Улавливание с помощью смолы в сочетании с изобарической маркировкой тандемных масс-меток для мультиплексированной количественной оценки окисления тиола белка

В гомеостатических условиях клетки генерируют активный кислород, азот или серу, которые помогают облегчить процессы, такие как метаболизм и передача сигналов ^1,2,3, распространяющихся как на прокариот, так и на эукариот. Физиологические уровни этих реактивных видов необходимы для правильной клеточной функции, также известной как «эустресс»^1,4. Напротив, увеличение окислителей, которое приводит к дисбалансу между окислителями и антиоксидантами, может вызвать окислительный стресс или «дистресс»¹, что приводит к повреждению клеток. Окислители передают сигналы биологическим путям, модифицируя различные биомолекулы, включая белок, ДНК, РНК и липиды. В частности, цистеиновые остатки белков представляют собой высокореакционноспособные участки, склонные к окислению из-за тиольной группы на цистеине, которая является реакционноспособной по отношению к различным типам окислителей⁵. Это приводит к появлению широкого спектра обратимых посттрансляционных модификаций на основе окислительно-восстановительных систем (ПТМ) для цистеина, включая нитрозилирование (SNO), глутатионилирование (SSG), сульфенилирование (SOH), персульфидирование (SSH), полисульфидирование (SS_nH), ацилирование и дисульфиды. Необратимые формы окисления цистеина включают сульфинилирование (SO₂H) и сульфонилирование (SO₃H).

Обратимые окислительные модификации остатков цистеина могут выполнять защитные роли, предотвращающие дальнейшее необратимое окисление, или служить сигнальными молекулами для последующих клеточных путей ^6,7. Обратимость некоторых окислительно-восстановительных ПТМ позволяет цистеиновым сайтам функционировать как «окислительно-восстановительные переключатели»^8,9, при этом изменения в окислительно-восстановительном состоянии этих сайтов изменяют функцию белка для регулирования их роли в переходных процессах. Модулирующие эффекты окислительно-восстановительных ПТМ¹⁰ наблюдались во многих аспектах функции^{белка 11}, включая катализ¹², белково-белковые взаимодействия¹³, изменение конформации¹⁴, координацию ионов металлов¹⁵ или фармакологическое связывание ингибитора¹⁶. Кроме того, окислительно-восстановительные ПТМ участвуют в цистеиновых сайтах белков, которые регулируют такие пути, как транскрипция¹⁷, трансляция¹⁸ или метаболизм¹⁹. Учитывая влияние, которое окислительно-восстановительные ПТМ оказывают на функцию белка и биологические процессы, важно количественно оценить степень окисления, которую подвергается сайт цистеина в ответ на возмущение окислительно-восстановительного состояния.

Идентификация цистеиновых участков с измененными окислительно-восстановительными состояниями сосредоточена на сравнении состояния окисления на сайт-специфическом уровне между нормальными и возмущенными условиями. Измерения изменения складок часто используются для определения того, какие участки значительно изменены, поскольку это помогает пользователям интерпретировать, какие участки цистеина могут быть физиологически значимыми для исследования. В качестве альтернативы, стехиометрические измерения обратимого окисления тиола в конкретном типе образца дают общую картину физиологического состояния в отношении клеточного окисления, что является важным измерением, которое часто упускается из виду и недостаточно используется. Модификационная стехиометрия основана на количественной оценке процента модифицированного тиола в соотношении к общему тиолу белка (модифицированному и немодифицированному)^20,21. В результате стехиометрические измерения предлагают более точное измерение, чем изменение складки, особенно при использовании масс-спектрометрии. Значение увеличения окисления может быть более легко установлено с помощью стехиометрии для определения занятости PTM конкретного участка цистеина. Например, 3-кратное увеличение окисления тиола может быть результатом перехода всего на 1% к 3% или от 30% до 90%. 3-кратное увеличение окисления для участка, который заполняется только на 1%, может оказать незначительное влияние на функцию белка; тем не менее, 3-кратное увеличение для участка с 30% заполняемостью в состоянии покоя может быть более существенным. Стехиометрические измерения, выполняемые между общими окисленными тиолами и специфическими окислительными модификациями, включая глутатионилирование белка (SSG) и нитрозилирование (SNO), могут выявить соотношения и количественную информацию в отношении конкретных типов модификаций.

Поскольку обратимое окисление тиола обычно представляет собой посттрансляционную модификацию с низким содержанием, было разработано несколько подходов для обогащения белков, содержащих эти модификации, из биологических образцов. Ранний подход, разработанный Jaffrey и другими, названный методом переключения биотина (BST)²², включает в себя несколько этапов, на которых немодифицированные тиолы блокируются путем алкилирования, обратимо модифицированные тиолы восстанавливаются до зарождающихся свободных тиолов, зарождающиеся свободные тиолы мечуются биотином, а меченые белки обогащаются сцеплением сродства стрептавидина. Этот метод использовался для профилирования SNO и SSG во многих исследованиях и может быть адаптирован для зондирования других форм обратимого окисления тиола^23,24. В то время как BST использовался для исследования различных форм обратимого окисления тиола, одна из проблем с этим подходом заключается в том, что на обогащение влияет неспецифическое связывание небиотинилированных белков со стрептавидином. Альтернативный подход, разработанный в нашей лаборатории, названный смоляным захватом (RAC)^25,26 (Рисунок 1), обходит вопрос обогащения тиоловых групп с помощью системы биотин-стрептавидин.

После восстановления обратимо окисленных тиолов белки с зарождающимися свободными тиолами обогащаются тиол-аффинной смолой, которая ковалентно захватывает свободные тиольные группы, что позволяет более специфическо обогащать цистеинсодержащие белки, чем BST. Соединение RAC с мультиплексирующей способностью последних достижений изобарической маркировки и масс-спектрометрии создает надежный и чувствительный рабочий процесс для обогащения, идентификации и количественной оценки обратимо окисленных остатков цистеина на уровне протеома. Последние достижения в области масс-спектрометрии позволили гораздо глубже профилировать тиоловый окислительно-восстановительный протеом, повышая понимание как причины, так и следствия окисления белка тиола²⁷. Информация, полученная на основе количественных данных по конкретным участкам, позволяет проводить дальнейшие исследования механистических воздействий и последующих эффектов обратимых окислительных модификаций²⁸. Использование этого рабочего процесса дало представление о физиологических последствиях обратимого окисления цистеина в отношении нормальных физиологических событий, таких как старение, при этом уровни SSG различались в зависимости от возраста. Эффекты старения на SSG были частично обращены вспять с помощью SS-31 (эламипретид), нового пептида, который усиливает митохондриальную функцию и снижает уровень SSG у пожилых мышей, в результате чего у них профиль SSG, более похожий на молодых мышей²⁹.

Было показано, что патофизиологические условия, связанные с воздействием наночастиц, включают SSG в модель макрофагов мыши. Используя RAC в сочетании с масс-спектрометрией, авторы показали, что уровни SSG напрямую коррелируют со степенью окислительного стресса и нарушения фагоцитарной функции макрофагов. Данные также выявили специфические для пути различия в реакции на различные инженерные наноматериалы, которые вызывают различные степени окислительного стресса³⁰. Метод также доказал свою полезность при прокариотических видах, где он применялся для изучения влияния суточных циклов на фотосинтетические цианобактерии в отношении окисления тиола. Наблюдались широкие изменения в окислении тиола в нескольких ключевых биологических процессах, включая перенос электронов, фиксацию углерода и гликолиз. Кроме того, с помощью ортогональной валидации было подтверждено, что несколько ключевых функциональных участков были модифицированы, что свидетельствует о регуляторной роли этих окислительных модификаций⁶.

Здесь мы описываем детали стандартизированного рабочего процесса (рисунок 1), демонстрируя полезность подхода RAC для обогащения общих окисленных цистеиновых тиолов белков и их последующей маркировки и стехиометрической количественной оценки. Этот рабочий процесс был реализован в исследованиях окислительно-восстановительного состояния в различных типах образцов, включая клеточные культуры^27,30 и целые ткани (например, скелетные мышцы, сердце, легкие)29,31,32,33. Хотя протокол RAC не включен здесь, он также легко адаптируется для исследования конкретных форм обратимых окислительно-восстановительных модификаций, включая SSG, SNO и S-ацилирование, как упоминалось ранее 25,29,34.