Efficacité des bactériophages pour le biocontrôle des agents pathogènes d’origine alimentaire évaluée à l’aide de paramètres à haut débit

1. Préparation du tampon et des réactifs Faire 500 mL de bouillon de soja tryptique (TSB) (15 g de poudre de TSB et 500 mL d’eau ultrapure) et autoclave.REMARQUE: Cela peut être conservé à température ambiante jusqu’à 3 mois ou à 4 ° C jusqu’à 6 mois. Fabriquer 500 mL de gélose de soja tryptique (TSA) (20 g de poudre de TSA et 500 mL d’eau ultrapure) et autoclave.REMARQUE: Cela peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 3 mois. Faire 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 4 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,77 g de Na2HPO4 et 0,12 g de KH2PO4, 500 mL d’eau ultrapure), mesurer et ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 à 25 °C et autoclaver.REMARQUE: Cela peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 6 mois. Faire 200 mL de 1 M MgSO4 (49,294 g et 200 mL d’eau ultrapure) et stériliser via un filtre en polyéthersulfone de 0,22 μm. Produire 500 mL de BST avec 10 mM de MgSO4 (mTSB; 15 g de poudre de BST, 500 mL d’eau ultrapure et 5 mL de 1 M MgSO4) et autoclave; laisser le support autoclavé refroidir à température ambiante. Appliquez la technique aseptique. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer soigneusement 5,0 mL de 1 M MgSO4; tourbillonner doucement pour mélanger. 2. Préparation de la culture bactérienne Pour préparer la culture de laboratoire de recherche bactérienne (BRLC), retirez le ou les flacons de glycérol de l’inventaire du congélateur et transférez-les au laboratoire. Utilisez une boucle d’inoculation jetable ou l’équivalent, trempez dans le flacon, retirez un grattage d’inoculum (gadoue congelée) et tracez sur une plaque TSA ou l’équivalent dans une armoire de sécurité biologique de niveau II. Incuber la plaque à 37 ± 2 °C pendant 15−18 h. Mettez en sac les plaques BRLC préparées et conservez-les à 4 °C.REMARQUE: Délai d’expiration général pour BRLC: 14 jours à 4 °C après la génération. Inoculer une seule colonie de chaque souche d’E. coli O157 à partir des plaques BRLC à tester dans 10 mL de BST et incuber statiquement à 37 °C pendant 18 h pour atteindre 9 log10 UFC/mL. Préparer une dilution en série des cultures pendant la nuit (le lendemain matin), chaque souche d’E. coli O157 à l’aide de mTSB contenant 10 mM de MgSO4 pour atteindre 4-5 log10 UFC/ml (ou tout autre niveau d’inoculum souhaité). Mélanger un volume égal d’une culture de nuit de chaque souche pour obtenir 4-5 log10 UFC/mL au total (ou selon le souhait) pour préparer le mélange bactérien. Placer immédiatement la culture bactérienne diluée à 4 °C pour une utilisation en attente. Diluer la culture d’inoculum 10 ou 100 fois et plaquer 0,1 mL aliquotes de ces dilutions sur les plaques TSA pour obtenir les colonies isolées. 3. Préparation des solutions de travail des phages Propager des stocks de travail à titre élevé pour chaque phage à dépister (≥108 PFU/mL) en suivant les méthodes standard4.REMARQUE: La période de péremption générale pour les stocks de phages est de 3 mois dans une bouteille en plastique à 4 ° C après la génération. Pour obtenir le titre souhaité, par exemple, d’environ 108 PFU/mL pour la cinétique de lyse, diluez les préparations de phages individuelles avec du mTSB contenant 10 mM de MgSO4. Préparez des cocktails de phages en mélangeant des volumes égaux de chaque stock de travail avec le même titre dans toutes les combinaisons possibles. 4. Préparation de la cinétique de lyse in vitro pour les phages individuels et les cocktails de phages Préparer des dilutions en série de 10 fois de chaque phage dans les colonnes 1 à 8 dans des microplaques stériles de 96 puits pour mettre en place le test de microplaques.REMARQUE: Quatre phages contre une souche bactérienne peuvent être testés en double, dans des colonnes adjacentes, sur chaque plaque. Les quatre colonnes restantes sont destinées aux contrôles, qui sont sans phage, ainsi qu’au mTSB vide (Figure 1). Placer 180 μL de mTSB dans les puits des colonnes 1 à 12 de la microplaque de 96 puits. Ajouter 20 μL de phages individuels dilués ou de cocktails de phages (~108 PFU/mL) aux puits 1 à 8 de la rangée supérieure de la microplaque (rangée A). Pour le contrôle sans phage et vide, ajoutez 20 μL de mTSB au puits supérieur des colonnes 9, 10 et 11. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, diluer la plaque. Transférez 20 μL d’une ligne à l’autre. Mélanger le contenu du puits par aspiration douce et répétée, éjection (au moins cinq fois) et changement d’embouts entre les dilutions. Retirez 20 μL de la dernière ligne (ligne H).REMARQUE: L’utilisation de pointes avec des filtres est recommandée pour éviter la contamination croisée. Installez un réservoir pour chaque souche, utilisez une pipette de 1 mL pour transférer 2 à 3 mL de la culture diluée dans le réservoir. Pour les colonnes 1 à 10, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 20 μL de la culture bactérienne diluée à chaque puits. Changez les conseils entre chaque ajout. Couvrir et incuber la microplaque aux conditions souhaitées (par exemple, 37 °C pendant 10 h ou 22 °C pendant 22 h). À 2 h ou à d’autres intervalles souhaités, retirez les microplaques de l’incubateur. 5. Détermination de la densité optique Examinez la densité optique à 600 nm (OD600nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.REMARQUE: Il est conseillé de configurer et d’enregistrer le protocole d’essai dans le programme avant la préparation de la plaque d’essai. Allumez le lecteur de microplaques et ouvrez le programme. Sélectionnez le mode Simple dans la fenêtre Options de démarrage et sélectionnez Créer un nouveau protocole dans le Gestionnaire des tâches (Figure supplémentaire 1a,b). Dans la fenêtre Sélectionner le type de plaque , choisissez 96 Plaque de puits dans la liste déroulante (Figure supplémentaire 2). Sélectionnez Absorbance pour la méthode de détection, l’option Endpoint/Kinetic pour le type de lecture et Monochromateurs pour le type optique. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 3). Pour Read Step (Étape de lecture), entrez 600 nm pour les longueurs d’onde et sélectionnez Normal (Normal ) pour la vitesse de lecture. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 4). Pour régler la température du test, cochez la case Incuber et sélectionnez Incubateur activé. Entrez la température souhaitée dans la zone Température . Cliquez sur OK. Pour éviter la condensation sur le couvercle de la plaque pendant l’incubation, définissez un gradient de température en entrant une valeur (1-3) dans la zone Gradient . Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 5a).REMARQUE: Cliquez sur la case à cocher Préchauffer avant de passer à l’étape suivante pour la température d’incubation de 37 ° C. Cette étape n’est pas requise pour l’état d’essai à 22 °C (RT). Ensuite, cliquez sur la case à cocher Kinetic pour ouvrir la configuration cinétique. Réglez la durée d’exécution sur 10 h pour une incubation de 37 °C ou sur 22 h pour RT. Entrez 2 h pour l’intervalle de lecture. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 5b). Cochez la case Shake dans la fenêtre Procédure pour configurer la condition de secousse, si nécessaire, pour chaque lecture cinétique (Figure supplémentaire 6a). Sélectionnez Linéaire pour les modes de secousse et modifiez durée à 30 s. Réglez la valeur fréquence linéaire sur 731 cpm (2 mm), puis cliquez sur OK (Figure supplémentaire 6b). Dans la fenêtre Dialogue de résumé du protocole , cliquez sur Disposition des plaques et sélectionnez Blancs, Contrôles de dosage et Échantillons. Cliquez sur Suivant (Figure supplémentaire 7).REMARQUE : Entrez 1 dans Nombre de types de contrôle différents pour le contrôle négatif. Après avoir défini les paramètres pour chaque type de puits, cliquez sur Terminer. Sélectionnez un ID de puits dans l’interface de gauche, puis affectez-le à la matrice affichée dans la veuve de la disposition de la plaque. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 8). Cliquez sur le bouton Lire la plaque et enregistrez le protocole en tant que fichier .prt et cliquez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 9). Insérez la plaque et cliquez sur OK. Une fois l’expérience terminée, enregistrez-la sous forme de fichier .xpt et cliquez sur Enregistrer (Figure supplémentaire 10). Exportez les données vers Excel en cliquant sur le bouton Oui dans la fenêtre de message pour une analyse plus approfondie (Figure supplémentaire 11). Cliquez sur la sélection Enregistrer Oui/Non et sur la case à cocher Ne plus demander pour enregistrer la préférence. 6. Analyses des données Répétez au moins deux expériences indépendantes comme décrit ci-dessus. Compiler les résultats de tous les essais indépendants. Calculer l’écart-type moyen et l’écart-type de l’OD600 par rapport à chaque culture sans phages. Effectuer la racine carrée des valeurs OD à 600 nm et les analyser à l’aide d’un modèle statistique approprié pour chaque souche bactérienne et température.REMARQUE: Pour les logiciels SAS, le modèle MIXED et les moindres carrés pour différencier les moyennes (P < 0,05) sont sélectionnés. Pour chaque souche, attribuez les panels A−G à chaque traitement par phages dont l’efficacité globale de l’anti-O157 au fil du temps et les ME différaient (P < 0,05). Définir une efficacité phage supérieure basée sur la valeur OD600nm ≤ 0,01 correspondant à aucune croissance bactérienne détectable (limite de détection: 300 UFC / mL). Analyser les effets du temps, de la température d’incubation, des souches d’E. coli O157, des MEI et des types de phages sur l’efficacité des phages à l’aide d’un modèle statistique approprié.REMARQUE: Pour les logiciels SAS, utilisez GLIMMIX avec des mesures aléatoires. Calculez les rapports de cotes pour comparer l’efficacité supérieure pour différents facteurs environnementaux et biologiques d’intérêt.