Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

Les bactéries ont été cultivées à partir d’urine prélevée sur des femmes consentantes dans le cadre des études 19MR0011 (UTD) et STU 032016-006 (UTSW) approuvées par le comité d’examen institutionnel. 1. Culture d’urine améliorée modifiée REMARQUE: Toutes les étapes de culture doivent être effectuées dans des conditions stériles. Stérilisez tous les instruments, solutions et supports. Nettoyez la zone de travail avec de l’éthanol à 70%, puis installez un brûleur Bunsen et travaillez soigneusement près de la flamme pour réduire les risques de contamination. Alternativement, une armoire de biosécurité de classe II peut être utilisée pour maintenir un environnement stérile. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour éviter l’exposition à des microbes potentiellement pathogènes. Placage de l’urine stockée dans le glycérol et isolement des colonies Décongeler l’urine stockée de glycérol à température ambiante (RT). Une fois décongelé, vortex l’échantillon pendant 5 s pour mélanger. Dans des tubes stériles de microcentrifugation, préparer des dilutions 1:3 et 1:30 de l’urine dans une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à un volume final de 100 μL.REMARQUE: L’urine stockée dans le glycérol est préparée en mélangeant 500 μL d’urine non diluée et 500 μL de glycérol stérile à 50% dans des cryoviales et en stockant à -80 ° C. Préchauffer les plaques de gélose à 37 °C pendant 15 min avant utilisation. Veuillez consulter la figure 1 pour connaître les types de milieux et les conditions de culture adaptés aux genres bactériens urinaires courants. Bien mélanger l’urine diluée par pipetage avant le placage, plaquer 100 μL de l’urine diluée sur la plaque de gélose souhaitée et étaler l’échantillon à l’aide de billes de verre stériles. Plaque 100 μL du diluant PBS 1x sur une plaque séparée comme contrôle de croissance.REMARQUE : Si vous tentez de cultiver des espèces uropathogènes communes (p. ex., Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterococcus faecalis, etc.), il est recommandé d’utiliser une gélose chromogène (Tableau des matériaux) car elle permet d’identifier facilement les espèces bactériennes uropathogènes (Figure 1). L’acide nalidixique à la colistine (AIIC) ou la gélose MRS sont utiles pour isoler les espèces fastidieuses à Gram positif (p. ex., Lactobacillus spp.)de l’urine connue pour contenir des uropathogènes à Gram négatif, qui peuvent surpasser les espèces fastidieuses dans les géloses non sélectives. Incuber la plaque inversée dans les conditions atmosphériques souhaitées à 35 °C pendant une période de 24 h pour les uropathogènes et de 3 à 5 jours pour les bactéries fastidieuses (Figure 1). Après la période d’incubation, retirez les plaques de l’incubateur. Dans chaque plaque, choisissez les colonies qui présentent une couleur, une morphologie ou des motifs hémolytiques uniques. Re-streak la colonie bactérienne à l’aide d’une boucle stérile sur la gélose correspondante et incuber la plaque inversée pendant 2-5 jours dans l’atmosphère désirée pour obtenir des colonies bien isolées.REMARQUE: Si vous utilisez le BAP pour la culture primaire, le patching des colonies sur une gélose chromogène peut fournir des informations utiles sur l’hétérogénéité de la population bactérienne dans l’échantillon. Culture dans un bouillon liquide et des isolats bactériens de glycérol Une fois que les colonies isolées qui correspondent à la morphologie de la colonie parente sont obtenues, choisissez une seule colonie et inoculez dans 3 mL de bouillon liquide à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile. Reportez-vous à la figure 1 pour le bouillon capable de soutenir la croissance des genres communs de microbiote urinaire. Scellez les plaques d’agar avec un parafilm et conservez-les à 4 °C pendant 2 à 4 jours. Incuber des cultures liquides dans les conditions atmosphériques souhaitées pendant 1 à 5 jours jusqu’à ce que la culture soit visiblement trouble. Une fois la croissance observée, vortex la culture, puis ajouter 1 mL de la culture pendant la nuit à 500 μL de glycérol stérile à 50% dans un cryovial de 2 mL; sceller et mélanger doucement par inversion. Préparez deux stocks de glycérol pour chaque colonie (l’un sert de sauvegarde) et conservez-les à -80 °C. 2. Identification des espèces bactériennes par séquençage du gène Sanger de l’ARNr 16S REMARQUE: L’identité microbienne peut également être confirmée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF)20. Réaction en chaîne colonie-polymérase (PCR) Préparer 25 μL de la réaction pcR dans des tubes PCR en ajoutant 12,5 μL de 2x Taq Polymerase Master Mix, 0,5 μL de 10 μM 8F primer, 0,5 μL de 10 μM 1492R primer(Table des matériaux),et 11,5 μL d’eau sans nucléase21.REMARQUE: Si vous effectuez une PCR pour plusieurs échantillons, faites un mélange maître de réaction de mélange de Taq Polymerase, d’amorces et d’eau stérile sans nucléase. Ensuite, aliquote 25 μL dans chaque tube PCR. Pour effectuer la PCR de la colonie, faites glisser une colonie bien isolée de la nouvelle stries à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette. Remettre la colonie en suspension dans le mélange réactionnel PCR préparé à l’étape 2.1.1. Mélanger doucement. Recueillir le liquide au fond du tube par un spin rapide à 2000 x g.REMARQUE: Assurez-vous que l’échantillon est exempt de bulles d’air. Inclure un échantillon de contrôle sans gabarit (NTC) contenant uniquement le mélange de réactions PCR. Placez les tubes d’échantillonnage dans le thermocycleur et exécutez le programme suivant: 95 °C pendant 3 min; 40 cycles de: 95 °C pendant 30 s, 51 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min 30 s; 72 °C pendant 10 min; maintenir à 10 °C. Extraction de gel et identification des espèces À la fin de l’exécution de la PCR, vérifiez le produit PCR sur un gel d’agarose à 1% préparé dans un tampon 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE). Avant de couler le gel, ajouter le bromure d’éthidium (EtBr). Ensuite, coulez le gel à l’aide de peignes pour les puits qui contiennent au moins 20 μL de volume d’échantillon.ATTENTION : L’EtBr est un agent intercalant suspecté d’être cancérigène. Portez toujours des gants et de l’EPI lorsque vous les manipulez et éliminez les matériaux contenant de l’EtBr conformément aux directives de l’établissement. Lorsque le gel est réglé, placez-le dans le réservoir d’électrophorèse rempli de tampon TBE 0,5x et retirez le peigne. Chargez l’échelle de 1 kb dans le premier puits et 10-20 μL de la réaction PCR dans les puits suivants. Exécuter à 100-140 V jusqu’à ce qu’il soit résolu. Visualisez le gel sous la lumière UV et confirmez la présence d’une bande clairement définie à ~ 1,5 kb qui est absente dans le puits NTC.ATTENTION: Les rayons UV sont nocifs pour la peau et les yeux, utilisez un protecteur approprié lorsque vous visualisez le gel et portez un EPI approprié.REMARQUE: La PCR des colonies peut échouer pour certaines bactéries; procéder à la PCR à partir d’ADNg isolé est une autre option22. Retirez les bandes d’environ 1,5 kb à l’aide d’un rasoir et transférez les boutures de gel dans des tubes de microcentrifugation propres. Procéder au protocole d’extraction du gel conformément aux instructions du fabricant (Table des matériaux). Mesurer la concentration de l’ADN purifié par spectrophotomètre à microvolume.REMARQUE: Une concentration >10 ng / μL est souhaitable et A260/280 entre 1,7 et 2,0 est acceptable. Préparez deux réactions de séquençage de Sanger pour chaque échantillon, l’une en utilisant le 8F et l’autre en utilisant l’amorce 1492R dans de l’eau sans nucléase selon les directives de tout service de séquençage Sanger choisi. Une fois les données de séquençage reçues, téléchargez les séquences d’ADN sur le site Web BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) du NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), choisissez Nucleotide BLAST (blastn), sélectionnez la base de données d’ARNr/ ITS 16S séquences d’ARN ribosomique (bactéries et archées) et exécutez le programme Megablast. L’isolat peut être identifié par la réponse de la plus haute qualité à une référence de la base de données.REMARQUE: Certaines espèces bactériennes présentent une identité élevée dans leurs séquences d’ARNr 16S et peuvent être impossibles à distinguer par cette seule méthode. La spéciation nécessitera une homologie de l’ADN et des analyses biochimiques pour distinguer en toute confiance les membres du même genre23. 3. Extraction de l’ADN génomique (ADNg) REMARQUE: Cette section utilise des réactifs et des colonnes de spin fournis dans le kit d’extraction d’ADNg référencé dans la Table des matériaux pour l’extraction à haut rendement d’ADN génomique de qualité de diverses espèces bactériennes. Vous trouverez ci-dessous les modifications et instructions recommandées. Préparez les réactifs en kit selon les instructions du fabricant. Préparer des cultures de 3 à 10 mL dans un bouillon stérile approprié(figure 1)en inoculant des bactéries provenant de colonies bien isolées dans le milieu et en incubant à la température et à la pression atmosphérique indiquées à la figure 1 jusqu’à ce qu’une croissance suffisante soit observée. Après incubation, mesurer la densité optique à 600 nm (OD600)de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre24. Préparer l’échantillon pour la quantification en diluant les cultures pendant la nuit dans un rapport de 1:10. Incluez également un blanc du milieu de culture stérile pour la mesure. Calculer la densité optique en soustrayant la lecture à blanc de la lecture de l’échantillon et en multipliant par le facteur de dilution de dix. À l’aide de la mesure de l’OD600 et d’un rapport OD600 /ML préétabli pour l’espèce, calculez combien de millilitres de culture sont nécessaires pour obtenir 2 x 109 cellules. Centrifugez le volume de culture requis pendant 5 min à 5000 x g pour granuler. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un tampon TE froid de 200 μL (pré-refroidir sur la glace au début de la procédure). Centrifuger l’échantillon pendant 2 min à 5000 x g. Retirez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille dans 180 μL de tampon de lyse enzymatique (ELB) et ajoutez 20 μL de RNase A pré-bouillie (10 mg/mL). Pour une lyse efficace des bactéries à Gram positif, ajouter 18 μL de mutanolysine (25 kU/mL). Bien vortex, puis incuber les échantillons à 37 °C sur rotateur pendant 2 h.REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser l’ELB décrit dans le protocole du fabricant pour les bactéries Gram positif et Gram négatif. Procédez conformément aux instructions du fabricant.REMARQUE: Répétez les étapes d’élution une ou deux fois de plus pour obtenir un rendement supplémentaire en ADNg, si vous le souhaitez. Évaluer la qualité de l’ADNg extrait comme indiqué à la rubrique 4 et stocker l’ADNg à 4 °C s’il est utilisé dans un délai de 1 semaine. Alternativement, conservez l’ADNg à -20 °C pour un stockage à long terme. 4. Évaluation de la qualité de l’ADNg extrait Pour évaluer la qualité par électrophorèse sur gel, préparer un gel d’agarose à 1 % tel que décrit à la sous-section 2.2. Préparez l’échantillon dans un tube propre : mélanger 1-2 μL d’ADNg extrait et 3 μL de colorant de chargement 2x sur parafilm. Exécutez le gel une fois chargé, puis visualisez-le sous la lumière UV.REMARQUE: L’extraction réussie de l’ADNg sera évidente par une bande discrète au sommet du gel et un frottis minimal(Figure 2A). Le frottis est révélateur d’un cisaillement. Si aucune bande d’ADNg n’est évidente et/ou si le frottis est important, répétez l’extraction de l’ADNg. Envisagez de réduire les temps d’incubation dans la RNase A et la protéinase K. Si deux bandes autour de 1,5-3 kb sont observées, cela suggère une contamination par l’ARN(Figure 2B). Préparer la RNase A fraîche et répéter l’extraction. Pour évaluer la qualité par spectrophotomètre à microvolume, mesurer la concentration d’ADNg et le rapport d’absorbance A260/280 par spectrophotomètre à microvolume. Des concentrations >50 ng/μL et A260/280 comprises entre 1,7 et 2,0 sont acceptables.REMARQUE: Un faible rendement en ADNg peut être dû à un faible apport, un apport élevé, une contamination des nucléases, une lyse insuffisante. Les rapports d’absorbance supérieurs à la plage indiquent une contamination par l’ARN. Répétez l’extraction si la qualité de l’ADNg est médiocre. Pour évaluer la qualité par fluoromètre, suivez les instructions du fabricant pour quantifier la concentration d’ADNg à l’aide d’un kit de dosage haute sensibilité et d’un instrument fluoromètre(Table des matériaux). Une concentration >50 ng/μL est souhaitable. 5. Séquençage à lecture courte de nouvelle génération jumelé et préparation de la bibliothèque REMARQUE: Le séquençage à lecture courte peut être effectué sur divers instruments à des longueurs et des orientations de lecture distinctes. Le séquençage par paires de 150 pb (cycle 300 cycles) est recommandé pour les WGS bactériens. La préparation et le séquençage des bibliothèques peuvent être sous-traités à des installations de base ou à des laboratoires commerciaux. Préparer la bibliothèque de séquençage selon les instructions du fabricant (Table des matériaux). Suivre la concentration finale recommandée par le fabricant dans la bibliothèque de chargement; toutefois, une modification recommandée consiste à charger la bibliothèque groupée à 1,8 pM pour une génération de lecture optimale sur les instruments NextSeq. Bien que facultatif, utilisez un bioanalyseur(Table des matériaux)pour évaluer la distribution des fragments de bibliothèque regroupés et vous assurer que la taille du fragment est de 600 pb en moyenne. 6. Préparation de la bibliothèque de séquençage Nanopore MinION Préparer la bibliothèque de séquençage selon le protocole du fabricant (Table des matériaux). L’utilisation de deux kits d’extension de codes-barres permet de multiplexer jusqu’à 24 échantillons sur une seule cellule de flux. Il est recommandé d’effectuer la préparation de la bibliothèque en deux parties, 12 échantillons à la fois lors du multiplexage de 24 échantillons. Les 24 échantillons peuvent être regroupés comme décrit ci-dessous.REMARQUE: Les échantillons peuvent être stockés à 4 ° C pendant la nuit à la fin de la ligature de code-barres natif – cela fournit un point d’arrêt dans le protocole, si nécessaire. À la fin de la section de ligature de code-barres natif du protocole de préparation de la bibliothèque, il est recommandé de regrouper les quantités équimolaires de chaque échantillon jusqu’à la masse maximale d’ADN (ng) possible. Pour ce faire, quantifiez tous les échantillons suivant la ligature de codes-barres à l’aide d’un fluoromètre(Table des matériaux)selon les instructions du fabricant. Estimez le volume de l’échantillon avec la concentration d’ADNds la plus faible, puis calculez l’ADNds total trouvé dans cet échantillon. Utilisez ce nombre pour déterminer les quantités équimolaires de tous les autres échantillons qui seront regroupés.REMARQUE: Étant donné que le calcul équimolaire maximisera la quantité d’ADNds mis en commun et produira ainsi un pool à volume élevé (>65 μL), un nettoyage est nécessaire pour concentrer le pool. Nettoyage et concentration de la piscine dsDNA Ajouter 2,5x volume de perles paramagnétiques (Table des matériaux) au pool d’ADN, puis faire glisser doucement le tube pour mélanger le contenu. Placez le tube dans le rotateur pendant 5 min à RT. Faites tourner l’échantillon à 2000 x g et pastillez sur un aimant. Ajouter 250 μL d’éthanol fraîchement préparé à 70% (dans de l’eau sans nucléase), en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Aspirer l’éthanol et répéter le lavage à l’éthanol une fois. Après la deuxième aspiration, faites tourner l’échantillon à 2000 x g et replacez-le sur l’aimant. Pipettez tout éthanol résiduel et laissez l’échantillon sécher pendant environ 30 s. Retirez le tube de l’aimant et remettez la pastille dans 60 à 70 μL d’eau sans nucléase. Incuber à RT pendant 2 min. Abreuver l’échantillon sur l’aimant jusqu’à ce que l’élute soit clair, puis retirez l’éluat et transférez-le dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL. Quantifiez la piscine concentrée à l’aide d’un fluoromètre, puis préparez une aliquote pour passer à l’étape de ligature de l’adaptateur : préparer 700 ng de l’échantillon dans un volume final de 65 μL. Conservez le reste de la piscine à 4 °C pour une deuxième course à terminer une fois la première course terminée. Procédez à la ligature de l’adaptateur selon les instructions du fabricant et chargez l’échantillon sur la cellule d’écoulement. Démarrez l’exécution du séquençage.REMARQUE: Aspirer de l’air et environ 200 μL de tampon de stockage à partir du port d’amorçage de la cellule d’écoulement avant le chargement de l’échantillon. Ceci est essentiel pour le succès de l’amorçage de la cellule d’écoulement et du chargement de l’échantillon. Utilisez une pipette p1000 et des embouts lorsque vous dessinez et déposez des solutions à travers le port d’amorçage de la cellule d’écoulement. Séquencez la bibliothèque selon les instructions du fabricant. Ouvrez le logiciel d’exploitation pour le séquençage et cliquez sur Démarrer. Entrez un nom pour l’expérience, une nomenclature recommandée inclut la date d’exécution et le nom de l’utilisateur. Cliquez sur Continuer à la sélection du kit, sélectionnez le kit de préparation de bibliothèque approprié et le ou les packs d’extension de code-barres utilisés, puis cliquez sur Continuer à exécuter les options. Ajustez la durée de l’exécution à 48 h si vous prévoyez de préparer suffisamment de bibliothèque pour une deuxième exécution (sinon, laissez par défaut 72 h). Cliquez sur Continuer vers Basecalling. Cochez l’option d’appel de base Config: Fast Basecalling et assurez-vous que Le codage à barres est défini sur Activé afin que les fichiers FASTQ de sortie soient coupés des séquences de codes à barres et démultiplexés dans des répertoires distincts en fonction du code-barres. Cliquez sur Continuer jusqu’à la sortie. Choisissez où enregistrer les données de séquençage de sortie. Attendez-vous à environ 30 à 50 Go de données si vous enregistrez uniquement la sortie FASTQ et >500 Go de données si vous enregistrez également la sortie FAST5. Décochez l’option de filtrage Qscore: 7 | Readlength : Non filtré si vous prévoyez de procéder au filtrage décrit à la section 7.2, sinon laissez la case cochée et ajustez Readlength à 200. Cliquez sur Continuer pour exécuter le programme d’installation et passez en revue tous les paramètres. Si les paramètres sont corrects, cliquez sur Démarrer, sinon cliquez sur Retour et effectuez les ajustements nécessaires. Si vous le souhaitez, la cellule d’écoulement peut être lavée selon les instructions du fabricant et rechargée avec la piscine restante. Répétez les étapes de la section 6.2 pour le pool restant une fois la première exécution terminée et la cellule d’écoulement lavée.REMARQUE: Lors de la configuration de la deuxième série, ajustez la tension de polarisation à -250 mV conformément aux recommandations du fabricant pour les cellules d’écoulement précédemment utilisées dans les séries de plus de 48 h. 7. Évaluation et préparation des lectures Remarque : Une structure de répertoire recommandée est illustrée à la figure 4. Créez les répertoires trouvés dans le Bureau, à savoir, Long_Reads, Short_Reads et Trimmed_Reads, avant de procéder aux étapes de calcul ci-dessous. Lectures courtes (Graphique 3)REMARQUE: Les lectures courtes sont générées au format FASTQ. Les fichiers contiennent 4000 lectures maximum par FASTQ. Ceux-ci sont souvent compressés (.gz archive) et organisés en plusieurs fichiers. Selon la plate-forme, les codes-barres sont généralement coupés. Certains programmes acceptent les fichiers au format compressé, d’autres peuvent nécessiter leur extraction avant l’importation. Les lectures doivent passer les étapes de contrôle de la qualité (CQ) pour assurer l’exactitude des données lors de l’assemblage du génome. Si CLC Genomics Workbench n’est pas disponible, d’autres programmes peuvent être utilisés pour couper et QC les lectures courtes telles que Trimmomatic25 ou Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) pour le rognage et FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) pour évaluer la qualité de lecture. Il est recommandé de multiplier par >100x la couverture moyenne des lectures courtes, estimée en multipliant le nombre de lectures par la longueur moyenne des lectures et en divisant par la taille du génome.Ouvrez le logiciel Genomics Workbench (Table of Materials) et importez tous les fichiers FASTQ à lecture courte appariés. Les fichiers jumelés seront générés automatiquement. Créez un nouveau dossier sous CLC_Data en cliquant sur nouveau dans la barre d’outils supérieure et en sélectionnant Dossier… pour stocker les fichiers. Nommez le dossier comme vous le souhaitez, une convention recommandée utilise l’exemple d’ID. Enregistrez toutes les sorties des étapes suivantes dans ce dossier. Dans la barre d’outils supérieure, cliquez sur le bouton Importer et sélectionnez Illumina… Accédez à tous les fichiers à lecture courte qui correspondent à l’exemple et sélectionnez-les. Assurez-vous que l’option lectures appariées est sélectionnée et décochez l’option Supprimer les lectures ayant échoué. Cliquez sur Suivant, sélectionnez Enregistrer, puis cliquez à nouveau sur Suivant. Choisissez d’enregistrer les fichiers importés dans le nouveau dossier créé à l’étape précédente et cliquez sur Terminer. Créez une liste de séquences de tous les fichiers appariés pour l’isolat ; cela concaténera les données lues dans un seul fichier pour simplifier l’analyse. Dans la barre d’outils supérieure, cliquez sur le bouton Nouveau et sélectionnez Liste des séquences… Dans la liste des répertoires à gauche, sélectionnez les fichiers à concaténer et utilisez les flèches pour les déplacer dans la liste des fichiers sélectionnés à droite. Cliquez sur Suivant, sélectionnez Enregistrer, puis cliquez à nouveau sur Suivant. Choisissez d’enregistrer la liste des séquences et cliquez sur Terminer. Une fois la liste de séquences générée, renommez-la immédiatement avec l’ID d’exemple. Exécutez l’outil QC pour les lectures de séquençage sur la liste des séquences : cette procédure évaluera les paramètres de qualité globaux des lectures générées par les NGS à lecture courte. Recherchez l’outil QC pour les lectures de séquençage dans le menu de la boîte à outils (fenêtre en bas à gauche). Double-cliquez sur l’outil, puis choisissez la liste des séquences à analyser et cliquez sur Suivant. Assurez-vous que toutes les options de sortie sont cochées et choisissez Enregistrer sous Gestion des résultats. Cliquez sur Suivant et spécifiez pour enregistrer les fichiers de sortie, puis cliquez sur Terminer. Exécutez l’outil Ajuster les lectures dans la liste des séquences : le rognage sera effectué en fonction de la qualité, de la longueur et de l’ambiguïté. Ce processus suppose que les codes-barres utilisés dans le séquençage ont été coupés avant cette étape. Recherchez l’outil Ajuster les lectures dans la boîte à outils (fenêtre en bas à gauche). Double-cliquez sur Trim Reads, puis choisissez la liste des séquences à analyser et cliquez sur Suivant. Découpage de qualité: définissez la limite de score de qualité à 0,01 et laissez les nucléotides ambigus à 2. Cliquez sur Suivant.REMARQUE: Les paramètres peuvent être ajustés à la discrétion de l’utilisateur; ce sont les paramètres recommandés. Décochez la case Découpage automatique de l’adaptateur en lecture (ne le faites que si les adaptateurs ont été coupés des lectures avant l’importation dans CLC). Cliquez sur Suivant et cochez Ignorer les lectures ci-dessous la longueur,utilisez la valeur par défaut 15. Cliquez sur Suivant, cochez Créer un rapport, puis choisissez Enregistrer. Cliquez sur Suivant et spécifiez où enregistrer les fichiers de sortie. Cliquez sur Terminer. Exporter la liste des séquences découpées : l’assemblage et l’analyse hybrides suivants seront effectués en dehors de CLC et nécessitent l’exportation des fichiers à lecture courte découpés. Dans la navigation dans le répertoire en haut à gauche, choisissez le fichier découpé généré à l’étape 7.1.4, puis cliquez sur Exporter dans la barre d’outils supérieure. Sélectionnez Fastq pour le type de fichier d’exportation et cliquez sur Suivant. Cochez exporter la liste des séquences jumelées vers deux fichiers. Ensuite, cliquez sur Suivant et choisissez le répertoire Trimmed_Reads vers lequel exporter les fichiers. Cliquez sur Terminer. Assurez-vous que les fichiers à lecture courte découpés ont été exportés avec succès en tant que deux fichiers (R1 et R2) avec l’extension .fastq.REMARQUE : La liste des séquences découpées doit être exportée dans deux fichiers, généralement désignés par CLC comme R1 et R2. Ceci est essentiel car l’assemblage hybride en aval nécessite une entrée de données à lecture courte pour être configurée en tant que telle. Renommez les fichiers exportés, veuillez vous abstenir d’utiliser des espaces et des caractères spéciaux dans les noms de fichiers. Pour plus de simplicité, un format recommandé est trimmed_short_file. R1.fastq. Lecture longue (MinION) (Figure 3)REMARQUE: Le pipeline suivant pour la préparation des lectures de séquençage Long (MinION) pour l’assemblage hybride utilise les programmes NanoFilt et Nanostat26 exécutés par la ligne de commande. Installez les outils avant de continuer et familiarisez-vous avec les bases d’UNIX afin d’exécuter ces commandes. Les terminaux par défaut et Bash Shell sont recommandés. Un guide de leçon pour les commandes et l’utilisation courantes des terminaux se trouve à Software Carpentry27. Les instructions ci-dessous supposent que les fichiers générés seront nommés avec la nomenclature des codes-barres (NB01, NB02, etc.) et sont enregistrés dans le répertoire Long_Reads. Alternativement, le filtrage en lecture peut être effectué à l’aide de MinKNOW lors de la configuration de l’exécution de séquençage. Il est recommandé que la couverture moyenne en lecture longue soit de >100x. La longueur moyenne de lecture recommandée est de >2000 pb; par conséquent, le nombre de lectures longues nécessaires est inférieur au nombre de lectures courtes. Créez de nouveaux répertoires pour chaque code-barres utilisé dans l’exécution (code-barres01, code-barres02, etc.) dans le répertoire Long_Reads(Figure 4). Copiez tous les fichiers .fastq qui correspondent à chaque code-barres dans le dossier approprié. Combinez tous les fichiers .fastq pour chaque code-barres de chaque exécution. Ouvrez Terminal et accédez aux répertoires de codes à barres dans le répertoire Long_Reads à l’aide de la commande cd : cd Desktop/Long_Reads/barcode01 Concaténez tous les fichiers .fastq par code-barres en un seul fichier .fastq en exécutant la commande suivante : cat *.fastq > NB01.fastqREMARQUE : Cette commande combine toutes les lectures de chacun des fichiers FASTQ en un seul FASTQ volumineux nommé NB01.fastq. Utilisez NanoStat pour évaluer la qualité de lecture de l’échantillon en exécutant la commande suivante : NanoStat –fastq NB01.fastq Enregistrez les résultats en copiant la sortie dans un fichier texte ou Word pour référence ultérieure. Utilisez NanoFilt pour filtrer les lectures MinION en rejetant les lectures avec Q < 7 et la longueur < 200 en exécutant la commande: NanoFilt -q 7 -l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz Exécutez NanoStat sur le fichier découpé généré à l’étape 7.2.6 en exécutant la commande: NanoStat –fastq NB01 _trimmed.fastq.gz Enregistrez les résultats en copiant la sortie dans un fichier texte ou Word et comparez-les aux résultats de l’étape 7.2.4 pour vous assurer que le filtrage a réussi (Tableau 1). Répétez les étapes 7.2.2 à 7.2.8 pour chaque code-barres utilisé dans l’exécution du séquençage.Remarque : Le fichier NB01_trimmed.fastq.gz généré à l’étape 7.2.6 sera utilisé pour l’assemblage hybride. 8. Génération d’un assemblage de génome hybride REMARQUE : Le pipeline d’assemblage suivant utilise Unicycler19,28,29,30 pour combiner des lectures courtes et longues préparées dans les sections 7.1 et 7.2 ( Figure3). Installez Unicycler et ses dépendances et exécutez les commandes ci-dessous. Les fichiers à lecture courte exportés à l’étape 7.1.5 sont supposés être nommés trimmed_short_file. R1.fastq et trimmed_short_file. R2.fastq pour plus de simplicité. Organisez les fichiers à lecture courte et les fichiers à lecture longue dans un répertoire unique nommé Trimmed_Reads. Le répertoire doit contenir les éléments suivants : Un fichier .fastq.gz pour les lectures longues découpées (généré à l’étape 7.2.6). Deux fichiers .fastq (R1 et R2) pour les lectures courtes découpées (générés à l’étape 7.1.5). Accédez au répertoire Trimmed_Reads qui stocke les fichiers lus à l’aide de la commande cd dans Terminal : cd Desktop/Trimmed_Reads Une fois dans le bon répertoire, compressez les deux fichiers à lecture courte afin qu’ils soient également au format .fastq.gz en exécutant la commande suivante: gzip trimmed_short_file. R1.fastq Répétez l’étape 8.2 pour R1 et R2. Vérifiez que tous les fichiers lus sont maintenant au format .fastq.gz et vérifiez que tous les fichiers correspondent au même isolat. Commencez l’assemblage hybride à l’aide d’Unicycler en exécutant la commande suivante :monocycle -1 trimmed_short_file. R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file. R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directoryREMARQUE: -o spécifie le répertoire dans lequel la sortie Unicycler sera enregistrée, Unicycler créera ce répertoire une fois la commande exécutée; ne générez pas le répertoire au préalable. Le temps d’exécution varie en fonction de la puissance de calcul de l’ordinateur utilisé ainsi que de la taille du génome et du nombre de lectures. Cela peut prendre de 4 h à 1 ou 2 jours. Ce protocole a été réalisé sur une machine CentOS Linux 7 avec 250 Gb de RAM, processeur Intel Xeon (R) avec 2,5 GHz 12 cœurs pratiques et 48 cœurs virtuels. Alternativement, les ordinateurs personnels avec 16 Gb de RAM et 2,6 GHz processeurs 6 cœurs peuvent calculer ces assemblages à un temps de traitement plus long. Une fois l’exécution terminée, examinez le fichier unicycler.log pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreurs – enregistrez le nombre, la taille et l’état (complet, incomplet) des contigs générés. Si des contigs incomplets sont identifiés (notés comme incomplets dans le journal Unicycler), réexécutez Unicycler en mode gras en ajoutant l’indicateur suivant à la commande à l’étape 8.4 : –mode gras.REMARQUE: Le mode gras abaissera le seuil de qualité accepté pour les ponts à lecture longue pendant l’assemblage; cela peut donner un assemblage complet, mais la qualité de l’assemblage peut être diminuée. Il est recommandé d’utiliser le mode gras uniquement lorsque cela est nécessaire et comme preuve préliminaire de l’assemblage contig à confirmer ultérieurement par PCR. 9. Évaluation de la qualité de l’assemblage REMARQUE : Le protocole suivant utilise Bandage31 et QUAST32, deux programmes qui doivent être configurés avant utilisation (Figure 2 et Figure 4). Bandage ne nécessite pas d’installation une fois téléchargé et QUAST nécessite une connaissance de l’utilisation de base de la ligne de commande. Il est également recommandé d’évaluer l’exhaustivité du génome à l’aide de l’analyse comparative des orthologues universels à copie unique (BUSCO)33. Bandage : Cliquez sur Fichier. Ensuite, choisissez Load Graph et sélectionnez le fichier assembly.gfa qui a été enregistré dans unicycler_output_directory généré par Unicycler à l’étape 8.4. Une fois chargé, cliquez sur le bouton Dessiner le graphique dans la barre d’outils de gauche et regardez comment les contigs (appelés nœuds) sont connectés et organisés pour évaluer si l’assemblage est complet (Figure 5).REMARQUE: Les assemblages complets sont représentés par des contigs circulaires simples liés aux deux extrémités (Figure 5A, B). Les assemblages incomplets ont plusieurs contigs liés entre eux ou sont linéaires(Figure 5C). Les petits contigs linéaires peuvent ne pas être incomplets car ils peuvent indiquer des éléments extrachromosomiques linéaires. La couverture, également appelée profondeur, sera notée en bandage et représente l’abondance relative des contigs au chromosome, normalisés dans Unicycler à 1x. QUAST Dans le terminal, accédez au dossier qui stocke la sortie Unicycler à l’aide de la commande cd : cd Desktop/Trimmed_Reads/unicycler_output_directoryREMARQUE : Les espaces ne sont pas autorisés dans le chemin d’accès à l’emplacement de l’assemblage, c’est-à-dire qu’aucun répertoire menant à la sortie Unicycler ne peut avoir d’espaces dans son nom. Vous pouvez également copier le fichier assembly.fasta sur le Bureau pour y accéder facilement. Exécutez QUAST en exécutant la commande suivante : quast assembly.fasta -o quast_output_directory Passez en revue les rapports générés par QUAST dans le répertoire de sortie quast_output_directory. 10. Annotation du génome REMARQUE: Le pipeline d’annotation ci-dessous utilise Prokka34, un outil de ligne de commande qui doit être installé avant utilisation. Alternativement, utilisez Prokka via l’interface graphique automatisée K-Base(Table des matériaux)ou annotez les génomes via le serveur Web RAST35. Si vous déposez des génomes dans ncBI, ils seront automatiquement annotés à l’aide du pipeline d’annotation du génome procaryote (PGAP)36. Naviguez dans le terminal jusqu’au dossier qui stocke la sortie Unicycler à l’aide de la commande cd (voir étape 9.2.1). Ensuite, exécutez Prokka en exécutant la commande suivante : prokka –prefix sample_ID –outdir prokka_output_directory assembly.fastaREMARQUE: –prefix nommera tous les fichiers de sortie en fonction de la sample_ID spécifiée. –outdir créera un répertoire de sortie avec le nom spécifié où tous les fichiers de sortie Prokka seront enregistrés; ne créez pas de répertoire de sortie pour Prokka au préalable. Passez en revue les annotations en ouvrant la table .tsv et/ou en téléchargeant le fichier .gff généré dans un logiciel d’analyse de séquence pour visualiser et analyser les annotations (Figure 6). Des types spécifiques d’annotations peuvent être générés en fonction de facteurs génétiques d’intérêt. Il est recommandé de commencer par les outils conviviaux sur le serveur Web du Center for Genomic Epidemiology (www.genomicepidemiology.org/) pourl’analysepréliminaire37,38,39,40,41. Des outils supplémentaires pour la détection des systèmes CRISPR-cas et des prophages sont disponibles (Figure 3)42,43. 11. Pratiques suggérées pour la démocratisation des données Dans la mesure du possible, déposez toutes les données de lecture brutes ainsi que les génomes assemblés dans un référentiel public tel que NCBI Sequence Read Archive (SRA) et Genbank. Les génomes sont automatiquement annotés via le pipeline PGAP pendant le processus de dépôt NCBI.