüm kısa okuma dosyalarına gidin ve seçin. Eşleştirilmiş okuma seçeneğinin seçili olduğundan emin olun ve Başarısız okumaları kaldır seçeneğinin işaretini kaldırın. İleri ‘yitıklatın, Kaydet ‘iseçin ve İleri’yi yeniden tıklatın. İçe aktarılan dosyaları önceki adımda oluşturulan yeni klasöre kaydetmeyi seçin ve Son ‘utıklatın. İzole etmek için tüm eşleştirilmiş dosyaların sıra listesini oluşturun; bu, analiz basitliği için okuma verilerini tek bir dosyada birleştirir. Üst araç çubuğunda, Yeni düğmesine tıklayın ve Sıra Listesi ‘niseçin … Soldaki dizin listesinde, birleştirilecek dosyaları seçin ve bunları sağdaki seçili dosyalar listesine taşımak için okları kullanın. İleri ‘yitıklatın, Kaydet ‘iseçin ve İleri’yi yeniden tıklatın. Sıra listesini kaydetmeyi seçin ve Son ‘utıklatın. Sıra listesi oluşturulduktan sonra, örnek kimlikle hemen yeniden adlandırın. Sıra listesinde Okumaları Sıralama için QC aracını çalıştırın: Bu yordam, kısa okuma ngs tarafından oluşturulan okumaların genel kalite parametrelerini değerlendirir. Araç kutusu menüsünde (sol alt pencere) Sıralama Okumaları için QC aracını arayın. Aracı çift tıklatın ve analiz edilecek sıra listesini seçin ve İleri’yi tıklatın. Tüm çıktı seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun ve Sonuç İşlemealtında Kaydet ‘i seçin. İleri ‘yi tıklatın ve çıktı dosyalarını kaydetmek için belirtin ve sonra Son ‘utıklatın. Sıra listesinde Okumaları Kırp aracını çalıştırın: Kırpma, kaliteye, uzunluğa ve belirsizliğe göre yapılır. Bu işlem, sıralamada kullanılan barkodların bu adımdan önce kırpıldığını varsayar. Araç kutusunda (sol alt pencere) Okumaları Kırp aracını arayın. OkumalarıKırp ‘ı çift tıklatın ve sonra analiz edilecek sıra listesini seçin ve İleri ‘yitıklatın. Kalite kırpma: kalite puanı sınırını 0,01 olarak ayarlayın ve belirsiz nükleotitleri 2’de bırakın. İleri ‘yitıklatın.NOT: Parametreler kullanıcının takdirine bağlı olarak ayarlanabilir; bunlar önerilen ayarlardır. Otomatik Okuma Bağdaştırıcısı Kırpma’nın işaretini kaldırın (bunu yalnızca bağdaştırıcılar CLC’ye almadan önce okumalardan kırpılmışsa yapın). İleri’ye tıklayın ve Uzunluğun Altındaki Okumaları At ‘ıkontrol edin, varsayılan 15’i kullanın. İleri ‘yitıklatın, Rapor Oluştur’u kontrol edin ve Kaydet ‘iseçin. İleri’yi tıklatın ve çıktı dosyalarının nereye kaydedileceğine ilişkin bir belirtin. Son ‘utıklatın. Kırpılmış sıra listesini dışa aktar: sonraki karma montaj ve analiz CLC dışında tamamlanacak ve kesilmiş kısa okuma dosyalarının dışa aktarılmasını gerektirir. Sol üstteki dizin gezintisinden, 7.1.4 adımında oluşturulan kırpılmış dosyayı seçin ve üst araç çubuğunda Dışarı Aktar’ı tıklatın. Dışa aktarma dosyası türü için Fastq’u seçin ve İleri ‘yitıklatın. Eşleştirilmiş Sıra Listesini İki Dosyaya Ver ‘i denetleyin. Ardından, İleri’yi tıklatın ve dosyaların Trimmed_Reads dizinini seçin. Son ‘utıklatın. Kırpılan kısa okuma dosyalarının .fastquzantılı iki dosya (R1 ve R2) olarak başarıyla dışa aktarıldığını sağlayın.NOT: Kırpılan sıra listesi, genellikle CLC tarafından R1 ve R2 olarak belirlenen iki dosyaya verilmelidir. Aşağı akış karma derlemesi, kısa okuma veri girişinin bu şekilde ayarılmasını gerektirdiği için bu kritik öneme sahiptir. Dışa aktarılan dosyaları yeniden adlandırın, lütfen dosya adlarında boşluk ve özel karakterler kullanmaktan kaçının. Basitlik için önerilen bir biçim trimmed_short_file. R1.fastq. Uzun (MinION) okur (Şekil 3)NOT: Karma montaj için Uzun (MinION) sıralama okumalarının hazırlanması için aşağıdaki işlem hattı, komut satırı tarafından yürütülen NanoFilt ve Nanostat programları26’yı kullanır. Devam etmeden önce araçları yükleyin ve bu komutları yürütmek için UNIX’in temellerini bilin. Varsayılan terminaller ve Bash Shell önerilir. Ortak terminal komutları ve kullanımı için bir ders kılavuzu Yazılım Marangozluk27’de bulunur. Aşağıdaki talimatlar, oluşturulan dosyaların barkod isimlendirmesi (NB01, NB02, vb.) ile adlandırılacağını ve Long_Reads dizinine kaydedildiğini varsayar. Alternatif olarak, sıralama çalıştırmasını ayarlarken MinKNOW kullanılarak okuma filtrelemesi gerçekleştirilebilir. Ortalama uzun okuma kapsamının >100x olması önerilir. Önerilen ortalama okuma uzunluğu >2000 bp’dir; bu nedenle, gereken uzun okuma sayısı kısa okuma sayısından daha düşüktür. Long_Reads dizininde çalıştırmada kullanılan her barkod (barkod01, barkod02 vb.) için yeni dizinler oluşturun (Şekil 4). Her barkoda karşılık gelen tüm .fastq dosyalarını uygun klasöre kopyalayın. Her çalıştırmadan her barkod için tüm .fastq dosyalarını birleştirin. Terminal’i açın ve cd komutunu kullanarak Long_Reads dizini içindeki barkod dizinlerine gidin: cd Desktop/Long_Reads/barcode01 Aşağıdaki komutu yürüterek barkod başına tüm .fastq dosyalarını tek bir .fastq dosyasında birleştirilmesi: cat *.fastq > NB01.fastqNOT: Bu komut, FASTQ dosyalarının her birinden gelen tüm okumaları NB01.fastq adlı tek bir büyük, tek FASTQ’da birleştirir. Aşağıdaki komutu yürüterek örneğin okuma kalitesini değerlendirmek için NanoStat’ı kullanın: NanoStat –fastq NB01.fastq Çıktıyı ileride başvurmak üzere bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin. NanoFilt komutunu çalıştırarak Q < 7 ve uzunluğu 200 ile okumaları < 7 Q ile filtrelemek için NanoFilt kullanın: NanoFilt -q 7 -l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz NanoStat –fastq NB01 _trimmed.fastq komutunu yürüterek 7.2.6 adımında oluşturulan kırpılmış dosyada NanoStat’ı çalıştırın.gz Çıktıyı bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin ve filtrelemenin başarılı olduğundan emin olmak için 7.2.4 adımındaki sonuçlarla karşılaştırın (Tablo 1). Sıralama çalıştırmasında kullanılan her barkod için 7.2.2 ile 7.2.8 adımlarını yineleyin.NOT: 7.2.6 adımında oluşturulan NB01_trimmed.fastq.gz dosyası karma montaj için kullanılacaktır. 8. Hibrit genom montajı oluşturma NOT: Aşağıdaki montaj ardışıkdüzeni,bölüm 7.1ve7.2’de (Şekil 3) hazırlanan kısa ve uzun okumaları birleştirmek için Unicycler 19 , 28 ,29,30’ukullanır. Unicycler ve bağımlılıklarını yükleyin ve aşağıdaki komutları çalıştırın. 7.1.5 adımında verilen kısa okuma dosyalarının trimmed_short_file olarak adlandırıldığı varsayılır. R1.fastq ve trimmed_short_file. Basitlik için R2.fastq. Kısa okunan dosyaları ve uzun süredir okunan dosyaları Trimmed_Reads adlı tek bir dizinde düzenleyin. Dizin aşağıdakileri içermelidir: Kırpılmış uzun okumalar için .fastq.gz dosyası (adım 7.2.6’da oluşturulur). Kırpılmış kısa okumalar için iki .fastq dosyası (R1 ve R2) (adım 7.1.5’te oluşturulur). Terminal’deki cd komutunu kullanarak okuma dosyalarını depolayan dizin Trimmed_Reads gidin: cd Masaüstü/Trimmed_Reads Doğru dizine girdikten sonra, aşağıdaki komutu yürüterek iki kısa okuma dosyasını .fastq.gz biçiminde olacak şekilde fermuarlayın: gzip trimmed_short_file. R1.fastq Hem R1 hem de R2 için 8.2 adımlarını yineleyin. Tüm okuma dosyalarının artık .fastq.gz biçiminde olup olmadığını denetleyin ve tüm dosyaların aynı yalıtmayla eşleştiğini doğrulayın. Aşağıdaki komutu çalıştırarak Unicycler kullanarak karma derlemeye başlayın:tek tekerlekli bisiklet -1 trimmed_short_file. R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file. R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directoryNOT: -o Unicycler çıktısının kaydedileceği dizini belirtir, Unicycler komut çalıştırıldıktan sonra bu dizini oluşturur; dizini önceden oluşturmayın. Çalışma süresi, kullanılan bilgisayarın hesaplama gücüne, genom boyutuna ve okuma sayısına göre değişir. Bu, 4 saat ila 1 veya 2 gün arasında sürebilir. Bu protokol, 250 Gb RAM’e sahip bir CentOS Linux 7 makinesinde, 2.5 GHz 12 pratik çekirdeğe ve 48 sanal çekirdeğe sahip Intel Xeon (R) CPU’da gerçekleştirildi. Alternatif olarak, 16 Gb RAM ve 2,6 GHz 6 çekirdekli işlemcilere sahip kişisel bilgisayarlar bu derlemeleri daha uzun bir işlem süresiyle hesaplayabilir. Çalıştırma tamamlandığında, hata olmadığından emin olmak için unicycler.log dosyasını gözden geçirin – oluşturulan contigs sayısını, boyutunu ve durumunu (tam, eksik) kaydedin. Tamamlanmamış contigs tanımlanırsa (Unicycler günlüğünde eksik olarak gösterilir), 8.4 adımında komuta aşağıdaki bayrağı ekleyerek Unicycler’ı kalın modda yeniden çalıştırın: –mode kalın.NOT: Kalın mod, montaj sırasında uzun okuma köprüleri için kabul edilen kalite eşiğini düşürür; bu tam bir montaj sağlayabilir, ancak montaj kalitesi azalabilir. Kalın modun yalnızca gerektiğinde ve contig birleştirmenin pcr tarafından daha sonra onaylanması için ön kanıt olarak kullanılması önerilir. 9. Montaj kalitesinin değerlendirilmesi NOT: Aşağıdaki protokol bandaj31 ve QUAST32,kullanmadan önce ayarlanılması gereken iki program kullanır (Şekil 2 ve Şekil 4). Bandaj indirildikten sonra kurulum gerektirmez ve QUAST temel komut satırı kullanımına aşinalık gerektirir. Ayrıca, Evrensel Tek KopyaLı Ortologları (BUSCO)33ile karşılaştırma kullanarak genom eksiksizliğinin değerlendirilmesi önerilir. Bandaj: Dosyayatıklayın. Ardından, Grafiği Yükle’yi seçin ve 8.4 adımında Unicycler tarafından oluşturulan unicycler_output_directory kaydedilen assembly.gfa dosyasını seçin. Yüklendikten sonra, sol araç çubuğundaki Grafik Çiz düğmesine tıklayın ve montajın tamamlanıp tamamlanıp düzenlenmediğini değerlendirmek için contigs’in (düğümler olarak adlandırılır) nasıl bağlandığı ve düzenlendiğine bakın (Şekil 5).NOT: Komple montajlar her iki uçta bağlı tek dairesel contigs ile temsil edilir (Şekil 5A,B). Tamamlanmamış derlemelerin birbirine bağlı birden çok contigs’i vardır veya doğrusaldır (Şekil 5C). Küçük doğrusal contigs, doğrusal ekstrakrozomal elementleri gösterebileceği için eksik olmayabilir. Derinlik olarak da adlandırılan kapsama alanı bandajla not edilecek ve Unicycler’de 1x’e normalleştirilen kromozom contigs’in göreceli bolluğunu temsil eder. QUAST Terminal içinde, cd komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin: cd Desktop/Trimmed_Reads/unicycler_output_directoryNOT: Derlemenin bulunduğu yolda boşluklara izin verilmez, diğer bir de değil, Unicycler çıktısına giden dizinlerin kendi adlarında boşluk olamaz. Alternatif olarak, kolay erişim için assembly.fasta dosyasını Masaüstü’ne kopyalayın. Quast komutunu çalıştırarak aşağıdaki komutu çalıştırın: quast assembly.fasta -o quast_output_directory QUAST tarafından çıktı dizininde oluşturulan raporları gözden geçirin quast_output_directory. 10. Genom ek açıklaması NOT: Aşağıdaki ek açıklama ardışık düzeni, kullanımdan önce yüklenmesi gereken bir komut satırı aracı olan Prokka34’ükullanır. Alternatif olarak, Prokka’yı otomatik GUI K-Base (Malzeme Tablosu) aracılığıyla kullanın veya rast35web sunucusu aracılığıyla genomlara açıklama ekleme . Genomları NCBI’ye yatırıyorsanız, Prokaryotik Genom Ek Açıklama Boru Hattı (PGAP)36kullanılarak otomatik olarak açıklama eklenecektir. Terminal içinde CD komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin (bkz. adım 9.2.1). Ardından, aşağıdaki komutu yürüterek Prokka’yı çalıştırın: prokka -önek sample_ID – assembly.fasta prokka_output_directory dandaha fazla NOT: –önek, belirtilen sample_ID göre tüm çıktı dosyalarını adlandırır. –outdir, tüm Prokka çıktı dosyalarının kaydedileceği belirtilen ada sahip bir çıktı dizini oluşturur; Önceden Prokka için bir çıkış dizini oluşturmayın. .tsv tablosunu açarak ve/veya ek açıklamaları görselleştirmek ve analiz etmek için oluşturulan .gff dosyasını bir sıra analiz yazılımına yükleyerek ek açıklamaları gözden geçirin (Şekil 6). İlgi çekici genetik faktörlere bağlı olarak belirli ek açıklamalar üretilebilir. Ön analiz için Genomik Epidemiyoloji Merkezi (www.genomicepidemiology.org/) web sunucusundaki kullanıcı dostu araçlarla başlamanız önerilir37 , 38,39,40,41. CRISPR-cas sistemlerinin ve profilaklarının tespiti için ek araçlar mevcuttur (Şekil 3)42,43. 11. Veri demokratikleştirme için önerilen uygulamalar Mümkün olduğunda, tüm ham okuma verilerini ve birleştirilmiş genomları NCBI Sequence Read Archive (SRA) ve Genbank gibi halka açık bir depoya yatırın. Genomlar, NCBI biriktirme işlemi sırasında PGAP işlem hattı üzerinden otomatik olarak açıklamalır.