高スループット設定で評価される食物媒介病原体のバイオコントロールに対するバクテリオファージの有効性

1. 緩衝液および試薬の調製 トリプティック大豆ブロス(TSB)(TSBパウダー15g、超純水500mL)とオートクレーブを500mLにします。注:これは、最大3ヶ月間室温で、または最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。 トリプティック大豆寒天(TSA)(TSAパウダー20g、超純水500mL)とオートクレーブを500mLにします。注:これは、最大3ヶ月間4°Cで保存することができます。 リン酸緩衝生理食塩水500mL(PBS;NaClの4g、KClの0.1g、Na2HPO4の0.77g、KH2PO4の0.12g、超純水500mL)を測定し、25°Cで0.2±7.2に調整し、オートクレーブを調整します。注:これは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。 1 M MgSO4 (49.294 g と 200 mL の超純水) を 200 mL にし、0.22 μm のポリエーテルサルホンフィルターで滅菌します。 10 mM MgSO4 (mTSB; 15 g の TSB 粉末、 500 mL の超純水、および 1 M MgSO4 の 5 mL) とオートクレーブを使用して、TSB の 500 mL を作ります。オートクレーブされたメディアを室温まで冷やします。無菌技術を適用します。血清学的ピペットを使用して、慎重に1 M MgSO4の5.0 mLを転送します。そっとぐるぐる回して混ぜます。 2. 細菌培養の準備 細菌研究所培養(BRLC)を準備するには、冷凍庫の在庫からグリセロールストックバイアルを取り除き、実験室に移します。 使い捨て接種ループまたは同等のものを使用し、バイアルに浸し、接種物(凍結スラッシュ)のスクレーピングを取り除き、TSAプレートまたはレベルII生物学的安全キャビネット内の同等のストリークを取り除きます。プレートを37±2°Cで15-18時間インキュベートします。 準備したBRLCプレートを袋に入れ、4°Cで保管してください。注:BRLCの一般的な有効期限:生成後4°Cで14日。 BrLCプレートから各 大腸菌 O157株の単一コロニーを接種し、TSBの10mLで試験し、37°Cで18時間静電気でインキュベートして9 log10 CFU/mLに達します。 一晩培養物の連続希釈を調製(翌朝)、各 大腸菌 O157株は、MgSO4 の10mMを含むmTSBを使用して4-5 log10 CFU/ml(または他の所望の接種レベル)を達成する。 各株の一晩培養物の等量を混合して、合計で4-5 log10 CFU/mLを達成し(または望む)細菌混合物を調製する。 すぐに希釈した細菌培養物を4°Cに入れ、使用を保留します。 これらの希釈液のイノキュラム培養液10または100倍及びプレート0.1mLのアリコートをTSAプレート上で希釈し、単離されたコロニーを得た。 3. ファージ作業ソリューションの調製 標準の方法4に従って、スクリーニングされるファージ(≥108 PFU/mL)の高力剤作業株を伝播する。注:ファージストックの一般的な有効期限は、生成後4°Cのペットボトルで3ヶ月です。 所望の力素を達成するために、例えば、リシス動態に対する〜108PFU /mL、MgSO4の10mMを含有するmTSBで個々のファージ製剤を希釈する。可能なすべての組み合わせで同じツイターを持つ各作業ストックの等量を混合することによってファージカクテルを準備します。 4. 個々のファージおよびファージカクテルのための インビトロ リシス動態の調製 1~8列目の各ファージのシリアル10倍希釈液を無菌96ウェルマイクロプレートに準備し、マイクロプレートアッセイをセットアップします。注:1つの細菌株に対する4つのファージは、各プレート上の隣接する列で重複してテストすることができます。残りの 4 つの列はコントロール用で、ファージなしのコントロールと mTSB ブランクが含まれています (図 1)。 96ウェルマイクロプレートの1~12列のウェルに180 μLのmTSBを配置します。 マイクロプレートの一番上の行のウェル1〜8に希釈した個々のファージまたはファージカクテル(〜108 PFU/mL)を20μL加えます(行A)。 ファージフリーおよびブランクコントロールの場合、20 μL の mTSB を列 9、10、および 11 の上部ウェルに追加します。 12チャンネルのピペットで、プレートを希釈します。20 μL を行から行へ転送します。穏やかで繰り返しの吸引、放出(少なくとも5回)、希釈間の先端を変えることによって、ウェル内容物を混ぜます。最後の行(行H)から20 μLを取り除きます。注: クロス汚染を防ぐために、フィルターにチップを使用することをお勧めします。 各株のリザーバを設定し、1 mLピペットを使用して希釈培養液を2〜3mLのリザーバーに移します。列1~10の場合は、マルチチャンネルピペットを使用して、希釈された細菌培養液を各ウェルに20μLずつ添加します。各追加の間のヒントを変更します。 必要な条件でマイクロプレートを蓋をしてインキュベートします(例えば、37°Cの場合は10時間、22°C)。 2時間または他の所望の間隔で、マイクロプレートをインキュベーターから取り出します。 5. 光学濃度の測定 マイクロプレートリーダーを用いて、600 nm(OD600nm)で光学濃度を調べます。注:テストプレートの準備の前に、プログラムにアッセイプロトコルを設定して保存することをお勧めします。 マイクロプレートリーダーとオープンプログラムをオンにします。 「スタートアップ・オプション」ウィンドウで「簡易」モードを選択し、「タスク・マネージャーで新規プロトコルを作成する」を選択します (補足図 1a,b)。 [ プレートタイプの選択] ウィンドウから、ドロップダウン リストから [96 ウェルプレート ]を選択します(補助図2)。 検出方法として [吸光度 ]、読み取りタイプの エンドポイント/キネティック オプション、光学タイプの モノクロータ を選択します。OK をクリックします(補足図3)。 [読み取りステップ]に波長として 600 nm と入力し、読み取り速度として [標準 ] を選択します。OK をクリック します (補足図4)。 アッセイの温度を設定するには、[ インキュベート ]チェックボックスをクリックし、[ インキュベーターオン]を選択します。[温度]ボックスに希望の 温度 を入力します。 [OK] をクリックします。インキュベーション中にプレート蓋の凝縮を防ぐには、[勾配]ボックスに値(1-3)を入力して温度 勾配 を設定します。OK をクリック します (補足図5a)。注:37°Cインキュベーション温度の 次のステップを続行する前に、予熱 のチェックボックスをクリックしてください。このステップは22°C(RT)の試験条件には必要ない。 次に、[ キネティック ]チェックボックスをクリックして[キネティック設定]を開きます。37 °C インキュベーションの場合は 10 時間、RT の場合は 22 h の実行時間を設定します。OKをクリック します (補足図5b)。 「手順」ウィンドウの「振る」チェックボックスをクリックして、必要に応じて、各動読に対して振り分け条件を設定します(補足図6a)。 [振度モードの 線形 ]を選択し、[時間]を[30 s]に変更し、[リニア周波数]の値を731 cpm(2 mm)に設定し、[ OK]を クリックします(補助図6b)。 「 プロトコルの要約ダイアログ」 ウィンドウで、「 プレートレイアウト 」をクリックし 、「ブランク」「アッセイコントロール」「サンプル」を選択します。 [次へ]を クリックします(補足図7)。注: 負のコントロールの場合は、異なるコントロールタイプの数に 1 を入力します。 各井戸タイプの設定を定義したら、[完了]をクリック します。 左側のインターフェイスで Well ID を選択し、プレート レイアウトの未亡人に示されているマトリックスに割り当てます。OK をクリック します (補足図8)。 [プレートの 読み取り ] ボタンをクリックし、プロトコルを .prt ファイルとして保存し、[ 保存 ] をクリックします (補助図 9)。 プレートを挿入し、[OK]をクリック します。 実験が完了したら、実験を .xpt ファイルとして保存し、[ 保存 ] をクリックします (補助図 10)。 詳細な分析のために、メッセージ ウィンドウ ボックスの [はい ] ボタンをクリックして、データを Excel にエクスポートします (補足図 11)。 [ はい/いいえ ]の選択と[ 再び確認しない ]チェックボックスをクリックして、設定を保存します。 6. データ分析 上記のように少なくとも2つの独立した実験を繰り返す。すべての独立した試験の結果をコンパイルします。各ファージ処理および-フリー培養からOD600 の平均と標準偏差を計算します。 600 nmでOD値の平方根を実行し、各細菌株および温度に適切な統計モデルを使用して分析します。注: SAS ソフトウェアの場合、混合モデルと、平均を区別するための最小二乗 (P < 0.05) が選択されています。各株について、時間の経過とMOIの全体的な抗O157有効性が異なるファージ治療ごとにパネルA-Gを割り当てます(P < 0.05)。 検出可能な細菌増殖なし(検出限界:300 CFU/mL)に対応する0.01≤のOD600nm 値に基づいて優れたファージの有効性を定義します。 適切な統計モデルを用いて、時間、インキュベーション温度、 大腸菌 O157株、MOI、ファージタイプのファージ有効性に及ぼす影響を分析します。注: SAS ソフトウェアの場合は、ランダムな対策で GLIMMIX を使用してください。 オッズ比を計算して、目的の異なる環境および生物学的要因に対する優れた有効性を比較します。