לכידה בסיוע שרפים בשילוב עם תיוג תג מסת טנדם איזוברי לכימות מרובב של חמצון חלבון תיול

בתנאים הומאוסטטיים, תאים מייצרים חמצן, חנקן או מיני גופרית תגובתיים המסייעים להקל על תהליכים, כגון חילוף חומרים ואיתות ^1,2,3, המגיעים הן לפרוקריוטים והן לאאוקריוטים. רמות פיזיולוגיות של מינים תגובתיים אלה נחוצות לתפקוד תקין של התאים, הידוע גם בשם ‘^{eustress’1,4}. לעומת זאת, עלייה במחמצנים שמובילה לחוסר איזון בין מחמצנים לנוגדי חמצון עלולה לגרום לעקה חמצונית, או ‘^{מצוקה’1}, שמובילה לפגיעה בתאים. מחמצנים מתמרים אותות למסלולים ביולוגיים על ידי שינוי ביומולקולות שונות, כולל חלבונים, דנ”א, רנ”א ושומנים. בפרט, שאריות ציסטאין של חלבונים הן אתרים תגובתיים מאוד המועדים לחמצון עקב קבוצת התיול על ציסטאין, שהוא תגובתי כלפי סוגים שונים של מחמצנים⁵. זה יוצר מגוון רחב של שינויים פוסט-טרנסלציוניים הפיכים מבוססי חמצון-חיזור (PTMs) עבור ציסטאין, כולל ניטרוזילציה (SNO), גלוטתיוניל (SSG), סולפנילציה (SOH), פרסולפידציה (SSH), פוליסולפידציה (SS_nH), אצילציה ודיסולפידים. צורות בלתי הפיכות של חמצון ציסטאין כוללות סולפינילציה (SO₂H) וסולפונילציה (SO₃H).

שינויים חמצוניים הפיכים של שאריות ציסטאין עשויים לשמש כמגנים ולמנוע חמצון בלתי הפיך נוסף או לשמש כמולקולות איתות למסלולים תאיים במורד הזרם ^6,7. ההפיכות של חלק מה-PTMs של חמצון-חיזור מחדש של תיול מאפשרת לאתרי ציסטאין לתפקד כ”מתגי חמצון-חיזור”^8,9, כאשר שינויים במצב חמצון-חיזור של אתרים אלה משנים את תפקוד החלבון כדי לווסת את תפקידם בתהליכים חולפים. ההשפעות המווסתות של PTMs¹⁰ של חמצון-חיזור נצפו בהיבטים רבים של תפקוד חלבונים¹¹, כולל קטליזה¹², אינטראקציות חלבון-חלבון 13, שינוי קונפורמציה 14, תיאום יוני מתכת 15, או קשירת מעכבים פרמקולוגית ¹⁶. בנוסף, PTMs של חמצון-חיזור מעורבים באתרי ציסטאין של חלבונים המווסתים מסלולים כגון שעתוק¹⁷, תרגום 18 או חילוף חומרים¹⁹. בהתחשב בהשפעה שיש ל-PTMs של חמצון-חיזור על תפקוד חלבונים ותהליכים ביולוגיים, חשוב לכמת את מידת החמצון שעובר אתר ציסטאין בתגובה להפרעה במצב חמצון-חיזור.

הזיהוי של אתרי ציסטאין עם מצבי חמצון-חיזור משתנים מתמקד בהשוואה של מצב החמצון ברמה הספציפית לאתר בין תנאים נורמליים לתנאים מופרעים. מדידות שינוי קיפול משמשות לעתים קרובות כדי לקבוע אילו אתרים משתנים באופן משמעותי מכיוון שזה עוזר למשתמשים לפרש אילו אתרי ציסטאין עשויים להיות משמעותיים מבחינה פיזיולוגית למחקר. לחלופין, מדידות סטויכיומטריות של חמצון תיול הפיך על פני סוג דגימה מסוים נותנות תמונה כללית של המצב הפיזיולוגי ביחס לחמצון התאים, מדידה חשובה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה ולא מנצלים אותה. סטויכיומטריה של שינוי מבוססת על כימות אחוז התיול המהונדס כיחס לסך החלבון תיול (שונה ולא שונה)^20,21. כתוצאה מכך, מדידות סטויכיומטריות מציעות מדידה מדויקת יותר מאשר שינוי קיפול, במיוחד בעת שימוש בספקטרומטריית מסות. ניתן לברר ביתר קלות את משמעות העלייה בחמצון על ידי שימוש בסטויכיומטריה כדי לקבוע את תפוסת ה- PTM של אתר ציסטאין מסוים. לדוגמה, עלייה של פי 3 בחמצון תיול יכולה לנבוע ממעבר של 1% ל-3% או מגודל של 30% עד 90%. עלייה של פי 3 בחמצון עבור אתר שנמצא בתפוסה של 1% בלבד עשויה להיות בעלת השפעה מועטה על תפקוד החלבון; עם זאת, עלייה של פי 3 עבור אתר עם תפוסה של 30% במצב מנוחה עשויה להיות מושפעת באופן משמעותי יותר. מדידות סטויכיומטריות, כאשר הן מבוצעות בין סך כל התיולים המחומצנים לבין שינויים חמצוניים ספציפיים, כולל חלבון גלוטתיוניל (SSG) וניטרוסילציה (SNO), יכולות לחשוף יחסים ומידע כמותי ביחס לסוגי שינויים ספציפיים.

מאחר שחמצון תיול הפיך הוא בדרך כלל שינוי פוסט-טרנסלציוני בעל שפע נמוך, פותחו גישות רבות להעשרת חלבונים המכילים שינויים אלה מתוך דגימות ביולוגיות. גישה מוקדמת שהומצאה על ידי ג’פרי ואחרים, שנקראה טכניקת מתג הביוטין (BST)²², כוללת שלבים מרובים שבהם תיולים ללא שינוי נחסמים באמצעות אלקילציה, תיולים שעברו שינוי הפיך מצטמצמים לתיולים חופשיים מתהווים, תיולים חופשיים מתהווים מסומנים בביוטין, והחלבונים המסומנים מועשרים על ידי משיכה של זיקה לסטרפטאווידין. טכניקה זו שימשה לפרופיל SNO ו- SSG במחקרים רבים וניתן להתאים אותה כדי לחקור צורות אחרות של חמצון תיול הפיך^23,24. בעוד ש-BST נוצל כדי לחקור צורות שונות של חמצון תיול הפיך, אחד החששות בגישה זו הוא שההעשרה מושפעת מהקשירה הלא ספציפית של חלבונים לא ביוטינילטים לסטרפטאבידין. גישה חלופית שפותחה במעבדה שלנו, שנקראת לכידה בסיוע שרף (RAC)^25,26 (איור 1), עוקפת את הנושא של העשרת קבוצות תיול באמצעות מערכת ביוטין-סטרפטאווידין.

בעקבות הפחתה של תיולים מחומצנים באופן הפיך, חלבונים עם תיולים חופשיים מתהווים מועשרים על ידי שרף זיקה תיול, אשר לוכד באופן קוולנטי קבוצות תיול חופשי, ומאפשר העשרה ספציפית יותר של חלבונים המכילים ציסטאין מאשר BST. צימוד RAC עם כוח הריבוב של ההתקדמות האחרונה בתיוג איזוברי וספקטרומטריית מסות יוצר זרימת עבודה חזקה ורגישה להעשרה, זיהוי וכימות של שאריות ציסטאין מחומצנות באופן הפיך ברמה הרחבה של פרוטאום. ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסות אפשרה פרופיל עמוק הרבה יותר של פרוטאום החיזור של תיול, מה שהגביר את ההבנה של הסיבה והתוצאה של חמצון תיול חלבון²⁷. המידע המתקבל מנתונים כמותיים ספציפיים לאתר מאפשר מחקרים נוספים על ההשפעות המכניסטיות וההשפעות במורד הזרם של שינויים חמצוניים הפיכים²⁸. שימוש בתהליך עבודה זה סיפק תובנה לגבי ההשפעות הפיזיולוגיות של חמצון ציסטאין הפיך ביחס לאירועים פיזיולוגיים נורמליים כגון הזדקנות, שבהם רמות ה- SSG היו שונות ביחס לגיל. השפעות ההזדקנות על SSG התהפכו חלקית באמצעות SS-31 (אלמיפרטיד), פפטיד חדש המשפר את תפקוד המיטוכונדריה ומפחית את רמות ה-SSG בעכברים מבוגרים, מה שגורם להם להיות בעלי פרופיל SSG דומה יותר לעכברים צעירים²⁹.

הודגם כי תנאים פתופיזיולוגיים המיוחסים לחשיפה לננו-חלקיקים מערבים SSG במודל מקרופאגים של עכברים. באמצעות RAC בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, החוקרים הראו כי רמות SSG היו בקורלציה ישירה למידת העקה החמצונית ולפגיעה בתפקוד הפאגוציטי של מקרופאגים. הנתונים גם חשפו הבדלים ספציפיים למסלול בתגובה לננו-חומרים מהונדסים שונים הגורמים לדרגות שונות של עקה חמצונית³⁰. השיטה הוכיחה את תועלתה גם במינים פרוקריוטים, שם היא יושמה כדי לחקור את ההשפעות של מחזורים יומיים בציאנובקטריה פוטוסינתטית ביחס לחמצון תיול. נצפו שינויים נרחבים בחמצון תיול במספר תהליכים ביולוגיים מרכזיים, כולל הובלת אלקטרונים, קיבוע פחמן וגליקוליזה. יתר על כן, באמצעות אימות אורתוגונלי, מספר אתרים פונקציונליים מרכזיים אושרו לשינוי, מה שמרמז על תפקידים רגולטוריים של שינויים חמצוניים אלה⁶.

במאמר זה נתאר את הפרטים של זרימת עבודה מתוקננת (איור 1), המדגימה את התועלת של גישת RAC להעשרת סך כל תיולי ציסטאין מחומצנים של חלבונים ואת התיוג והכימות הסטויכיומטרי שלהם לאחר מכן. תהליך עבודה זה יושם במחקרים של מצב חמצון-חיזור בסוגי דגימות שונים, כולל תרביות תאים^27,30 ורקמות שלמות (למשל, שרירי שלד, לב, ריאות)29,31,32,33. למרות שאינו כלול כאן, פרוטוקול RAC מותאם בקלות גם לחקירה של צורות ספציפיות של שינויי חמצון-חיזור הפיכים, כולל SSG, SNO ו-S-acylation, כפי שצוין קודם לכן^25,29,34.