מערכת ללא תאים טהורים של OnePot
Summary
אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לייצור מערכת TX-TL נטולת תאים PURE רקומביננטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
Abstract
מערכת תרגום התמלול של PURE (סינתזת חלבונים באמצעות אלמנטים רקומביננטיים) מספקת שלדה מושכת לביולוגיה סינתטית נטולת תאים. למרבה הצער, מערכות זמינות מסחרית הן יקרות, ואת טונה שלהם מוגבלת. לשם השוואה, ניתן להתאים אישית גישה תוצרת בית בהתאם לצרכי המשתמש. עם זאת, הכנת מערכות תוצרת בית היא זמן רב ומפרך בשל הצורך ריבוזומים, כמו גם 36 טיהורים חלבון בקנה מידה בינוני. ייעול טיהור החלבון על ידי שיתוף פעולה וטיהור משותף מאפשר למזער את זמן ודרישות העבודה. כאן, אנו מציגים שיטה קלה, מתכווננת, זמן וחסכוני לייצר את כל רכיבי מערכת PURE בתוך שבוע אחד, באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. יתר על כן, הביצועים של OnePot PURE דומים למערכות זמינות מסחרית. שיטת ההכנה של OnePot PURE מרחיבה את הנגישות של מערכת PURE למעבדות נוספות בשל פשטותה וחסכונותה.
Introduction
מערכות תרגום-תמלול ללא תאים (TX-TL) מהוות פלטפורמה מבטיחה לחקירה והנדסת מערכות ביולוגיות. הם מספקים תנאי תגובה פשוטים וטונה, כפי שהם כבר לא מסתמכים על תהליכים לקיים חיים, כולל צמיחה, הומאוסטזיס, או מנגנונירגולציה 1. לכן, צפוי כי מערכות ללא תאים יתרמו לחקירה של מערכות ביומולקולריות, יציעו מסגרת לבדיקת אסטרטגיות ביו-עיצוב רציונליות2, ויספקו שלדה לתא סינטטי עתידי3,4. מערכת PURE recombinant לחלוטין מציעה שלדה מושכת במיוחד בשל הרכבה המוגדר והמינימלי, כמו גם יכולת הכוונון והכוונוןשלה 5.
מאז הוקמה מערכת PURE הפונקציונלית הראשונה, recombinant מלא בשנת 20015, נעשו מאמצים להרחיב את מגבלות המערכת ולייעל את הרכב המערכת כדי לשפר את התפוקות של המערכת6,7,8, לאפשר רגולציה שעתוק9, ממברנה10,11 וסינתזת חלבון הפרשה12, כדי להקל על קיפול חלבון13,14 . כיום, ישנן שלוש מערכות זמינות מסחרית: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) ומג’יק PURE (Biolabs יצירתי). עם זאת, מערכות אלה יקרות, הרכבן המדויק הוא קנייני ולכן לא ידוע, והסתגלות מוגבלת.
מערכות PURE שהוכנו בתוך הבית הוכיחו את עצמם כאופציה המשתלמה והחסכוני ביותר15,16. עם זאת, 37 שלבי הטיהור הנדרשים לחלבון ולשברים ריבוזומים גוזלים זמן ומייגע. נעשו מספר ניסיונות לשפר את היעילות של הכנת מערכת PURE17,18,19. לאחרונה הוכחנו כי ניתן coculture ולטהר במשותף את כל החלבונים שאינם ריבוזומליים הנדרשים הקיימים במערכת PURE. שיטת OnePot זו הוכיחה את עצמה כחסכונית וחסכונית בזמן, ומקצרת את זמן ההכנה ממספר שבועות ל-3 ימי עבודה. הגישה מייצרת מערכת PURE עם יכולת ייצור חלבונים הדומה למערכת PURExpress הזמינה מסחרית20. בניגוד לגישות הקודמות כדי לפשט את הכנת PURE17,18,19, בגישה OnePot כל החלבונים עדיין באים לידי ביטוי זנים נפרדים. זה מאפשר למשתמש לכוונן את הרכב מערכת OnePot PURE על ידי השמטה או הוספה של זנים ספציפיים או התאמת נפחי החיסון, ובכך ליצור מערכות PURE נושרות או לשנות את יחסי החלבון הסופיים, בהתאמה.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה מפורטת ליצירת מערכת OnePot PURE כפי שתואר קודם לכן20, אם כי β-mercaptoethanol הוחלף טריס (2-carboxyethyl)פוספין (TCEP). יתר על כן, שתי שיטות לטיהור ריבוזום מתוארות: טיהור ריבוזום מסורתי ללא תגים באמצעות אינטראקציה הידרופובית וכרית סוכרוז, המותאמת מ Shimizu ואח’15, וטיהור ריבוזום Ni-NTA המבוסס על וואנג ואח ‘18 ו Ederth ואח’21 אך שונה באופן משמעותי. השיטה השנייה מקלה עוד יותר על הכנת מערכת PURE והופכת אותה לנגישה למעבדות נוספות, שכן נדרש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.
הפרוטוקול הניסיוני מסכם את הכנתה של מערכת TX-TL רב-תכליתית נטולת תאים PURE כדי לספק פלטפורמה פשוטה, טונה וחסכונית ללא תאים, שניתן להכין באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי תוך שבוע. מלבד הצגת הרכב PURE הסטנדרטי, אנו מציינים כיצד והיכן ניתן להתאים אותו, תוך התמקדות ראשונית בשלבים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח את פונקציונליות המערכת.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מתאר את הכנת מערכת TX-TL ללא תאים מרכיבים רקומביננטיים. לנוחות, העבודה מופרדת לחמישה חלקים. החלק הראשון מתאר שלבי הכנה, שיש לעשות לפני הפעלת הפרוטוקול. החלק השני מתאר את הכנת תמיסת החלבון OnePot. החלק השלישי מתאר טיהורים ריבוזומים, החלק הרביעי מפרט את הכנת פתרון האנרגיה, והחלק האחרון מספק מדריך להגדרת תגובת PURE. לנוחות, הפרוטוקולים מחולקים לימים ומסכמת בלוחות זמנים יומיים בטבלה 1. לאחר לוח הזמנים, ניתן להכין את המערכת כולה בשבוע אחד על ידי אדם אחד. 1. עבודה ראשונית הכן את תרבות החיידקים מדיה ותוספי מדיה כמתואר בטבלה משלימה 1. הכינו ועקרו את החומרים הנדרשים, כולל טיפים לצינורות, 96 צלחות עמוקות. הכנת מאמץ שנה את זני הביטוי המצוינים בטבלה 2 עם וקטורי הביטוי המתאימים בשיטת הלם החום. מוסיפים פלסמיד מטוהר לחיידקים המוכשרים מבחינה כימית ודגר על קרח במשך 20-30 דקות. מניחים את התערובת ב 42 °C (30 s( הלם חום) ולאחר מכן מניחים אותו בחזרה על קרח במשך 2 דקות. פיפטה 20 μL של החיידקים ישירות על לוחות אגר המכיל אמפצילין (AMP) ודגרה ב 37 °C (50 °F) לילה. לאחסן את הצלחות ב 4 °C (75 °F) עד שבוע אחד. לחסן 3 מ”ל של מדיה LB המכיל AMP עם מושבה אחת של חיידקים מלוחות אגר. דגירה ב 37 °C (7 °F) תוך כדי רועד ב 260 סל”ד לילה. לערבב 250 μL של התרבות עם 250 μL של 50% (v / v) גליסול ולאחסן ב -80 °C (70 °F).הערה: להכנה מהירה יותר בעתיד, לאחסן את הזנים בצלחת 96-well, מניות גליסול. אשר את כל השינויים הווקטוריים על-ידי PCR המושבה והרצף. רצף את הגן, אזור המקדם ואתר הכריכה של ריבוזום. בדיקת ביטוי לחסן 300 μL של מדיה LB המכיל AMP עם סביב 1 μL של מלאי גליצל מוכן בצלחת 1.3 מ”ל עמוק באר. לאטום את הצלחת עם קרום נושם ולאחר מכן לדגור ב 37 °C (50 °F) תוך רועד ב 260 סל”ד לילה.הערה: כל הביטויים נעשים בנפרד בשלב זה. לחסן 300 μL של מדיה LB טרי המכיל AMP עם 1 μL של תרבויות הלילה. דגירה ב 37 °C (7 °F) תוך כדי רועד ב 260 סל”ד לילה. לאחר 2 שעות, לגרום לתאים עם 100 מיקרומטר של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ולגדול עבור 3 שעות נוספות. לערבב 10 μL של התרבות עם 10 μL של 2x Laemmli חוצץ וחום ל 95 °C (70 °F) במשך 10 דקות. לסובב את הדגימות במשך 1 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחן לטעון 10 μL של supernatant על ג’ל PAGE. הפעל את הג’ל במאגר Tris/ גליצין / SDS ב 200 V במשך 30 דקות. לשטוף אותו היטב עם מים deionized. מכסים את הג’ל בכתם חלבון קומאסי ודגרה למשך שעה. יש לבטל את הג’ל במים במידת הצורך (תוצאות מייצגות לבדיקת הביטוי באיור 1).הערה: השתמש במעבר צבע (4%-15% או 4%-20%) ג’לים של עמוד כדי להשיג הפרדה טובה. שיקום וניקוי שרף SEPHArose IMAC הכנת טור. מערבבים היטב את שרף הספארוז על ידי מערבולת. Pipette הכמות הנדרשת של שרף לתוך עמודת זרימת כבידה ריקה.הערה: כמות השרף הנדרשת משתנה בין טיהור ריבוזום שלו לטיהור חלבונים ומפורטת בסעיפים המתאימים. לשטוף את השרף עם 30 מ”ל של מים deionized. המשך עם טעינה מחדש של העמודה כמפורט בסעיף 1.4.4.הערה: תמיד תן לכל הנוזל לעבור דרך העמודה לפני שתמשיך בשלב הבא. עם זאת, ודא שהעמודה לעולם לא תתייבש. בכל פעם שמעביר נוזל בעמודה, ודא לעצור את הזרימה או להמשיך לשלב הבא ברגע שהנוזל מגיע לשרף. שחזור. לשטוף את העמוד עם 30 מ”ל של מים deionized. החל 10 מ”ל של 0.2 M EDTA ו 0.5 M NaCl פתרון. הוסף 30 מ”ל של פתרון NaCl 0.5 M. לשטוף את העמוד עם 50 מ”ל של מים deionized. יש לאחסן 20% (v/v) אתנול ב-4 °C (7%), או להמשיך בשלב הבא. ניקוי.זהירות: ללבוש ציוד מגן. לשטוף את העמודה עם 30 מ”ל של 0.5 M NaOH. לשטוף את העמוד עם 30 מ”ל של מים deionized. לשטוף את העמודה עם 30 מ”ל של 0.1 M חומצה אצטית. לשטוף את העמוד עם 30 מ”ל של מים deionized. לשטוף את העמודה עם 30 מ”ל של 70% (v / v) אתנול. לשטוף את העמוד עם 50 מ”ל של מים deionized. יש לאחסן 20% (v/v) אתנול ב-4 °C (7%), או להמשיך בשלב הבא. טעינה מחדש. הוסף 10 מ”ל של פתרון סולפט ניקל 0.1 M לעמודה.זהירות: ניקל גופרתי רעיל. פסולת ניקל גופרתי צריך להיות מושלך עם אמצעי הזהירות שצוינו על ידי הספק. לשטוף את העמוד עם 50 מ”ל של מים deionized. יש לאחסן 20% ((v/v)) אתנול ב-4 °C (7%), או להמשיך עם שאיבות העמודות.הערה: אם העמודה מאוחסנת באתנול בין השלבים, הקפד להסיר את כל עקבות האתנול על ידי שטיפת העמוד במים. 2. ביטוי וטיהור של תמיסה וטיהור של פתרון חלבון OnePot הערה: הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים המחולקים לימים (איור 2). הליך הכנה אידיאלי מייצר 1.5 מ”ל של 13.5 מ”ג / מ”ל פתרון חלבון OnePot, אשר מתאים יותר מאלף תגובות 10 μL PURE. עם זאת, הסכום והריכוז האידיאלי של הפתרון ישתנו מאצווה לאצווה. משתמשים מנוסים יכולים לבצע הכנות Pure OnePot מרובים בכל פעם. יום 1: הכן מדיה תרבות חיידקים ותוספי מדיה כמתואר בטבלה משלימה 1. הכינו ועקרו את החומרים הנדרשים, כולל טיפים לצינורות, שתי צלחות 96 עמוקות, ובקבוק ארלנמאייר אחד מבולבל אחד. הכן מאגרים ותוספי מזון כמתואר בטבלה משלימה 2. מסנן לחטא את כל המאגרים באמצעות מסננים עליונים בקבוק (0.45 מיקרומטר) ולאחסן אותם ב 4 °C (70 °F). להשלים את כל המאגרים עם 1 mM TCEP ממש לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. יש להשתמש ב-2 מ”ל של שרף ספרוז לטיהור חלבון OnePot. הכן את העמודה כמתואר בסעיף 1.4. כדי להכין את התרבויות המתנע, לשלב 20 מ”ל של מדיה LB עם 20 μL של AMP. בצלחת סטרילית 96, 1.3 מ”ל עמוק באר, להוסיף 300 μL של התקשורת לתוך 35 בארות. לחסן כל אחד מהם עם המתח המתאים שלה, למעט גורם התארכות תרמו לא יציב (EF-Tu), ולאטום את הצלחת עם קרום נושם.הערה: לחסן את הצלחת באמצעות משכפל 96 באר (ראה טבלת חומרים). נפח הבאר של הצלחת העמוקה והנפח של תרבות המתנע הם חיוניים. נפחי מדיה גדולים יותר או נפחי באר קטנים יותר יובילו לצפיפות חיידקית שונה עקב חוסר עקביות של תפירה. עבור תרבות EF-Tu, לחסן 3 מ”ל של מדיה LB בצינור תרבות 14 מ”ל עם כובע הצמדה. 3 מ”ל אחד של תרבות עבור EF-Tu מספיק לתרבות ביטוי אחת של OnePot. דגירה ב 37 °C (7 °F) תוך כדי רועד ב 260 סל”ד לילה. יום 2:הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. העבר 500 מ”ל של מדיה LB ו 500 μL של AMP לתוך הבקבוק הסטרילי מבולבל. לחסן את תרבות PURE OnePot עם 1675 μL של תרבות EF-Tu ו 55 μL של כל אחת מהתרבויות מן הצלחת עמוקה היטב(טבלה 2).הערה: במהלך שלב זה, הרכב החלבון הכולל ניתן להתאים על ידי כוונון יחסי החיסון. ודא כי נפח החיסון הכולל נשאר קבוע ב 3.6 מ”ל.אופציונלי: כדי לאשר כי כל הזנים גדלו בן לילה, למדוד את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה ב 600 ננומטר (OD600)בצלחת 96 טוב באמצעות לוח קורא. השתמש בדילול של 10x למדידת הצפיפות האופטית. לדגור על התרבות במשך 2 שעות ב 37 °C (37 °F) עם ניעור של 260 סל”ד, או עד OD600 של התרבות מגיע 0.2-0.3. לגרום לתרבות עם 500 μL של 0.1 mM IPTG ולגדול עבור 3 שעות נוספות. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 °C (55 °F) ו 3220 x g במשך 10 דקות ולאחסן את גלולה התא ב -80 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.הערה: כדי לייעל את התזמון, הכינו את פתרון האנרגיה המתואר בסעיף 4 במהלך זמני הדגירה ביום 2(טבלה 1). יום 3: מדוד את כמויות המאגרים הדרושים לטיהור המתואר בשלבים שלהלן והוסף TCEP לכולם כפי שצוין בטבלה המשלימה 2. אחסן את המאגרים הנותרים ללא TCEP ב- 4 °C (4 °F) לטיהורים עתידיים. שפל את העמודה הטעון (סעיף 2.4) עם 30 מ”ל של מאגר A. לאחר 25 מ”ל של חוצץ A עברו, סגור את העמודה מלמטה. במקביל, המשך בשלבים 2.15-2.17. להפשיר את התאים ולהשתמש פיפטה סרולוגית כדי resuspend גלולה התא ב 7.5 מ”ל של חוצץ A. Lyse התאים באמצעות sonicator בדיקה 130 וואט (ראה טבלה של חומרים, קוטר קצה בדיקה: 6 מ”מ) עם הפרמטרים הבאים: 4 x 20 s דופק על, 20 s דופק, 70% משרעת. אם sonication יצליח, הפתרון יהפוך כהה יותר (איור 2).הערה: הקפד לשמור על התאים על קרח במהלך sonication. מניחים את הגשוש עמוק מספיק לתוך הפתרון מבלי לגעת בצינור. אם כמות גדולה של קצף נוצר, העברת האנרגיה תהיה מעומעמת. במקרה זה, תן לקצף להתיישב, להוריד את הבדיקה עמוק יותר לתוך הפתרון, ולהאריך את זמן sonication. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 21130 x g במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F) מיד לאחר sonication. שמור את lysate על קרח. הוסף את הסופר-טבעי לעמודה המשוויבת. סגור את העמודה מלמעלה וודא שאין דליפה. לדגור על העמודה במשך 3 שעות ב 4 °C תחת סיבוב באמצעות סיבוב צינור. האלגנטי רכיבים לא מאוגדים מהעמודה ושטוף עם 25 מ”ל של חוצץ A. לשטוף את העמודה עם 25 מ”ל של 25 mM חיץ imidazole (23.95 מ”ל של חוצץ A ו 1.25 מ”ל של חוצץ B). יש לאלוט את החלבונים עם 5 מ”ל של 450 מ”מ חיץ imidazole (0.5 מ”ל של חוצץ A ו 4.5 מ”ל של חוצץ B). שמור את החלבונים הנבהים על קרח בכל עת. לדלל את eluate עם 25 מ”ל של חוצץ HT, לשמור את התערובת על קרח. הוסף 15 מ”ל למסנן צנטריפוגלי של 15 מ”ל והתרכז בנפח של 1.5 מ”ל. מוסיפים את 15 מ”ל הנותרים למסנן עם הפתרון המרוכז ומתרכזים שוב ב-1.5 מ”ל. הוסף 10 מ”ל של מאגר HT לדגימה המרוכזת והתרכז ל- 1 מ”ל. הוסף כמות שווה של מאגר מלאי B ולאחסן ב -80 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.הערה: סיבוב אחד של חילופים / ריכוז לוקח בערך 60 דקות ספינינג ב 3220 x g ב 4 °C (70 °F). במהלך חילופי המאגרים, שחזר את העמודה כמפורט בסעיף 1.4. יום 4: למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ברדפורד assay כפי שתואר על ידי הספק. מרכז את המדגם עם 0.5 מ”ל של מסנן צנטריפוגלי חתך 3 kDa ל 20 מ”ג / מ”ל.הערה: לדלל את תמיסת החלבון פי 25 או פי 50 לפני מדידות הריכוז כדי למנוע רוויית יתר של בדיקת ברדפורד. כדי לבסס את ריכוז החלבון האידיאלי, בצע בדיקת ביטוי בשלב זה (סעיף 5.2) עם ריכוזים שונים של תמיסת החלבון. כדי לבצע את titration, לשמור על הנפח הכולל של התמיסה קבוע pipette פתרון חלבון OnePot, כולל מאגר מלאי B, בחמישה יחסים שונים (טבלה משלימה 7). אמת את הרכב החלבון Pure OnePot באמצעות SDS-PAGE (איור 3A). לדלל 2.5 μL של המדגם עם 7.5 μL של מים, לערבב עם 10 μL של 2x Laemmli חוצץ ולאחר מכן לטעון 5 μL ו 2.5 μL של הדגימות לג’ל. הפעל את ה- SDS-PAGE כמפורט בסעיף 1.3.3. Aliquot פתרון החלבון לתוך 50 aliquots μL לאחר אימות הביטוי והתאמת הריכוז. יש לאחסן את תמיסה חלבון Pure OnePot ב-80 °C (80°F) עד לשימוש נוסף.הערה: אם קיים רכיב חלבון, או קיים בריכוז נמוך מהצפוי ב-OnePot PURE, בצע את השלבים הבאים. בדוק אם תרבות הלילה של הזן המתאים גדלה בשיעור דומה לתרבויות האחרות על ידי ביצוע מדידות צפיפות אופטית (OD600)של כל התרבויות. בצע בדיקת ביטוי נוספת של הזן הספציפי כדי לאמת את הביטוי של החלבון החשוד. 3. פתרון ריבוזום הערה: שתי אסטרטגיות טיהור ריבוזום שונות מוצגות, אחת עבור hexahistidine מתויג ואחד עבור ריבוזומים שאינם מתויגים. היתרון העיקרי של שיטת הטיהור באמצעות טיהורו בעמודת זרימת כבידה סטנדרטית של Ni-NTA הוא שהטיהור קל, מהיר ואינו דורש ציוד מעבדה נוסף, כגון מערכת FPLC ומערכת ultracentrifuge. עם זאת, יכולת ייצור החלבון בתגובות Pure של OnePot היא כשליש בהשוואה לריבוזומים ללא תגים. לכן, בחר את השיטה לייצור ריבוזום בהתבסס על אם תשואה גבוהה חשובה עבור היישום נתון. טיהור ריבוזום המתויג שלוהערה: פרוטוקול זה משתמש בזן E. coli RB1, מתנה מפרופסור וואנג (אוניברסיטת קולומביה, ארה”ב)18. זן זה כולל החדרה גנומית של תג הקסהיסטידין על מסוף C של חלבון ריבוזומלי 50S (L7/L12), המאפשר טיהור באמצעות עמודת זרימת הכבידה של Ni-NTA. התשואה הרגילה היא סביב 0.5 מ”ל של 3.45 מיקרומטר ריבוזומים, וזה מספיק עבור יותר מחמש מאות תגובות 10 μL PURE. יום 1: הכן מדיה תרבות חיידקים ותוספי מדיה כמתואר בטבלה משלימה 1. הכן ועקר את החומרים הנדרשים, כולל טיפים פיפטה, בקבוקון 5 L Erlenmeyer אחד, בקבוק ארלנמאייר אחד 100 מ”ל. הכן מאגרים ותוספי מזון כמתואר בטבלה משלימה 2. מסנן לחטא את כל המאגרים באמצעות מסנני בקבוק העליון (0.45 מיקרומטר) ולאחסן אותם ב 4 °C (70 °F). יום 2: Pipette 5 מ”ל של שרף לעמודה ולהכין את העמודה כפי שצוין בסעיף 1.4.הערה: בשל הנפח הגבוה יותר של השרף, השיקום והטיהור לוקחים זמן רב יותר באופן משמעותי. השתמש בעמודה אחרת לטיהור ריבוזום כדי למנוע זיהום צולב ולנקות אותו ביסודיות לפני הטיהור. הכן תרבות לילה של זן E. coli RB1 על ידי חקינה 35 מ”ל של מדיה LB בבקבוק 100 מ”ל Erlenmeyer. דגירה ב 37 °C (7 °F) תוך כדי רועד ב 260 סל”ד. יום 3:הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. הוסף 2 L של מדיה LB לתוך בקבוקון סטרילי 5 L, לחסן עם 12 מ”ל של תרבות הלילה, ולאחר מכן דגירה עבור 3-4 שעות ב 37 °C (5 °F) תוך רועד ב 260 סל”ד.הערה: לחלופין, לבצע פולחן חיידקי ב 4 x 500 מ”ל של תרבויות 1 L בקבוקונים מבולבלים. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3220 x g ו 4 °C (70 °F). יש לאחסן ב-80 °C (70°F) עד לשימוש נוסף. יום 4: שפל את הטור שהוכן בשלב 3.1.4. עם 30 מ”ל של מאגר תמה. resuspend הכדור ב 20 מ”ל של חיץ תמיס באמצעות פיפטה סרולוגית. Lyse התאים עם sonicator בדיקה 130 וואט (ראה טבלה של חומרים, קוטר קצה בדיקה: 6 מ”מ) על קרח עם הפרמטרים הבאים: 11 x 20 s דופק על; 20 s דופק כבוי, 70% משרעת (ראה שלב 2.16 לפרטי הליך). מיד לאחר sonication, להסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 21130 x g ב 4 °C (70 °F). שמור את lysate על קרח. טען את הסופר-טבעי לעמודות ותן לו לעבור. לשטוף את העמודה עם התערובות הבאות של תמוה ומאגרי חמקמק. לשטוף 0: להשתמש 30 מ”ל של מאגר תמוץ. לשטוף 1: להשתמש 30 מ”ל של 5 mM imidazole (29 מ”ל של חוצץ תמוגה, 1 מ”ל של חוצץ אלוטיון). לשטוף 2: להשתמש 60 מ”ל של 25 mM imidazole (50 מ”ל של חוצץ תמוגה, 10 מ”ל של חוצץ elution). לשטוף 3: להשתמש 30 מ”ל של 40 mM imidazole (22 מ”ל של חוצץ תמוגה, 8 מ”ל של חוצץ elution). לשטוף 4: להשתמש 30 מ”ל של 60 mM imidazole (18 מ”ל של חוצץ תמוגה, 12 מ”ל של חוצץ elution). לבחון את הריבוזומים עם 7.5 מ”ל של חוצץ elution. שמור את החלבונים הנבהים על קרח בכל עת. הוסף 22 μL של טהור β-mercaptoethanol ל 45 מ”ל של חוצץ ריבוזום.זהירות: β-mercaptoethanol הוא רעיל. לנקוט באמצעי זהירות ולעבוד במכסה אדים. מוסיפים את האלואט למסנן צנטריפוגלי של 15 מ”ל ומתרכזים ב-1 מ”ל. הוסף 15 מ”ל של חוצץ ריבוזום לדגימה המרוכזת והתרכז שוב ל-1 מ”ל.הערה: חזור על השלב הקודם פעמיים. יש לאחסן ב-80 °C (70°F) עד לשימוש נוסף.הערה: סיבוב אחד של חילופים / ריכוז לוקח בערך 60 דקות של צנטריפוגה ב 3220 x g ב 4 °C (70 °F). במהלך חילופי המאגרים, שחזר את העמודה כמפורט בסעיף 1.4. יום 5: קבע את ריכוז הריבוזום על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר של מדגם מדולל 1:100 במאגר ריבוזום. ערך ספיגה של 10 של הפתרון מדולל מתאים 23 μM של פתרון לא מדולל כפי שתואר בעבר16. ליישם ריכוז מלאי סופי של 3.45 μM. כדי להתאים את הריכוז, לדלל את הריבוזומים עם חיץ ריבוזום או לרכז אותם עוד יותר על ידי צנטריפוגה ב 14000 x גרם במסנן צנטריפוגלי 3 kDa 0.5 מ”ל ב 4 °C (5 °F).הערה: כדי להשיג ביטוי מערכת אופטימלי, בצע טיטציה ריכוז ריבוזום (סעיף 5.2, טבלה משלימה 7). אמת את הרכב הריבוזום באמצעות SDS-PAGE (איור 3A) כמפורט בסעיף 1.3.3. לדלל 2.5 μL של המדגם עם 7.5 μL של מים, לערבב עם 10 μL של 2x Laemmli חוצץ, ולאחר מכן לטעון 5 μL ו 2.5 μL של הדגימות על הג’ל. טיהור ריבוזום ללא תגיםהערה: טיהור ריבוזום ללא תגים מבוצע באמצעות מערכת FPLC(טבלת חומרים)ומבוסס על כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית באמצעות 2 x 5 מ”ל עמודות בוטיל(טבלת חומרים). למרות ריבוזומים עשויים להיות מטוהרים מכל זן, באמצעות E. coli A19 (E. coli משאבים גנטיים בייל CGSC) זן הוא יתרון בשל מחיקת RNase I שלה22. בצע את הטיהור ב 4 °C (5 °F) בחדר קר או ארון קירור. התשואה הרגילה היא סביב 0.5 מ”ל של 10 μM ריבוזומים, אשר מתאים יותר מחמש מאות תגובות 10 μL PURE. יום 1: הכן מדיה תרבות חיידקים ותוספי מדיה כמתואר בטבלה משלימה 1. הכן ועקר את החומרים הנדרשים, כולל טיפים פיפטה, בקבוקון 5 L ארלנמאייר, ובקבוק ארלנמאייר 100 מ”ל. הכן מאגרים ותוספי מזון כמתואר בטבלה משלימה 2. מסנן לחטא את כל המאגרים באמצעות מסנני בקבוק העליון (0.45 מיקרומטר) ולאחסן אותם ב 4 °C (70 °F). יום 2: כדי להכין תרבות לילה של זן E. coli A19, לחסן 35 מ”ל של מדיה LB בבקבוק ארלנמאייר 100 מ”ל. דגירה ב 37 °C (7 °F) תוך כדי רועד ב 260 סל”ד. יום 3: העבר 2 L של מדיה LB לתוך בקבוקון סטרילי 5 L, לחסן עם 30 מ”ל של תרבות הלילה, ולאחר מכן לדגור במשך 3-4 שעות ב 37 °C (5 °F) תוך רועד ב 200 סל”ד. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). resuspend הכדור ב 25 מ”ל של חוצץ השעיה ולאחסן ב -80 °C עד לשימוש נוסף. יום 4: בצע שלבים 3.2.8-3.2.12 במקביל לשלבים 3.2.13-3.2.19. להפשיר ולזלוט את התאים באמצעות sonicator בדיקה 130 וואט (ראה טבלה של חומרים וקוטר קצה בדיקה: 6 מ”מ) על קרח עם הפרמטרים הבאים: 12 x 20 s דופק על; 20 s דופק כבוי, 70% משרעת (ראה שלב 2.16 פרטי הליך). הסר מיד את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F). שאפו את הסופר-טבעי ומדדו את הנפח. מוסיפים נפח שווה של חוצץ השעיה (מלח גבוה) כדי להתאים את הריכוז הסופי של אמוניום גופרתי ל 1.5 M ומערבבים היטב. הסר את המשקעים על ידי צנטריפוגה ב 20000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F). מסנן את supernatant באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליאתרסולפון ממברנה מזרק מסנן לפני טיהור FPLC ולאסוף את הסינון בבקבוק זכוכית 100 מ”ל. שמור על supernatant ב 4 °C (5 °F) בכל עת. הגדר את מערכת FPLC לטיהור כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית באמצעות עמודת בוטיל כפולה (2 x 5 מ”ל) כדלקמן. עבור התקנה זו, אמצעי אחסון עמודה אחד (CV) מתייחס לאמצעי אחסון של 10 מ”ל. יהיה צורך בשלושה מפרצונים: שניים כקווי חיץ ואחד כקו המדגם. בשל הגדרות ברירת המחדל של מטהר, נוח לבחור קווים A1 ו- B1 עבור מאגר C ומאגר D, בהתאמה, וקו A2 כשורה לדוגמה. החל קצב זרימה ברירת מחדל של 4 מ”ל / דקה, למעט שטיפת משאבה (10 מ”ל / דקה) או אלא אם צוין אחרת.הערה: מכיוון ש- TCEP הוא ריאגנט יקר, הוסף את הסכום המתאים למאגרים C ו- D רק לאחר שלב שיווי משקל. בצע שטיפת משאבת מערכת ב 20% ((v/v)) אתנול כדי לנקות את המערכת ולהסיר זיהום פוטנציאלי מטיהורים קודמים. הגדר באופן ידני קצב זרימה של 0.2 מ”ל/דקה וטען את העמודה. לעצור את הזרימה. בצע שטיפת משאבת מערכת עם מים. לשטוף את העמוד עם 3 קורות מים. שוויון: מקם את מכניסות A1 ו- A2 במאגר C ו- Inlet B1 במאגר D ללא TCEP. בצע שטיפת משאבה ושווי את העמודה עם 4 קורות מים של חוצץ C. הוסף TCEP למאגרים C ו- D. הכן צינורות 15 מ”ל או צינורות אספן שבר עגולים ברורים לאספן השברים כדי לאסוף שברי אלוטיון 4-5 מ”ל. טעינה: מניחים את הכניסה A2 לתוך הבקבוק עם המדגם המסונן. טען כ- 90% מעוצמת הדגימה לעמודה. לדלל את המדגם עם 20 מ”ל של מאגר C המכיל TCEP, ולטעון 10 מ”ל של המדגם על העמודה. חזור על שלב הדילול לפחות פעמיים וטען דוגמה רבה ככל האפשר על העמודה. זה קריטי כדי להבטיח כי אין אוויר נשאב לתוך המכונה. שלב כביסה 1: יש לשטוף עם 3 קורות מים של חוצץ C כדי להסיר את הרכיבים הלא מאוגדים. שלב כביסה 2: יש לשטוף עם 5 קורות מים של 80% חוצץ C ו-20% Buffer D. Elution: לחמוק המוצר על ידי החלת 50% של חוצץ C ו 50% של חוצץ D, עם נפח חצץ הכולל של 5 קורות משתמשים. לאסוף את השבר הזה צינורות אספן. שלב כביסה 3: יש לפנות את כל המזהמים באינטראקציה חזקה באמצעות 100% buffer D עם נפח כולל של 5 קורות לב. נתחו את ספקטרום הספיגה של שבר המדגם ב- 260 או 280 ננומטר(איור 4). הפסגה הראשונה מראה את החלבונים הלא נספגים במהלך הטעינה ואת שלב הכביסה הראשון; הפסגה השנייה מציגה מזהמים שנבהרו במהלך שלב הכביסה השני. הפסגה השלישית מנטרת את המוצר הסופי, והשיא האחרון מראה את המזהמים האינטראקציה החזקה. איחד את כל שברי המדגם המתאימים לשיא השלישי לעיבוד נוסף. שמור את החלבונים הנבהים על קרח בכל עת. לכסות בעדינות את השבר התאושש על 15 מ”ל של חיץ הכרית בארבעה צינורות אולטרה צנטריפוגה polycarbonate. הוסף מקסימום של 15 מ”ל של המדגם ל 15 מ”ל של מאגר הכרית. הקפד לאזן את המשקל של הצינור היטב. פלט את הריבוזומים על ידי אולטרה צנטריפוגה ב 100000 x גרם ב 4 °C (70 °F) עבור 16 שעות.הערה: ודא כי אין סדקים נוכחים צינורות אולטרה צנטריפוגה. נקה ואיפס את העמודה באופן הבא. קצב זרימה של 5 מ”ל / דקה עובד טוב. מניחים את כל הכניסות לתוך המים ולבצע שטיפת משאבה. לשטוף את העמוד עם 2 קורות מים. מניחים את הכניסה לתמיסת NaOH של 0.5 M, מבצעים שטיפת משאבה ולאחר מכן שוטפים את העמוד עם 3 קורות מים של NaOH. מניחים את הכניסה למים, לבצע שטיפת משאבה, ולאחר מכן לשטוף את העמודה ב 2 קורות מים. מניחים את המפרצון לתמיסת חומצה אצטית 0.1 M, לבצע שטיפת משאבה, ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם 3 קורות מים של פתרון חומצה אצטית. לשטוף ולשטוף את העמודה עם 2 קורות מים. מניחים את כל הכניסות לתוך 20% ((v/v)) אתנול, לבצע שלב שטיפת משאבה, ולאחסן את העמודה ב 20% ((v/ v)) אתנול על ידי שטיפת אותו עם 3 קורות מים של 20% ((v/ v)) פתרון אתנול.הערה: ודא שהמערכת לעולם לא מתייבשת או מוצצת באוויר. לעולם אל תחיל חוצץ ישירות על אתנול, או אתנול על חוצץ. תמיד להוסיף שלב שטיפת מים בין, כמו אחרת יש סיכון של משקעים סתימת העמוד. הקפד להוסיף מספיק צינורות איסוף מדגם. יום 5: יש להשליך את הסופר-טבעי ולהיזהר, מבלי להפריע לכדור שקוף, לשטוף כל גלולה עם 0.5 מ”ל של חיץ ריבוזום קר כקרח. חזור על שלב זה פעמיים. resuspend כל הכדורים הצלולים ב 100 μL של חיץ ריבוזום על קרח באמצעות מוט ערבוב מגנטי (3 מ”מ אורך, 10 mM) על stirrer מגנטי באמצעות המהירות הנמוכה ביותר האפשרית. לאסוף את ribosomes resuspended ולשטוף את הצינורות עם 50 μL נוסף של חיץ ריבוזום.הערה: קשה לראות את הכדור שקוף. לכן, בזהירות לשטוף את הכדור מצדי הצינור. קבע את ריכוז הריבוזום על ידי מדידת הספיגה ב- 260 ננומטר של המדגם המדולל ביחס של 1:100 במאגר ריבוזום. ספיגה של 10 של הפתרון מדולל מתאים 23 μM של פתרון לא מדולל כפי שתואר בעבר16. ליישם ריכוז מלאי סופי של 10 מיקרומטר. כדי להתאים את הריכוז, לדלל את הריבוזומים עם חיץ ריבוזום או לרכז אותם עוד יותר על ידי צנטריפוגה ב 14000 x גרם במסנן צנטריפוגלי 3 kDa ב 4 °C (7 °F).הערה: כדי להשיג ביטוי מערכת אופטימלי, בצע טיטציה ריבוזום (סעיף 5.2, טבלה משלימה 7). אמת את הרכב הריבוזום עם SDS-PAGE (איור 3A) כמפורט בסעיף 1.3.3. לדלל 2.5 μL של המדגם עם 7.5 μL של מים, לערבב עם 10 μL של 2x Laemmli חוצץ, ולאחר מכן לטעון 5 μL ו 2.5 μL של הדגימות לג’ל. 4. פתרון אנרגיה הערה: ההרכב עבור פתרון האנרגיה 2.5x שהוצג כאן הוא דוגמה לפתרון שעבד היטב עבור תגובת TX-TL סטנדרטית. כדי לייעל את התזמון, הכינו את פתרון האנרגיה במהלך היום השני. הכנת פתרון חומצת האמינו מוסברת בפירוט, ואחריה הליך ההכנה הסופי. תמיסה של חומצות אמינוהערה: הכן את תמיסה חומצת אמינו בכמויות גדולות. הכנת כמות פתרונות מלאי חומצות אמינו הנדרשות לנפח סופי של לפחות 2000 μL יפחית את שגיאת השקילה עבור כמויות קטנות מאוד אחרת. הריכוז הכולל של תמיסת חומצת האמינו מוגבל על ידי מסיסות של חומצות האמינו וריכוזים פתרון מלאי בהתאמה. עבור מערכת PURE הסטנדרטית, להכין פתרון עם ריכוז סופי של 3.25 מ”מ. השתמש בטבלת חישוב הפתרון של חומצות האמינו (טבלה משלימה 3) כתבנית. השתמש ציסטאין בצורת מלח כדי להבטיח מסיסות מספקת. הימנע משימוש בשיטות הכנת חומצות אמינו מבוססות KOH. ניתן לשקול ישירות את הכמויות המדויקות של חומצות אמינו לתוך פתרון חומצת האמינו הסופית מבלי להכין פתרון מלאי עבור כל חומצות האמינו. עם זאת, זה יותר מאתגר ופחות מדויק. הכן פתרונות מלאי עבור כל חומצת אמינו כמתואר בטבלה משלימה 3, למעט טירוצין.הערה: בשל המסיסות השונות של חומצות האמינו במים, הריכוזים המוצעים בהתאמה של פתרון המלאי שונים. מסה מינימלית [mg] מספקת את המסה המינימלית המשוערת הנדרשת כדי להשיג כמות מספקת של פתרון מלאי עבור הנפח הכולל היעד, כהפניה.הערה: המסה המינימלית מחושבת עם עודף של 10%. להכנת קל יותר של הפתרונות, לא לשקול את הכמות המדויקת של חומצת אמינו, אלא, עבור המסה בהישג יד, להתאים את כמות המים כדי להשיג את הריכוז הרצוי. חשב את כמות המים המהותים (מים להוספה [μL], בהתבסס על המסה בפועל שמילאה (תאים צהובים בהירים) והריכוז הרצוי באמצעות הגיליון האלקטרוני בטבלה המשלימה 3. Solubilize פתרונות מלאי חומצות אמינו על ידי מערבולת עד כל המשקעים נמס. פתרונות מלאי חומצות אמינו בודדים ניתן לאחסן ב -20 °C (50 °F) במשך מספר שבועות.הערה: כמה חומצות אמינו קשה להתמוסס במים; התהליך עשוי להימשך זמן מה. שקול את הכמות המדויקת של טירוצין הנדרש כדי לקבל ריכוז סופי של 3.25 מ”מ ישירות לתוך הצינור עבור פתרון חומצת אמינו.הערה: טירוזין קשה מאוד להתמוסס במים. הוסף אותו ישירות במקום להכין פתרון מניות. הוסף את הכמויות המתאימות של פתרונות מלאי חומצות אמינו ומים כפי שצוין בנפח הסופי כדי להוסיף [μL] עמודה (תאים כחולים בהירים) מערבולת הפתרון היטב. יש לאחסן את תמיסה חומצת אמינו שהושלמו ב-80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף. הכנת פתרון האנרגיההערה: בסך הכל, פתרון האנרגיה 2.5x מכיל 0.75 mM של כל חומצת אמינו, 29.5 מ”מ של מגנזיום אצטט, 250 מ”מ של אשלגן גלוטמט, 5 מ”ר של ATP ו- GTP כל אחד, 2.5 מ”מ של CTP, UTP, ו- TCEP, בהתאמה, 8.75 מ”ג / מ”ל של tRNA מ E. coli MRE 600, 50 mM של קריאטין פוספט, 0.05 mM של חומצה פולינית, 5 מ”מ של זרעונים, ו-125 מ”ר של HEPES. משתמשים בפעם הראשונה להכין את פתרון האנרגיה בקבוצות קטנות של 200 μL. לאחסן את הפתרונות בודדים שהוכנו על-פי טבלה משלימה 4 ב -20 °C (50 °F) או -80 °C (80 °F) לשימוש מאוחר יותר. להפשיר את כל הפתרונות המ מימיים המוזכרים בטבלה המשלימה 5 על הקרח. בינתיים, הכינו את פתרונות המניות לרכיבים הנותרים הרשומים בטבלה המשלימה 4. שמור את כל הפתרונות על קרח לאחר ההכנה.הערה: הוסף 500 μL של RNase ומים ללא DNase ישירות לנביון כדי להמיס את tRNAs ליופילי. מערבבים היטב על ידי מערבולת עדינה; הגבל את ההצינורות כדי להימנע מהצגת RNases. הוסף את הכרכים המחושב (טבלה משלימה 5) של פתרונות מלאי ומים ומערבב היטב באמצעות מערבולת. שמור את הפתרון על קרח בכל עת. מדוד את ה- pH של הפתרון על ידי צנרת 1 μL על רצועת pH, כדי להבטיח כי ה- pH של הפתרון הוא נייטרלי. Aliquot פתרון האנרגיה ב 50-100 μL לכל צינור על קרח ולאחסן ב -80 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף. בעת aliquoting, מערבולת המניה העיקרית לעתים קרובות כדי למנוע את הרכיבים מ- מזרז.הערה: באופן אופציונלי, לבצע בדיקת פעילות של פתרון האנרגיה החדש נגד פתרונות אנרגיה מסחריים, למשל פתרון A ב- PURExpress. אם נצפתה ביצועים נמוכים משמעותית של המערכת עם פתרון האנרגיה, אופטימיזציה של ריכוזי היונים, במיוחד יוני מגנזיום, על ידי טיטציה (5-20 מ”מ) עשויה להיות יתרון. 5. תגובה טהורה של OnePot תבנית DNAהערה: חלבונים המקודדים במורד הזרם של מקדם T7 יכולים לבוא לידי ביטוי ב- PURE מדנ”א ליניארי או מעגלי. על-ידי יצירת תבנית DNA ליניארית באמצעות PCR מאריך, ניתן להשמיט שלבי שיבוט מייגעים. התבניות הליניאריות למחקר זה נוצרו על ידי PCR כמתואר להלן, באמצעות פולימראז DNA בעל אמינות גבוהה (טבלה של חומרים). רצפי פריימר, טמפרטורות נמסות והגדרות התרמוציקלר המשמשות במחקר זה מצוינות בטבלה משלימה 6. הכנת תבנית ה- DNA אינה כלולה בלוח הזמנים היומי. הגדר תגובת PCR כפי שהומלץ על ידי ספק פולימראז.הערה: פרמטרים ממוטבים עבור פולימראז DNA בנאמנות גבוהה (טבלת חומרים) ניתנים בטבלה משלימה 6. להגביר את גן היעד (לדוגמה, eGFP) כתבנית ליניארית מפלסמיד או מגנום באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים (500 ננומטר) (עבור הפרמטרים, ראה טבלה משלימה 6). ההגברה יוצרת הרחבות קצרות כדי לספק רצפי חישול עבור שלבי הסיומת הבאים של PCR. בדוק את האמפליקון על ג’ל אגרוז לגודל וטוהר נכונים. השתמש ב- DNA המוגבר כתבנית עבור שלבי ההרחבה הבאים. הגדר תגובה של לפחות 50 μL. הפעל 10 מחזורי הגברה PCR עם פריימרים הרחבה (2.5 ננומטרים). לאחר השלמת מחזורי ההגברה, מיד להוסיף את הפריימרים הסופיים (500 ננומטר) לאותה תגובה ולהפעיל 30 מחזורים כדי להגביר את מוצר PCR המורחב. מצא את הטמפרטורות הנמסות ורצפי פריימר בטבלה משלימה 6. לטהר את שברי ה- DNA באמצעות ערכת טיהור DNA ולחמוק ה- DNA במים ללא נוקלאז במקום EDTA המכיל חוצץ elution. בדוק את התבנית הליניארית על ג’ל אגרוז לגודל וטוהר נכונים. למדוד את ריכוז ה- DNA בng/ μL באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. הגדרת תגובת PUREהערה: הרכב התגובה הסופי הוא פתרון אנרגיה 1x, ריבוזומים ללא תגים או ריבוזומים התג שלו, חלבוני OnePot PURE ותבנית DNA. יחס נפח התגובה כולל 40% תמיסת אנרגיה, 30% חלבון ופתרון ריבוזום, ו-30% DNA ומים. נפחי תגובה אופייניים משתנים בין 5 μL ו 25 μL. לכמת את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ברציפות על צלחת קורא. השתמש ליס ירוק in vitro מערכת תיוג תרגום, המשלבת שאריות ליסין בעלות תווית פלואורסצנטית בחלבונים מסונתזים חדשים, כדי לאמת את הביטוי של חלבונים שאינם פלואורסצנטיים על ג’ל SDS-PAGE. תבנית תגובה לדוגמה ניתנת ב- טבלה משלימה 7 כדי לעזור לבסס תגובת חופש תאי טהורה. תאים בצהוב מציינים ערכי קלט משתמש, ותאים בכתום מציינים ריאגנטים נוספים שיש להוסיף באופן אופציונלי לתגובה. שמור על יחסי עוצמת הקול של הרכיבים מדויקים כדי להבטיח את מאזן היונים הנכון. לדוגמה, כדי להשיג ריכוז חלבון גבוה יותר, להגדיל את ריכוז פתרון חלבון OnePot; עם זאת, אין להגדיל את נפח תמיסה חלבון הוסיף לתגובה.מלא את הריכוז [ng/μL] ואת האורך [זוגות הבסיס] של ה- DNA בתאים הצהובים המתאימים בגיליון האלקטרוני. השתמש 2-10 ננומטר של DNA לתגובה. מלא את עוצמת התגובה הכוללת הרצויה ב- μL. מוציאים את ריאגנטים הנדרשים מהמקפיא ומפשירים אותם על קרח.הערה: פשירה חוזרת של הרכיבים אפשרית ללא ירידה בפונקציונליות. עם זאת, למזער את מספר מחזורי הפשרת הקפאה ואת דגימות הזמן מאוחסנים על קרח ככל האפשר. Pipette כמויות מחושבות של מים, DNA, פתרון אנרגיה לצד אחד של צינור PCR או פינה אחת של באר על צלחת 384-באר. הוסף את הכמות הנדרשת של כל ריאגנט נוסף באותו צד. מזער את מספר הדגימות לניסוי כדי למנוע אידוי מדגם והטיית זמן התחלה ניסיונית.הערה: חשוב לשמור על רכיב האנרגיה מופרד פיזית מרכיבי החלבון כדי למנוע צריכה מוקדמת של מקורות האנרגיה והתשואות הנמוכות יותר. Pipette את הכמויות המחושב של חלבון ופתרון ריבוזום לצד השני של צינור PCR או הפינה הנגדית של צלחת 384-well.הערה: השתמש בתערובות אב במידת האפשר כדי להפחית את ההשפעה של שגיאות צנרת. לאחר בדיקה ראשונית, ניתן לערבב את פתרונות הריבוזום והחלבון כפתרון אחד. ספין לזמן קצר (30 s) כדי למזג את רכיבי התגובה. כדי למנוע אידוי במהלך ניסויים קורא צלחת, להוסיף 35 μL של שעווה נוזלית ולאטום את הצלחת עם איטום שקוף (ראה טבלה של חומרים). דגירה למינימום של 3 שעות ב 37 °C (50 °F). לקריאה על קורא לוחות, מדדו את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך הגל הנדרש כל 2 דקות (התוצאות הייצוגיות מוצגות באיור 3B). בצע את השלבים הבאים עבור דוגמאות עם תווית גרין ליס. לאחר ביטוי חופש התא, לדגור על המדגם עם 0.16 מיקרוגרם / μL של RNase A במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F) כדי להסיר את הרקע הפלואורסצנטי של ערכת תיוג גרין ליס.הערה: השתמש RNase A, כמו סוגים אחרים של RNases לא להסיר את הרקע מספיק טוב. דמיינו את ביטוי החלבון על-ידי הפעלת SDS-PAGE כמפורט בסעיף 1.3.3. לשטוף את הג’ל לא מזוהם בעדינות במים deionized, ולדמות אותו על תמונה פלואורסצנטית באמצעות אורך גל עירור של 488 ננומטר. לאחר מכן, להכתים את הג’ל באמצעות שיטות הכתמה קומאסי קונבנציונאלי. לפרמטרים המתאימים ראו סעיף 1.3.3.הערה: בצעו טיטורציה של תמיסת החלבון עם ריכוז ריבוזום מומלץ, ובמידת הצורך, ריבוזומים titrate עם ריכוז חלבון OnePot אופטימלי לאחר מכן. השתמש בערכת PURExpress ΔRibosome המסחרית כשליטה חיובית. פתרון A, פקטור מיקס, ופתרון ריבוזום תואמים את האנרגיה המוכנה, פתרון חלבון OnePot, ואת ribosomes מטוהר, בהתאמה.
Representative Results
הפרוטוקול לעיל נועד להקל על הקמת מערכת TX-TL ללא תאים טהורה בכל מעבדה. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של הכנת שלושת החלקים המובהקים של מערכת PURE: חלבון OnePot, ריבוזום ופתרון אנרגיה. לוח זמנים יומי מפורט, הממטב את זרימת העבודה, מוצג בטבלה 1. זרימת העבודה ממוטבת לטיהור ריבוזומים מתויגים שלו, ומסגרות זמן עשויות להשתנות מעט אם מתבצע טיהור ריבוזום ללא תגים. הכנה אחת מספקת כמות מספקת של PURE למינימום של חמש מאות תגובות μL. יתר על כן, הפתרונות המוכנים יציבים במשך יותר משנה ב -80 °C (80 °F) ויכולים לעמוד במחזורי הפשרת הקפאה מרובים. רמות ביטוי יתר נאותות עבור כל הזנים חיוניות לפונקציונליות של פתרון החלבון הסופי. איור 1 מראה ביטוי יתר מוצלח בכל 36 הזנים הבודדים המשמשים לאחר מכן להכנת חלבון OnePot. השונות בעוצמות הרצועה של החלבונים המבוטאים יתר על המידה התרחשה ככל הנראה בשל הטיה בטעינת נפחים על ג’ל SDS-PAGE. גדלי החלבון הצפויים מסוכמים בטבלה 2. GlyRS ו- PheRS מורכבים משני תת-קבוצות של משקולות מולקולריות שונות; 34 החלבונים הנותרים מורכבים מתת-יחידה. המפתח לפשטות וליעילות הזמן של פרוטוקול זה הוא שלב השיתוף והטיהור המשותף(איור 2). תמיסת החלבון OnePot הוכנה על ידי הגדלת היחס בין זן EF-Tu ביחס לכל זני הביטוי האחרים. ההרכב הכולל של החלבונים הסופיים נותח על ידי SDS-PAGE (איור 3A). מן הג’לים (נתיבים 2, 3), ניתן להבחין כי EF-Tu (43.3 kDa) קיים בריכוז גבוה יותר בהשוואה לחלבונים האחרים, כצפוי. בעוד הג’ל מספק אינדיקציה ראשונה טובה של יחסי ביטוי חלבון, קשה לקבוע אם ובאותה רמה כל חלבון בודד בא לידי ביטוי. לכן, מומלץ מאוד לאשר את ביטוי יתר בכל זן לפני coculturing, כפי שמוצג לעיל. ה- E. coli ribosome היא מכונה מולקולרית מורכבת המורכבת מ-50 תת-שותפים בודדים של חלבונים23. ספקטרום ספיגה מייצג של 260 ננומטר לטיהור ריבוזום ללא תגים מוצג באיור 4; הפסגה השלישית אופיינית לאלוטיון ריבוזום מוצלח. בשתי שיטות הטיהור של ריבוזום, נצפתה תבנית הריצה הצפויה בג’ל SDS-PAGE (איור 3A)18. ראינו זיהומים בשני הטיהורים, אם כי בכמויות קטנות (<10%). ראוי לציין כי מזהמים שונים היו נוכחים בריבוסומים נטולי תגים (נתיבים 5, 6) ותיוג שלו (נתיבים 11, 12) בשל השונות בשיטה. לעיון המשתמש, ג'לים SDS-PAGE עבור המערכות המשולבות כלולים גם (נתיבים 8, 9 ו- 14, 15). לבסוף, הביצועים של המערכות המוכנות (איור 3) באמצעות גרסאות ריבוזום שונות משווים. קורסי הזמן של ביטוי eGFP במבחנה מראים כי שתי מערכות PURE מתפקדות ומייצרות eGFP פלואורסצנטי. עם זאת, תמיסת החלבון OnePot בשילוב עם הריבוזומים המתויגים שלו, תוך שימוש בריכוז ריבוזום הממוטב על ידי טיטרציה, הניבה רק שליש מרמת הביטוי של גרסת הריבוזום הלא מתויגת (איור 3B). תוצאות דומות נצפו כאשר שלושה חלבונים בגדלים שונים באו לידי ביטוי וסומנו באמצעות ה- Green Lys tRNA במערכת תיוג במבחנה (איור 3C). כפי שניתן לראות על ג’ל פלורסנט, מוצרים באורך מלא באו לידי ביטוי בהצלחה בשתי המערכות; עם זאת, רק כמחצית מרמת הביטוי הושגה עם מערכת ריבוזום התג שלו. בנוסף לתיוג הפלואורסצנטיות, הרצועות הצפויות לכל שלושת החלבונים ניתנות להבחנה על ג’ל מוכתם קומאסי(איור 3D). התוצאות מראות כי מערכת הביטוי שהוצגה, אשר ניתן להכין בתוך שבוע במעבדה עם ציוד סטנדרטי, יכול לשמש לביטוי במבחנה של חלבונים המקודדים במורד הזרם של מקדם T7 מתבניות ליניאריות. איור 1: תוצאות מייצגות לבדיקת הבעת יתר עבור כל זני הביטוי של מערכת PURE. מספרי חלבון טהור וגדלים מסוכמים בטבלה 2. מספרי חלבון 21, 24 ו- 27 מסומנים בכוכב להדמיה טובה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: טיהורחלבונים OnePot. התיאור הסכמטי והתצלומים המתאימים של כל השלבים המעורבים בייצור פתרון החלבון OnePot. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ביצועי המערכות המוכנות באמצעות גרסאות ריבוזום שונות. (A)ג’לים מוכתמים בכחול SDS-PAGE של תמיסת החלבון OnePot (נתיבים 2, 3), ריבוזומים ללא תגים ללא תמיסת חלבון (נתיבים 5, 6) ועם תמיסת חלבון (נתיבים 8, 9), ריבוזומים מתויגים שלו ללא פתרון חלבון (נתיבים 11, 12) ועם תמיסת חלבון (נתיבים 14, 15). שני ריכוזים שונים נטענו לכל דגימה. (B)השוואה של ביטוי eGFP של ריבוזומים מתויגים שלו ריבוזומים ללא תגים. עוצמת הפלואורסצנטיות של ביטוי ה-eGFP במבחנה מנוטרת לאורך זמן לתגובה טהורה באמצעות ריבוזומים ללא תגים (1.8 מיקרומטר, כחול) וריבוזומים מתויגים שלו (0.62 מיקרומטר, אדום). הריכוזים של התבנית הליניארית ופתרון החלבון OnePot היו 4 ננומטרי ו 2 מ”ג / מ”ל, בהתאמה. לוחות (C) ו – (D) מציגים את ג’ל SDS-PAGE של חלבונים מסונתז ב- OnePot עם ללא תגים (1.8 מיקרומטר, כחול, נתיבים 3, 4, 5) וריבוזומים של התג שלו (0.62 מיקרומטר, אדום, נתיבים 6, 7, 8) המסומנים בערכת תיוג של GreenLys במבחנה (C) ומוכתמים בכחול קומאסי(D),בהתאמה. החצים השחורים מצביעים על הרצועות הצפויות של חלבונים מסונתזים: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa). התבנית הליניארית וריכוזים תמיסת חלבון OnePot היו 4 ננומטרי ו 1.6 מ”ג / מ”ל, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: ספקטרום ספיגה ב-260 ננומטר. תוצאות מייצגות של ספקטרום ספיגה ב 260 ננומטר במהלך טיהור אינטראקציה הידרופובית של ריבוזומים ללא תגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: לוח זמנים יומי מותאם לזמן להכנת כל פתרונות OnePot PURE. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: רשימת חלבונים טהורה אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 1: ריאגנטים. הטבלה מפרטת ריכוזים, כרכים ופרטים ספציפיים אחרים של ריאגנטים ורכיבים המשמשים במהלך מחקר זה. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 2: חוצצים. הגיליון האלקטרוני מפרט את הרכבי החיץ המדויקים לחלבון, ריבוזום ללא תגים וטיהורי ריבוזום שלו, כמו גם את הריכוזים של פתרונות המלאי המשמשים להכנתם. בנוסף, הוא מחשב את כמויות הרכיבים הנדרשות בהתבסס על אמצעי האחסון של המאגר. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 3: חישובי חומצות אמינו. הגיליון האלקטרוני מפרט את חומצות האמינו ואת ריכוזי תמיסת המלאי המומלצים הנדרשים לפתרון האנרגיה. הוא מחשב את כמות המים שיש להוסיף לכל חומצת אמינו בהתבסס על המסה השוקלת בפועל, וגם מחשב את נפח תמיסת חומצת האמינו שיש להוסיף לתערובת חומצות האמינו הסופית. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 4: פתרונות מלאי לפתרון האנרגיה. הטבלה מפרטת את הריכוזים והנפחים של פתרונות מלאי הדרושים לפתרון האנרגיה ומציינת פרטים נוספים, כולל תנאי אחסון. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 5: פתרון אנרגיה. הטבלה מפרטת את רכיבי פתרון האנרגיה ואת הריכוזים המומלצים שלהם. בנוסף, הוא מחשב את הנפחים הנדרשים שלהם כדי להוסיף לפתרון הסופי בהתבסס על ריכוזי פתרון המלאי שלהם ואת נפח פתרון האנרגיה. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 6: PCR. הטבלה מפרטת רצפים וריכוזים של הפריימרים המשמשים להרחבת PCR ומציינת טמפרטורות נמסות וצעדי תרמוציקלר הממוטבים לפולימראז DNA בעל אמינות גבוהה. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה משלימה 7: תגובה טהורה. הגיליון האלקטרוני מציג הגדרה לדוגמה של תגובת PURE. הוא מפרט את הריכוזים והנפחים המשמשים של הרכיבים לתגובה טהורה באמצעות ריבוזומים ללא תגים או ריבוזומים של התג שלו. יתר על כן, הוא מחשב את יחסי הנפח עבור חלבון ו titrations ריבוזום. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה פשוטה, זמן וחסכונית להכנת מערכת ביטוי PURE רב-תכליתית20 המבוססת על הרכב סטנדרטי15. על ידי ניצול הפרוטוקול יחד עם לוחות הזמנים היומיים שסופקו (טבלה 1), כל הרכיבים יכולים להיות מוכנים בשבוע אחד ותשואה סכומים מספיקים עד חמש מאות תגובות μL PURE. מאחר שהחלבונים המשמשים בפרוטוקול זה מתבטאים יתר על המידה מפלסמידים בעלי העתקה גבוהה ויש להם רעילות נמוכה ל- E. coli, רמות ביטוי טובות נצפות עבור כל החלבונים הנדרשים (איור 1). זה מאפשר התאמה קלה של זנים, ולכן גם הרכב חלבון cocultures, פשוט על ידי שינוי היחסים של זני החיסון20. מלבד החלבונים ריבוזומליים, הריכוז של EF-Tu הראה להיות בעל חשיבות בסיסית לביטוי תשואות6. לעומת זאת, לשינויים בריכוז רכיבי החלבון האחרים הייתה השפעה נמוכה יחסית על החוסן של מערכת PURE7,24. לכן, על ידי התאמת יחס החיסון של EF-Tu ביחס לכל שאר הרכיבים, ניתן להשיג הרכב דומה להרכב PURE הסטנדרטי, וניתן להשיג מערכת PURE עם תשואה דומה20. בהכנת תמיסת החלבון, חשוב לוודא שכל הזנים יגדלו היטב וידחסו יתר על המידה את החלבון המקודד לאחר האינדוקציה (איור 1).
פונקציית ריבוזום היא המפתח לביצועים הכוללים של מערכת PURE24. בפרוטוקול זה מודגמות שתי שיטות שונות להכנת פתרון ריבוזום, כלומר, טיהור ריבוזום ללא תגים ותיוג שלו. טיהור ריבוזום ללא תגים מבוסס על כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית ואחריה צנטריפוגה עם כרית סוכרוז, הדורשת גישה למערכת טיהור FPLC ו- Ultracentrifuge15. לעומת זאת, השיטה המשתמשת ריבוזומים מתויגים18 ו טיהור כרומטוגרפיה זיקה זרימת הכבידה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לבצע אותה ברוב המעבדות. השיטה השנייה, אם כן, מביאה יתרונות כגון פשטות ונגישות. עם זאת, ראינו תפוקת סינתזה נמוכה משמעותית בעת שימוש בריבוסומים המתויגים שלו ב- OnePot PURE בהשוואה לגרסה נטולת התגים (איור 3). בהתבסס על סוג היישום, תשואה נמוכה זו עשויה להיות מקובלת.
פתרון האנרגיה מספק את רכיבי המשקל המולקולרי הנמוך ואת tRNAs הנדרשים כדי לתדלק תגובות TX-TL במבחנה. פרוטוקול זה מספק מתכון לפתרון אנרגיה טיפוסי, אשר ניתן להתאים בקלות בהתבסס על צרכי המשתמש. יחד עם tRNA, NTP, ו קריאטין פוספט, השפע והריכוז של Mg2 + יונים היו חיוניים לביצועים הכוללים של מערכת PURE8, כפי שהם קופקטורים קריטיים עבור תמלול ותרגום. במקרים מסוימים, טיטציה של יונים יכול, אם כן, לשפר מאוד את הביצועים הטהרים הכוללים. שלמות ה- DNA חיונית לביצועים טהורים. לכן, רצף אימות אזור המקדם, אתר כריכת ריבוזום וגין היעד והבטחה שריכוז דנ”א הולם (<2 נ"מ) יסייע לפתור בעיות שעלולות להתעורר בעת הגדרת תגובת PURE.
מערכת PURE היא מערכת TX-TL מינימלית, ויישומים ספציפיים עשויים לדרוש התאמות נוספות25. אלה עשויים לכלול שילוב RNA פולימראז שונים9,26,מלווים 13, וגורמי חלבון כגון EF-P או ArfA8. למרות שזני הביטוי של חלבונים אלה יכולים להיכלל בקוקולטורות, הוספתם בנפרד למערכת המוכנה עשויה לספק שליטה טובה יותר ברמות החלבון הנדרשות. יתר על כן, הכללת שלשלות חיונית לייצור חלבונים ממברנה10,11. חמצון במקום הפחתת סביבות ואיזומראז קשר דיסולפיד מקלים על היווצרות קשר דיסולפיד תקין, אשר, למשל, נדרשים לחלבונים הפרשתיים12.
זה חיוני כדי להבטיח כי כל רכיבים נוספים לא להפריע לתגובה. הגורמים החשובים ביותר שיש לשים לב אליו בעת הגדרת תגובה או הוספת רכיבים אחרים מפורטים להלן. ודא כי לא מאגרים לא תואמים משמשים או ריכוזי היונים מופרעים. הימנע מפתרונות המכילים גליצלול, ריכוזים גבוהים של אשלגן, מגנזיום, יוני סידן, אוסמוליטים, pyrophosphate, אנטיביוטיקה, או EDTA, ככל האפשר. לדוגמה, החלפת מאגר חמקמק במים במהלך טיהור DNA יכול להיות מועיל כמו EDTA הוא תוסף נפוץ במאגר זה. אספקת הפתרונות עם מולקולות נוספות טעונות שליליות כגון NTP או dNTP דורש התאמת ריכוז המגנזיום8, כמו המולקולות טעונות שליליות להתנהג כמו סוכני כלה ולאגד מולקולות טעונות חיובית. pH נייטרלי הוא אידיאלי עבור התגובה. בהתאם לכך, יש לאגור את כל הרכיבים ל- pH המתאים; זה חשוב במיוחד עבור מולקולות חומציות מאוד או בסיסיות כגון NTPs. לבסוף, טמפרטורה ונפח הם פרמטרים מרכזיים לתגובה. כדי להשיג תשואה טובה, יש ליישם טמפרטורה סביב 37 °C (50 °F), כמו טמפרטורות מתחת 34 °C (50 °F) יפחיתו באופן משמעותי את התשואה 27 °C(50°F).
ראוי לציין כי לפני הכנת OnePot PURE, יש לשקול את יישום היעד ואת הדרישות הנלוות, כגון נפח, טוהר, קלות שינוי, והכללה או השמטה של רכיבים. עבור יישומים רבים, המערכת תהיה בחירה מצוינת, אך אחרים עשויים לדרוש תשואות, כוונון וגורמים אחרים, אשר מערכת OnePot אינה יכולה לספק. ללא קשר, הפרוטוקול שהוצג יועיל להכנת כל מערכת תוצרת בית, שכן כל הצעדים הקריטיים להכנה כזו מסוכמים כאן.
אחד היתרונות העיקריים של מערכת OnePot הוא תאימותה למערכת PURExpress הזמינה מסחרית, המספקת את האפשרות לבדוק את הפונקציונליות והשלמות של כל הרכיבים בנפרד על ידי החלפת כל רכיב PURExpress ב- OnePot המקבילה שלו. היתרונות של מערכת OnePot PURE, כגון טונה והכנה קלה, מהירה וחסכונית, יהפכו את TX-TL ללא תאים לנגיש למעבדות נוספות ברחבי העולם ויתרמו להרחבת היישום של פלטפורמה רבת עוצמה זו בביולוגיה סינתטית ללא תאים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת מענק תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי 723106, מענק קרן המדע הלאומית השוויצרית (182019) ו- EPFL.
Materials
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Bio-Rad Laboratories | 1610732 | |
| 15 mL centrifuge tubes | VWR International | 525-0309 | |
| 384-well Black Assay Plates | Corning | 3544 | |
| 4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels | Bio-Rad Laboratories | 4561096 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR International | 525-0304 | |
| 96-Well Polypropylene DeepWell plate | Nunc | 260252 | |
| Acetic acid, 99.8 % | Acros | 222140010 | |
| Äkta purifier | GE Healthcare | purification of tag free ribosomes | |
| AMICON ULTRA 0.5 mL – 3 KDa | Merck Millipore | UFC500324 | |
| AMICON ULTRA 15 mL – 3 KDa | Merck Millipore | UFC900324 | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 09718-250G | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Ampicillin | Condalab | 6801 | |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | ThermoFisher | LC5928 | |
| Breathe-Easy sealing membrane | Diversified Biotech | Z380059-1PAK | |
| Centrifuge tubes polycarbonate | Beckman | 355631 | purification of tag free ribosomes |
| Chill-out Liquid Wax | Bio-Rad Laboratories | CHO1411 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | 27920 | |
| DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) | Zymo | ZYM-D4034-200TS | |
| DTT | SantaCruz Biotech | sc-29089B | |
| Econo-Pac Chromatography Columns | Bio-Rad Laboratories | 7321010 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | 03609-250G | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes | VWR International / Eppendorf | 525-0133 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | Falcon | 352051 | |
| Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass | Scilabware | 9141173 | |
| FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System | Promega | L5001 | optional |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | PHR1541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757-1L | |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| HiTrap Butyl HP Column | GE Healthcare | 28411005 | purification of tag free ribosomes |
| IMAC Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-0921-07 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| InstantBlue | Expedeon | ISB1L-1L | |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) | Alfa Aesar | B21149.03 | |
| Laemmli buffer (2x), sample buffer | Sigma-Aldrich | S3401-1VL | |
| Lysogeny broth (LB) media | AppliChem | A0954 | |
| Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M0631 | |
| Magnesium chloride | Honeywell Fluka | 63020-1L | |
| Nickel Sulfate | Alfa Aesar | 15414469 | |
| NTP | ThermoFisher | R0481 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | ThermoFisher | F530S | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-1KG | |
| Potassium glutamate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | NEB | E6800S | |
| PURExpress Δ Ribosome Kit | NEB | E3313S | |
| Quick Start Bradford 1x Dye Reagent | Bio-Rad Laboratories | 5000205 | |
| Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | ThermoFisher | 564-0020 | |
| RNaseA solution | Promega | A7973 | |
| SealPlate film | Excel Scientific | Z369659-100EA | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 6203 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) | Sigma-Aldrich | 646547-10X1mL | |
| Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman | 355631 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | |
| Tris base | ThermoFisher | BP152-500 | |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| Ultracentrifuge Optima L-80 | Beckman | purification of tag free ribosomes | |
| Whatman GD/X syringe filters | GE Whatman | WHA68722504 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100mL |
References
- Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213 (2020).
- Laohakunakorn, N. Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).
- Gaut, N. J., Adamala, K. P. Reconstituting natural cell elements in synthetic cells. Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188 (2021).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. Improved cell-free RNA and protein synthesis system. PLoS One. 9 (9), 106232 (2014).
- Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system. Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).
- Li, J., et al. Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system. Translation. 5 (1), 1327006 (2017).
- de Maddalena, L. L., et al. GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system. ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).
- Kuruma, Y., Ueda, T. The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).
- Niwa, T., et al. Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system. Frontiers in Microbiology. 6, 1113 (2015).
- Shimizu, Y., Ueda, T. PURE technology. Methods in molecular biology. 607, 11-21 (2010).
- Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. Directed evolution of glycopeptides using mRNA display. Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).
- Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).
- Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).
- Shepherd, T., et al. De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).
- Lavickova, B., Maerkl, S. J. A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
- Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 37 (2), 15 (2009).
- Gesteland, R. F. Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system. Molecular Systems Biology. 5, 297 (2009).
- Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes. Nature Communications. 11 (1), 904 (2020).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).
- Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. A partially self-regenerating synthetic cell. Nature Communications. 11 (1), 6340 (2020).
Cite This Article
Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).