噬菌体对食源性病原体生物防治的有效性通过高通量设置进行评估

1. 缓冲液和试剂的制备 制作 500 mL 胰蛋白酶大豆汤 （TSB）（15 克 TSB 粉末和 500 mL 超纯水）并高压灭菌器。注意：这可以在室温下储存长达3个月，或在4°C下储存长达6个月。 制作 500 mL 胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA）（20 克 TSA 粉末和 500 mL 超纯水）并高压灭菌器。注意：这可以在4°C下储存长达3个月。 制作500毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS;4克NaCl，0.1克KCl，0.77克Na2HPO4和0.12克KH2PO4，500毫升超纯水），在25°C下测量并将pH值调节至7.2±0.2并高压灭菌。注意：这可以在4°C下储存长达6个月。 制作200 mL 1 M MgSO4 （49.294 g和200 mL超纯水），并通过0.22μm聚醚砜过滤器灭菌。 用10 mM MgSO4 （mTSB;15 g TSB粉末，500 mL超纯水和5 mL 1 M MgSO4）和高压灭菌器制作500 mL TSB;让高压灭菌的培养基冷却至室温。应用无菌技术。使用血清学移液器，小心地转移5.0毫升1 M MgSO4;轻轻旋转以混合。 2. 细菌培养物的制备 要制备细菌研究实验室培养物（BRLC），请从冰箱库存中取出甘油储备小瓶并转移到实验室。 使用一次性接种环或等效物，浸入小瓶中，去除刮擦接种物（冷冻雪泥），并在TSA板或II级生物安全柜内的等效物上划线。将板在37±2°C孵育15-18小时。 将准备好的BRLC板装袋并储存在4°C。注意：BRLC的一般有效期：生成后在4°C下14天。 从BRLC板中接种每个 大肠杆菌 O157菌株的单个菌落，在10 mL TSB中进行测试，并在37°C下静态孵育18小时以达到9 log10 CFU / mL。 准备连续稀释的过夜培养物（第二天早上），每个 大肠杆菌 O157菌株使用含有10mM MgSO4 的mTSB达到4-5 log10 CFU / ml（或其他所需的接种水平）。 混合等体积的每种菌株的过夜培养物，以达到4-5 log10 CFU / mL总量（或根据需要）以制备细菌混合物。 立即将稀释的细菌培养物置于4°C以备使用。 将接种物培养物稀释10或100倍，并在TSA板上平板0.1mL等分试样这些稀释液以获得分离的菌落。 3. 噬菌体工作溶液的制备 按照标准方法，为要筛选的每个噬菌体（≥108 PFU/mL）繁殖高滴度工作储备4。注意：噬菌体储备的一般有效期为生成后在4°C的塑料瓶中3个月。 为了达到所需的滴度，例如，用于裂解动力学的〜108 PFU / mL，用含有10mM MgSO4的mTSB稀释单个噬菌体制剂。通过在所有可能的组合中将等体积的每种工作储备液以相同的滴度混合来制备噬菌体鸡尾酒。 4. 制备单个噬菌体和噬菌体鸡尾酒的 体外 裂解动力学 在无菌的96孔微孔孔板中，在色谱柱1-8中制备每个噬菌体的连续10倍稀释液，以建立微孔板测定。注意：针对一种细菌菌株的四个噬菌体可以在每个板上的相邻柱中一式两份进行测试。其余四列用于对照，没有噬菌体，以及mTSB空白（图1）。 将180μLmTSB置于96孔微孔板的色谱柱1至12的孔中。 将20μL稀释的单个噬菌体或噬菌体混合物（〜108 PFU / mL）加入微孔板顶排的1-8孔（A排）。 对于无噬菌体和空白对照，将20μLmTSB加入柱9，10和11的顶部孔中。 用12通道移液器稀释平板。将20 μL从一行转移到另一行。通过轻柔，反复抽吸，喷射（至少五次）并在稀释液之间更换尖端来混合孔内容物。从最后一行（H行）取出20μL。注意：建议使用带过滤器的吸头，以防止交叉污染。 为每个菌株设置一个储液槽，使用1 mL移液器将2-3 mL稀释的培养物转移到储液槽中。对于色谱柱1-10，使用多通道移液器向每个孔中加入20μL稀释的细菌培养物。在每次添加之间更改提示。 覆盖并在所需条件下孵育微孔板（例如，37°C10小时或22°C22小时）。 以2小时或其他所需的间隔，从培养箱中取出微孔板。 5. 光密度的测定 使用酶标仪检查600nm（OD 600nm）处的光密度。注意：建议在测试板制备之前在程序中设置并保存测定方案。 打开酶标仪并打开程序。 在”启动选项”窗口中选择简单模式，然后在任务管理器中选择”创建新协议”（补充图 1a，b）。 从 “选择板类型” 窗口中，从下拉列表中选择 “96 孔板 “（补充图 2）。 为检测方法选择 “吸光度 “，为读取类型选择” 端点/动力学 “选项，为光学类型选择” 单色器 “。单击”确定”（补充图 3）。 对于读取步长，输入 600 nm 作为波长，然后选择 正常 作为读取速度。单击 “确定” （补充图 4）。 要设置测定的温度，请单击” 孵化 “复选框，然后选择” 培养箱开启”。在”温度”框中输入所需的 温度 。单击 “确定”。为防止在孵育过程中板盖上结露，请在梯度框中输入值 （1-3） 来设置温度 梯度 。单击 确定 （补充图5a）。注：单击 “继续下一步前预热 “复选框，表示孵育温度为 37 °C。对于22°C（RT）下的测试条件，不需要此步骤。 接下来，单击” 动力学 “复选框以打开”动力学设置”。将运行时间设置为37°C孵育10小时或室温22小时。输入2小时作为读数间隔。单击 确定 （补充图5b）。 单击”过程”窗口中的”摇动”复选框，根据需要为每个动力学读取设置摇动条件（补充图 6a）。 为”摇动模式”选择” 线性 “，并将”持续时间”更改为 30 秒。将”线性频率”值设置为 731 cpm （2 mm），然后单击” 确定 “（补充图 6b）。 在”实验方案摘要对话框”窗口中，单击”板布局”，然后选择”空白”、”测定对照”和”样品”。单击”下一步”（补充图 7）。注：在阴性对照的不同对照类型数中输入1。 定义每个孔类型的设置后，单击” 完成”。 在左侧界面中选择一个 井 ID ，然后将其分配给板布局寡妇中显示的矩阵。单击 确定 （补充图 8）。 单击 “读取板” 按钮并将协议另存为 .prt 文件，然后单击” 保存 “（补充图 9）。 插入板，然后单击 确定。 实验完成后，将实验另存为 .xpt 文件，然后单击” 保存 “（补充图 10）。 通过单击消息窗口框中的” 是 “按钮将数据导出到 Excel，以进行进一步分析（补充图 11）。 单击 “保存是/否 “选项和 “不再询问 “复选框以保存首选项。 6. 数据分析 如上所述重复至少两个独立的实验。汇编所有独立试验的结果。计算每个噬菌体处理和游离培养物的OD600 的平均值和标准偏差。 在600nm处执行OD值的平方根，并使用每个细菌菌株和温度的适当统计模型对其进行分析。注： 对于 SAS 软件，选择了混合模型和用于区分均值的最小二乘法（P < 0.05）。对于每种菌株，将面板A−G分配给每种噬菌体处理，其总体抗O157功效随时间和MOI不同（P <0.05）。 根据 OD600nm 值≤ 0.01 定义卓越的噬菌体功效，对应于不可检测的细菌生长（检测限：300 CFU/mL）。 使用适当的统计模型分析时间、孵育温度、 大肠杆菌 O157菌株、MOI和噬菌体类型对噬菌体功效的影响。注意：对于 SAS 软件，请使用带有随机度量的 GLIMMIX。 计算优势比，以比较不同环境和生物因素的卓越功效。