OnePot PURE Hücresiz Sistem

NOT: Bu protokol, rekombinant bileşenlerden hücresiz TX-TL sisteminin hazırlanmasını açıklar. Kolaylık sağlamak için, iş beş bölüme ayrılır. İlk bölümde, protokole başlamadan önce yapılması gereken hazırlık adımları açıklanmaktadır. İkinci bölümde OnePot protein çözeltisinin hazırlanması açıklanmaktadır. Üçüncü bölümde ribozom saflaştırmaları, dördüncü bölümde enerji çözeltisinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanır ve son bölüm PURE reaksiyonu kurmak için bir kılavuz sağlar. Kolaylık sağlamak için, protokoller günlere ayrılır ve Tablo 1’dekigünlük programlarda özetlenir. Programa uygun olarak, tüm sistem bir kişi tarafından 1 haftada hazırlanabilir. 1. Ön çalışma Ek Tablo 1’de açıklandığı gibi bakteri kültürü medya ve medya takviyelerini hazırlayın. Pipet uçları, 96 derin kuyu plakası da dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin. Gerinim hazırlığı Tablo 2’de belirtilen ifade gerinimlerini ısı şoku yöntemini kullanarak ilgili ifade vektörleriyle dönüştürün. Kimyasal olarak yetkin bakterilere saflaştırılmış plazmid ekleyin ve 20-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Karışımı 30 s (ısı şoku) için 42 °C’ye yerleştirin ve ardından 2 dakika boyunca tekrar buza yerleştirin. Pipet 20 μL bakteri doğrudan ampisilin (AMP) içeren agar plakalarına ve bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yaslayın. Tabakları 4 °C’de 1 haftaya kadar saklayın. AMP içeren 3 mL LB medyayı agar plakalarından tek bir bakteri kolonisi ile aşılayın. Bir gecede 260 rpm’de sallanırken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. Kültürün 250 μL’sini (v/v) gliserolden oluşan 250 μL ile karıştırın ve -80 °C’de saklayın.NOT: Gelecekte daha hızlı hazırlık için, suşları gliserol stokları olarak 96 kuyulu bir tabakta saklayın. Koloni PCR ve sıralama ile tüm vektör dönüşümlerini onaylayın. Geni, promotör bölgesini ve ribozom bağlama bölgesini sıralayın. İfade testi 300 μL LB ortam içeren LB ortamını, hazırlanan gliserol stoklarının yaklaşık 1 μL’si ile 1,3 mL derin kuyu plakasında aşıla. Plakayı nefes alabilen bir zarla kapatın ve gece boyunca 260 rpm’de sallanırken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın.NOT: Tüm ifadeler bu noktada ayrı ayrı yapılır. 300 μL taze LB ortam aşılayarak AMP içeren ve 1 μL geceleme kültürüne sahip. Bir gecede 260 rpm’de sallanırken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. 2 saat sonra, hücreleri 100 μM İzopropil β-D-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) ile indükle ve ek 3 saat büyür. Kültürün 10 μL’sini 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve 10 dakika boyunca 95 °C’ye ısıtın. Bir masa santrifüjü kullanarak numuneleri 1 dakika döndürün ve bir PAGE jeline 10 μL süpernatan yükleyin. Jeli Tris/Glicine/SDS tamponunda 200 V’ta 30 dakika çalıştırın. Deiyonize su ile iyi durulayın. Jeli bir Coomassie protein lekesi ile örtün ve 1 saat kuluçkaya yatırın. Gerekirse jeli suda çözün (Şekil 1’dekiifade testi için temsili sonuçlar).NOT: İyi bir ayırma elde etmek için degrade (%4- veya %4-) PAGE jelleri kullanın. IMAC Sepharose reçine restorasyonu ve temizliği Sütun hazırlığı. Sepharose reçinesini girdapla iyice karıştırın. Pipet gerekli miktarda reçine boş bir yerçekimi akış sütununa.NOT: Gerekli reçine miktarı His-ribozom saflaştırması ile protein saflaştırması arasında değişir ve ilgili bölümlerde belirtilir. Reçineyi 30 mL deiyonize su ile yıkayın. Bölüm 1.4.4’te belirtildiği gibi sütun yeniden şarjı ile devam edin.NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce her zaman tüm sıvının sütundan geçmesine izin verin. Ancak, sütunun hiçbir zaman kuru çalıştığından emin olun. Sütundan herhangi bir sıvı geçirirken, akışı durdurduğundan emin olun veya sıvı reçineye ulaşır ulaşmaz bir sonraki adıma geçin. Restorasyon. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın. 0,2 M EDTA ve 0,5 M NaCl çözeltisinin 10 mL’lik kısmını uygulayın. 0,5 M NaCl çözümünün 30 mL’lik kısmını ekleyin. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın. (v/v) etanolde 4 °C’de saklayın veya bir sonraki adıma geçin. Temizleme.DİkKAT: Koruyucu ekipman giyin. Sütunu 30 mL 0,5 M NaOH ile yıkayın. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın. Kolonu 30 mL 0,1 M asetik asitle yıkayın. Kolonu 30 mL deiyonize su ile yıkayın. Sütunu % 70 (v/v) etanolden 30 mL ile yıkayın. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın. (v/v) etanolde 4 °C’de saklayın veya bir sonraki adıma geçin. Yeniden şarj oluyor. Sütuna 10 mL 0,1 M nikel sülfat çözeltisi ekleyin.DİkKAT: Nikel sülfat toksiktir. Nikel sülfat atıklarının tedarikçi tarafından belirtilen önlemlerle atılması gerekir. Kolonu 50 mL deiyonize su ile yıkayın. 4 °C’de ((v/v)) etanol depolayın veya sütun dengesine devam edin.NOT: Sütun adımlar arasında etanol içinde saklanırsa, sütunu suyla yıkayarak tüm etanol izlerini çıkardığınızdan emin olun. 2. OnePot protein çözeltisi ekspresyonu ve saflaştırma NOT: Protokol günlere ayrılmış üç bölümden oluşur (Şekil 2). İdeal bir hazırlık prosedürü, bin 10 μL’den fazla PURE reaksiyona karşılık gelen 1,5 mL 13,5 mg/mL OnePot protein çözeltisi üretir. Bununla birlikte, çözeltinin miktarı ve ideal konsantrasyonu toplu işlemden toplu işleme değişecektir. Deneyimli kullanıcılar aynı anda birden fazla OnePot PURE hazırlığı gerçekleştirebilir. 1. Gün: Ek Tablo 1’de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın. Pipet uçları, iki adet 96 derin kuyu plakası ve bir adet 1 L şaşkın Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin. Ek Tablo 2’de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize eder ve 4 °C’de saklar. Aksi belirtilmedikçe, kullanmadan hemen önce tüm tamponları 1 mM TCEP ile tamamlar. OnePot protein saflaştırması için 2 mL sepharose reçine kullanın. Sütunu bölüm 1.4’te açıklandığı gibi hazırlayın. Başlangıç kültürlerini hazırlamak için 20 mL LB ortamı 20 μL AMP ile birleştirin. Steril 96, 1,3 mL derin kuyu plakasında, 35 kuyuya 300 μL ortam ekleyin. Uzama faktörü termo kararsız (EF-Tu) hariç her birini kendi suşuyla aşılayın ve plakayı nefes alabilir bir zarla kapatın.NOT: Plakayı 96 kuyulu bir çoğaltıcı kullanarak aşıla (bkz. Malzeme Tablosu). Derin kuyu plakasının kuyu hacmi ve başlangıç kültürünün hacmi esastır. Daha büyük ortam hacimleri veya daha küçük kuyu hacimleri, havalandırma tutarsızlıkları nedeniyle farklı bir bakteri yoğunluğuna yol açacaktır. EF-Tu kültürü için, 14 mL’lik bir kültür tüpünde 3 mL LB medyayı bir kapakla aşıla. EF-Tu için tek bir 3 mL kültür, bir OnePot ifade kültürü için yeterlidir. Bir gecede 260 rpm’de sallanırken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. 2. Gün:NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin. Steril şaşkın şişeye 500 mL LB ortam ve 500 μL AMP aktarın. OnePot PURE kültürünü EF-Tu kültürünün 1675 μL’si ve derin kuyu plakasından kültürlerin her birinin 55 μL’si ile aşıla(Tablo 2).NOT: Bu adım sırasında, genel protein bileşimi aşılama oranları ayarlanarak ayarlanabilir. Genel aşılama hacminin 3,6 mL’de sabit kaldığından emin olun.İsteğE BAĞLI: Tüm suşların bir gecede büyüdüğünü doğrulamak için, bir plaka okuyucu kullanarak 96 kuyulu bir plakada gece kültürlerinin optik yoğunluğunu600nM (OD 600) olarak ölçün. Optik yoğunluk ölçümü için 10x’lik bir seyreltme kullanın. Kültürü 37 °C’de 2 saat boyunca 260 rpm sallayarak veya kültürün OD600’ü 0.2-0.3’e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. 500 μL 0,1 mM IPTG ile kültürü teşvik edin ve ek 3 saat büyüyün. Hücreleri 4 °C ve 3220 x g’da santrifüjleme ile 10 dakika boyunca hasat edin ve hücre peletini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın.NOT: Zamanlamayı optimize etmek için, bölüm 4’te açıklanan enerji çözümünü2. 3. Gün: Aşağıdaki adımlarda açıklanan saflaştırma için gereken arabellek miktarlarını ölçün ve Ek Tablo 2’debelirtildiği gibi hepsine TCEP ekleyin. Kalan tamponları TCEP olmadan gelecekteki saflaştırmalar için 4 °C’de saklayın. Yüklü sütunu (bölüm 2.4) 30 mL arabellek A ile dengele. 25 mL arabellek A geçtikten sonra, sütunu alttan kapatın. Buna paralel olarak 2.15-2.17 adımlarına devam edin. Hücreleri çözün ve hücre peletini 7,5 mL tampon A’da yeniden kullanmak için serolojik bir pipet kullanın. Aşağıdaki parametrelerle 130 watt’lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu, prob ucu çapı: 6 mm) kullanan hücreleri lyse: 4 x 20 s darbe açık, 20 s darbe kapalı, 70% genlik. Sonication başarılı olursa, çözüm koyu hale gelecektir (Şekil 2).NOT: Sonication sırasında hücreleri buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun. Probu tüpe dokunmadan çözeltinin içine yeterince derine yerleştirin. Büyük miktarda köpük üretilirse, enerji transferi sönümlenir. Bu durumda, köpüğün yerleşmesine izin verin, probu çözeltinin daha derinlerine haline haline alın ve sonikasyon süresini uzatın. Sonication hemen sonra 4 °C’de 20 dakika boyunca 21130 x g’da santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın. Lisatı buzda tut. Üst katmanı eşdeğer sütuna ekleyin. Sütunu üstten kapatın ve sızıntı olmadığından emin olun. Bir tüp rotator kullanarak sütun 4 °C’de 3 saat boyunca rotasyon altında kuluçkaya yaslayın. İlişkisiz bileşenleri kolondan alın ve 25 mL tampon A ile yıkayın. Sütunu 25 mL 25 mM imidazol tamponu (23,95 mL tampon A ve 1,25 mL B tamponu) ile yıkayın. Proteinleri 5 mL 450 mM imidazol tamponu (0,5 mL tampon A ve 4,5 mL tampon B) ile elute edin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun. Eluat’ı 25 mL HT tampon ile seyreltin, karışımı buzda tutun. 15 mL santrifüj filtreye 15 mL ekleyin ve 1,5 mL hacme konsantre edin. Kalan 15 mL’yi konsantre çözelti ile filtreye ekleyin ve bir kez daha 1,5 mL’ye konsantre edin. Konsantre numuneye 10 mL HT tampon ekleyin ve 1 mL’ye konsantre edin. Eşit miktarda stok tamponU B ekleyin ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın.NOT: Bir tur değişim/konsantrasyon, 4 °C’de 3220 x g’da yaklaşık 60 dakika döner. Arabellek değişimi sırasında, sütun bölüm 1.4’te belirtildiği gibi geri yükleyin. 4. Gün: Tedarikçi tarafından açıklandığı gibi Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün. Numuneyi 0,5 mL 3 kDa kesme santrifüj filtresi ile 20 mg/mL’ye konsantre edin.NOT: Bradford testini aşırı doymamak için konsantrasyon ölçümlerinden önce protein çözeltisini 25 kat veya 50 kat seyreltin. İdeal protein konsantrasyonu oluşturmak için, bu aşamada (bölüm 5.2) protein çözeltisinin farklı konsantrasyonlarında bir ifade testi gerçekleştirin. Titrasyon yapmak için, çözeltinin toplam hacmini sabit tutun ve stok tampon B de dahil olmak üzere OnePot protein çözeltisini beş farklı oranda pipetlayın(Tamamlayıcı Tablo 7). SDS-PAGE (Şekil 3A) kullanarak OnePot PURE protein bileşimini doğrulayın. Numunenin 2,5 μL’sini 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL’yi jel içine yükleyin. Bölüm 1.3.3’te belirtildiği gibi SDS-PAGE’i çalıştırın. Aliquot protein çözeltisi 50 μL aliquots ifadeyi doğruladıktan ve konsantrasyonu ayarladıktan sonra. OnePot PURE protein çözeltisini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın.NOT: Bir protein bileşeninin bulunmadığından şüphelenilirse veya OnePot PURE’da beklenenden daha düşük bir konsantrasyonda varsa, aşağıdaki adımları uygulayın. Tüm kültürlerin optik yoğunluk ölçümlerini (OD600)gerçekleştirerek, ilgili türün geceleme kültürünün diğer kültürlerle karşılaştırılabilir bir oranda büyüyüp büyümediğini kontrol edin. Şüpheli proteinin ifadesini doğrulamak için belirli bir suşun ek bir ifade testini gerçekleştirin. 3. Ribozom çözeltisi NOT: Biri heksahistidin etiketli, diğeri etiketsiz ribozomlar için olmak üzere iki farklı ribozom saflaştırma stratejisi getirilmiştir. Standart bir benzeşim Ni-NTA yerçekimi akış sütununda His-saflaştırmasını kullanan arıtma yönteminin en büyük avantajı, saflaştırmanın kolay, hızlı olması ve FPLC sistemi ve ultra merkezirifuge gibi ek laboratuvar ekipmanı gerektirmemesidir. Bununla birlikte, OnePot PURE reaksiyonlarındaki protein üretim kapasitesi etiketsiz ribozomlara kıyasla üçte bir civarındadır. Bu nedenle, verilen uygulama için yüksek verim önemli olup olmadığına bağlı olarak ribozom üretimi için yöntemi seçin. Onun etiketli ribozom saflaştırmasıNOT: Bu protokol, Profesör Wang’ın (Columbia Üniversitesi, ABD)18hediyesi olan E. coli RB1 suşunu kullanır. Bu suş, 50S ribozomal proteinin (L7/L12) C terminusuna bir heksahistidin etiketinin genomik olarak yerleştirilmesine sahiptir ve ni-NTA yerçekimi akış sütunu kullanılarak saflaştırılmasına izin verir. Normal verim, beş yüz 10 μL’den fazla PURE reaksiyon için yeterli olan 3,45 μM ribozomların yaklaşık 0,5 mL’dir. 1. Gün: Ek Tablo 1’de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın. Pipet uçları, bir adet 5 L Erlenmeyer şişesi ve bir adet 100 mL Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin. Ek Tablo 2’de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize edin ve 4 °C’de saklayın. 2. Gün: Pipet 5 mL reçine bir sütuna ve bölüm 1.4’te belirtildiği gibi sütunu hazırlayın.NOT: Reçinenin daha yüksek hacmi nedeniyle, restorasyon ve saflaştırma önemli ölçüde daha uzun sürer. Çapraz kontaminasyonu önlemek için ribozom saflaştırma için farklı bir sütun kullanın ve saflaştırmadan önce iyice temizleyin. 100 mL Erlenmeyer şişesinde 35 mL LB ortam aşılayarak E. coli RB1 suşunun bir gecelik kültürünü hazırlayın. 260 rpm’de titrerken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. 3. Gün:NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin. 5 L steril şişeye 2 L LB ortam ekleyin, gece kültürünün 12 mL’si ile aşıleyin ve ardından 260 rpm’de sallanırken 37 °C’de 3-4 saat kuluçkaya yatırın.NOT: Alternatif olarak, 1 L şaşkın şişelerde 4 x 500 mL kültürde bakteriyel kültleme gerçekleştirin. Hücreleri 3220 x g ve 4 °C’de 10 dakika santrifüjleme ile peletle. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın. 4. Gün: Adım 3.1.4’te hazırlanan sütunu dengele. 30 mL lizis tamponu ile. Peletin serolojik pipet kullanılarak 20 mL lizis tamponunda yeniden kullanılması. Aşağıdaki parametrelerle buz üzerinde 130 watt’lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu, prob ucu çapı: 6 mm) olan hücreleri lyse: 11 x 20 s darbe açık; 20 s darbe kapalı, 70% genlik (prosedür ayrıntıları için adım 2.16’ya bakın). Sonication hemen sonra, 4 °C’de 21130 x g’da 20 dakika santrifüjleme ile hücre kalıntılarını çıkarın. Lisatı buzda tut. Üst saltant sütunlara yükleyin ve geçmesine izin verin. Sütunu aşağıdaki lizis ve elüsyon tamponları karışımlarıyla yıkayın. Yıkama 0: 30 mL lizis tamponu kullanın. Yıkama 1: 30 mL 5 mM imidazol kullanın (29 mL lizis tamponu, 1 mL elütion tampon). Yıkama 2: 60 mL 25 mM imidazol kullanın (50 mL lizis tamponu, 10 mL elütion tampon). Yıkama 3: 30 mL 40 mM imidazol kullanın (22 mL lizis tamponu, 8 mL elütion tampon). Yıkama 4: 30 mL 60 mM imidazol kullanın (18 mL lizis tamponu, 12 mL elüsyon tamponu). Ribozomları 7,5 mL elution tamponu ile elute edin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun. 45 mL ribozom tampona 22 μL saf β-mercaptoethanol ekleyin.DİkKAT: β-mercaptoethanol toksiktir. Güvenlik önlemlerini alın ve duman kaputunda çalışın. Eluat’ı 15 mL santrifüj filtreye ekleyin ve 1 mL’ye konsantre edin. Konsantre numuneye 15 mL ribozom tamponu ekleyin ve 1 mL’ye tekrar konsantre olun.NOT: Önceki adımı iki kez tekrarlayın. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın.NOT: Bir tur değişim/konsantrasyon, 4 °C’de 3220 x g’da yaklaşık 60 dakika santrifüjleme gerektirir. Arabellek değişimi sırasında, sütun bölüm 1.4’te belirtildiği gibi geri yükleyin. 5. Gün: Ribozom tamponunda 1:100 seyreltilmiş bir numunenin 260 nM’lik emiciliğini ölçerek ribozom konsantrasyonunun belirlenmesi. Seyreltilmiş çözeltinin 10 absorbans değeri, daha önce açıklandığı gibi 23 μM seyreltilmemiş çözeltiye karşılık gelir16. 3,45 μM’lik son bir stok konsantrasyonu uygulayın. Konsantrasyonu ayarlamak için ribozomları ribozom tamponu ile seyreltin veya 4 °C’de 3 kDa 0,5 mL santrifüj filtrede 14000 x g’da santrifüjleme ile daha fazla konsantre edin.NOT: Optimum sistem ekspresyonu elde etmek için ribozom konsantrasyon titrasyonu gerçekleştirin (bölüm 5.2, Tamamlayıcı Tablo 7). Bölüm1.3.3’tebelirtildiği gibi SDS-PAGE ( Şekil 3A ) kullanarak ribozom bileşimini doğrulayın. Numunenin 2,5 μL’lik kısmını 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL’lik kısmını jel üzerine yükleyin. Etiketsiz ribozom saflaştırmaNOT: Etiketsiz ribozom saflaştırması bir FPLC sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir ve 2 x 5 mL Butil sütunlar ( Malzeme Tablosu ) kullanılarak hidrofobik etkileşim kromatografisitemel alınır. Ribozomlar herhangi bir suştan arındırılsa da, E. coli A19 (Yale CGSC’dekiE. coli Genetik Kaynakları) suşunu kullanmak RNase I silme22nedeniyle avantajlıdır. Saflaştırmayı soğuk bir odada veya soğutma kabininde 4 °C’de gerçekleştirin. Normal verim, beş yüz 10 μL PURE reaksiyona karşılık gelen 10 μM ribozomların yaklaşık 0,5 mL’dir. 1. Gün: Ek Tablo 1’de açıklandığı gibi bakteriyel kültür medyası ve medya takviyeleri hazırlayın. Pipet uçları, 5 L Erlenmeyer şişesi ve 100 mL Erlenmeyer şişesi de dahil olmak üzere gerekli malzemeleri hazırlayın ve sterilize edin. Ek Tablo 2’de açıklandığı gibi tamponlar ve takviyeler hazırlayın. Filtre, şişe üst filtrelerini (0,45 μm) kullanarak tüm tamponları sterilize edin ve 4 °C’de saklayın. 2. Gün: E. coli A19 suşunun bir gecede kültürünü hazırlamak için, 100 mL Erlenmeyer şişesinde 35 mL LB ortam aşıla. 260 rpm’de titrerken 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. 3. Gün: 2 L LB medyayı 5 L steril şaşkın şişeye aktarın, gece kültürünün 30 mL’si ile aşılanın ve ardından 200 rpm’de titrerken 37 °C’de 3-4 saat kuluçkaya yatırın. Hücreleri 4 °C’de 15 dakika boyunca 4000 x g’da santrifüjleme ile pelet. Peletin 25 mL süspansiyon tamponunda yeniden depolayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın. 4. Gün: 3.2.13-3.2.19 adımlarına paralel olarak 3.2.8-3.2.12 adımlarını gerçekleştirin. Aşağıdaki parametrelerle buz üzerinde 130 watt’lık bir prob sonicator (bkz. Malzeme Tablosu ve prob ucu çapı: 6 mm) kullanarak hücreleri çözün ve verin: 12 x 20 s darbe açık; 20 s darbe kapalı, 70% genlik (bkz. adım 2.16 prosedür ayrıntıları). Hücre kalıntılarını 20000 x g’da 4 °C’de 20 dakika santrifüjleme ile derhal çıkarın. Üstnatantı aspire edin ve hacmi ölçün. Amonyum sülfatın son konsantrasyonu 1,5 M’ye ayarlamak ve iyice karıştırmak için eşit miktarda süspansiyon tamponu (yüksek tuz) ekleyin. Çökeltmeyi 20000 x g’da santrifüjleme ile 4 °C’de 20 dakika boyunca çıkarın. FPLC saflaştırmadan önce 0,45 μm poliethersülfon membran şırınna filtresi kullanarak süpernatantı filtreleyin ve filtratı 100 mL’lik bir cam şişede toplayın. Süpernatant’ı her zaman 4 °C’de tutun. Hidrofobik etkileşim kromatografisi saflaştırması için FPLC sistemini aşağıdaki gibi çift Butil sütun (2 x 5 mL) kullanarak kurun. Bu kurulum için, bir sütun birimi (CV) 10 mL’lik bir hacme başvurur. Üç girişe ihtiyaç duyulacaktır: ikisi tampon hattı, biri örnek hat olarak. Temizleyicinin varsayılan ayarları nedeniyle, sırasıyla C ve arabellek D için A1 ve B1 satırlarını ve örnek çizgi olarak A2 satırını seçmek uygundur. Pompa yıkamaları (10 mL/dk) hariç veya aksi belirtilmedikçe varsayılan 4 mL/dk akış hızı uygulayın.NOT: TCEP maliyetli bir reaktif olduğundan, C ve D arabelleklerine karşılık gelen tutarı yalnızca denge adımından sonra ekleyin. Sistemi temizlemek ve önceki saflaştırmalardan kaynaklanan olası kirlenmeyi gidermek için ((v/v)) etanolde bir sistem pompası yıkaması gerçekleştirin. Manuel olarak 0,2 mL/dk akış hızı ayarlayın ve sütunu monte edin. Akışı durdurun. Su ile bir sistem pompası yıkama gerçekleştirin. Kolonu 3 CV su ile yıkayın. Denge: A1 ve A2 girişlerini C tamponu ve B1 girişlerini TCEP olmadan D tamponunda yerleştirin. Bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve sütunu 4 CV tampon C ile dengelayın. C ve D arabelleklerine TCEP ekleyin. 4-5 mL elution fraksiyonlarını toplamak için fraksiyon toplayıcıya 15 mL tüpler veya şeffaf yuvarlak fraksiyon toplayıcı tüpleri hazırlayın. Yükleme: A2 girişini filtrelenmiş numune ile şişeye yerleştirin. Örnek birimin yaklaşık ‘ını sütuna yükleyin. Numuneyi 20 mL TCEP içeren C tamponu ile seyreltin ve numunenin 10 mL’lik kısmını sütuna yükleyin. Seyreltme adımını en az iki kez tekrarlayın ve sütuna mümkün olduğunca fazla örnek yükleyin. Makineye hava emilmemesini sağlamak önemlidir. Yıkama adımı 1: İlişkisiz bileşenleri çıkarmak için 3 CV C tamponu ile yıkayın. Yıkama adımı 2: tampon C ve tampon D 5 CV ile yıkayın. Elution: Toplam elution hacmi 5 CV olan C tamponunun% 50’sini ve D tamponunun% 50’sini uygulayarak ürünü elüte edin. Yıkama adımı 3: Toplam 5 CV hacme sahip% 100 tampon D kullanarak güçlü bir şekilde etkileşime giren tüm kirleticileri elute edin. Örnek fraksiyonun emilim spektrumunu 260 veya 280 nM olarak analiz edin (Şekil 4). İlk tepe, yükleme sırasında ele geçirilmeyen proteinleri ve ilk yıkama adımını gösterir; ikinci tepe, ikinci yıkama adımı sırasında elde edilen kirleticileri gösterir. Üçüncü tepe son ürünü izler ve son tepe güçlü etkileşime giren kirleticileri gösterir. Daha fazla işlem için üçüncü tepe noktasına karşılık gelen tüm örnek kesirleri birleyin. Zor proteinleri her zaman buzda tutun. Kurtarılan fraksiyonu dört polikarbonat ultrasantrifüj tüpünde minder tamponunun 15 mL’sine hafifçe bindirin. Yastık tamponunun 15 mL’sine maksimum 15 mL numune ekleyin. Tüpün ağırlığını iyi dengeleyen olduğundan emin olun. Ribozomları 16 saat boyunca 4 °C’de 100000 x g’da ultracentrifugation ile pelet.NOT: Ultracentrifugation tüplerinde çatlak olmadığından emin olun. Sütunu aşağıdaki gibi temizleyin ve sıfırlayın. 5 mL/dk’lık bir akış hızı iyi çalışır. Tüm girişleri suya yerleştirin ve bir pompa yıkama işlemi gerçekleştirin. Kolonu 2 CV su ile yıkayın. Girişi 0,5 M NaOH çözeltisine yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve daha sonra kolonu 3 CV NaOH ile yıkayın. Girişi suya yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve ardından kolonu 2 CV suda yıkayın. Girişi 0,1 M asetik asit çözeltisine yerleştirin, bir pompa yıkaması gerçekleştirin ve daha sonra kolonu 3 CV asetik asit çözeltisi ile yıkayın. Pompalayın ve kolonu 2 CV su ile yıkayın. Tüm girişleri% 20 ((v / v) etanol içine yerleştirin, bir pompa yıkama adımı uygulayın ve sütunu% 20 ((v / v) etanol çözeltisinin 3 CV’si ile yıkayarak% 20 ((v / v) etanol içinde saklayın.NOT: Sistemin asla kuru veya havada emici olmadığından emin olun. Tamponu asla doğrudan etanol veya etanol tampona uygulamayın. Her zaman arada bir su yıkama adımı ekleyin, aksi takdirde sütunu tıkayan çökeltme riski vardır. Yeterli örnek toplama tüpü eklediğinizden emin olun. 5. Gün: Süpernatant atın ve yarı saydam peleti bozmadan dikkatlice, her peleti 0,5 mL buz gibi ribozom tamponu ile yıkayın. Bu adımı iki kez yineleyin. Mümkün olan en düşük hızı kullanarak manyetik bir karıştırıcı üzerinde manyetik bir karıştırma çubuğu (3 mM çapında, 10 mM uzunluk) kullanarak buz üzerinde 100 μL ribozom tamponunda net peletlerin her birini yeniden dürt. Yeniden sulanan ribozomları toplayın ve tüpleri ek 50 μL ribozom tamponu ile yıkayın.NOT: Yarı saydam peleti görmek zordur. Bu nedenle, peletin tüpün yanlarından dikkatlice yıkayın. Ribozom tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş numunenin 260 nM’sinde emiciliği ölçerek ribozom konsantrasyonunun belirlenmesi. Seyreltilmiş çözeltinin 10’unun emiciliği, daha önce açıklandığı gibi 23 μM seyreltilmemiş çözeltiye karşılık gelir16. 10 μM’lik son bir stok konsantrasyonu uygulayın. Konsantrasyonu ayarlamak için ribozomları ribozom tamponu ile seyreltin veya 4 °C’de 3 kDa santrifüj filtresinde 14000 x g’da santrifüjleme ile daha fazla konsantre edin.NOT: Optimum sistem ekspresyonu elde etmek için ribozom titrasyonu gerçekleştirin (bölüm 5.2, Tamamlayıcı Tablo 7). Ribozom bileşimini bölüm1.3.3’tebelirtildiği gibi SDS-PAGE ( Şekil 3A ) ile doğrulayın. Numunenin 2,5 μL’sini 7,5 μL su ile seyreltin, 10 μL 2x Laemmli tampon ile karıştırın ve ardından numunelerin 5 μL ve 2,5 μL’yi jel için yükleyin. 4. Enerji çözümü NOT: Burada tanıtılan 2,5x enerji çözümünün bileşimi, standart bir TX-TL reaksiyonu için iyi çalışan bir çözüm örneğidir. Zamanlamayı optimize etmek için, 2. Amino asit çözeltisinin hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanır ve ardından son hazırlık prosedürü açıklanır. Amino asit çözeltisiNOT: Amino asit çözeltisini toplu olarak hazırlayın. En az 2000 μL’lik son hacim için gereken amino asit stok çözeltilerinin miktarının hazırlanması, aksi takdirde çok küçük miktarlarda tartım hatasını azaltacaktır. Amino asit çözeltisinin genel konsantrasyonu, amino asitlerin çözünürlüğü ve ilgili stok çözelti konsantrasyonları ile sınırlıdır. Standart PURE sistemi için, 3,25 mM’lik son konsantrasyona sahip bir çözelti hazırlayın. Şablon olarak amino asit çözeltisi hesaplama tablosunu (Tamamlayıcı Tablo 3)kullanın. Yeterli çözünürlük sağlamak için tuz formunda sistein kullanın. KOH bazlı amino asit hazırlama yöntemlerini kullanmaktan kaçının. Tüm amino asitler için stok çözeltisi hazırlamadan amino asitlerin kesin miktarlarını doğrudan nihai amino asit çözeltisine tartmak mümkündür. Ancak, bu daha zorlu ve daha az kesindir. Tirozin hariç, Ek Tablo 3’teaçıklandığı gibi her amino asit için stok çözeltileri hazırlayın.NOT: Sudaki amino asitlerin farklı çözünürlükleri nedeniyle, stok çözeltisinin önerilen konsantrasyonları farklılık gösterir. Minimum kütle [mg], referans olarak hedef genel hacim için yeterli miktarda stok çözümü elde etmek için gereken yaklaşık minimum kütleyi sağlar.NOT: Minimum kütle% 10 fazla ile hesaplanır. Çözeltilerin daha kolay hazırlanması için, tam amino asit miktarını tartmayın, bunun yerine eldeki kütle için istenen konsantrasyonu elde etmek için su miktarını ayarlayın. Ek Tablo 3’tekielektronik tabloyu kullanarak doldurulduğu gerçek kütleye (açık sarı hücreler) ve istenen konsantrasyona bağlı olarak gereken deiyonize su miktarını ([μL] eklemek için su) hesaplayın. Amino asit stok çözeltilerini, tüm çökelti çözünene kadar girdaplayarak çözün. Bireysel amino asit stok çözeltileri birkaç hafta boyunca -20 ° C’de saklanabilir.NOT: Bazı amino asitlerin suda çözülmesi zordur; işlem biraz zaman alabilir. Amino asit çözeltisi için doğrudan tüpe 3,25 mM’lik son bir konsantrasyon elde etmek için gereken tam tirozin miktarını tartın.NOT: Tirozin suda çözünmesi çok zordur. Stok çözümü hazırlamak yerine doğrudan ekleyin. [μL] sütunu (açık mavi hücreler) eklemek ve çözeltiyi iyi bir şekilde girdaplamak için Son hacimde belirtildiği gibi ilgili miktarda amino asit stok çözeltisi ve su ekleyin. Tamamlanan amino asit çözeltisini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın. Enerji çözeltisinin hazırlanmasıNOT: Toplamda, 2,5x enerji çözeltisi her bir amino asidin 0,75 mM’si, 29,5 mM magnezyum asetat içerir, 250 mM potasyum glutamat, her biri 5 mM ATP ve GTP, sırasıyla 2,5 mM CTP, UTP ve TCEP, E. coli MRE 600’den 8,75 mg/mL tRNA, 50 mM kreatin fosfat, 0,05 mM folik asit, 5 mM spermidin ve 125 mM HEPES. İlk kez kullananlar enerji çözeltisini 200 μL’lik küçük gruplar halinde hazırlar. Ek Tablo 5’te belirtilen tüm sulu çözeltileri buz üzerinde çözün. Bu arada, Tamamlayıcı Tablo 4 ‘te listelenen kalan bileşenler için stok çözümlerini hazırlayın. Hazırlık sonrası tüm çözeltileri buzda tutun.NOT: Liyofilize tRNA’ları çözmek için doğrudan şişeye 500 μL RNaz ve DNaz içermeyen su ekleyin. Nazik girdap ile iyice karıştırın; RNases’in tanıtılmasını önlemek için pipetlemeyi sınırlayın. Stok çözeltilerinin ve suyun hesaplanan hacimlerini(Tamamlayıcı Tablo 5)ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın. Çözeltiyi her zaman buzda tutun. Çözeltinin pH’ının nötr olduğundan emin olmak için bir pH şeridine 1 μL pipetleme yaparak çözeltinin pH’ını ölçün. Enerji çözeltisini buz üzerinde tüp başına 50-100 μL’de aliquotlayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de saklayın. Aliquoting yaparken, bileşenlerin çökeltmelerini önlemek için ana stoğu sık sık girdap.NOT: İsteğe bağlı olarak, PURExpress’teki Çözüm A gibi ticari enerji çözümlere karşı yeni yapılan enerji çözümünün bir faaliyet testini gerçekleştirin. Sistemin enerji çözeltisi ile önemli ölçüde daha düşük bir performansı gözlenirse, iyon konsantrasyonlarının, özellikle magnezyum iyonlarının titrasyon (5-20 mM) ile optimize edilmesi avantajlı olabilir. 5. OnePot PURE reaksiyon DNA şablonuNOT: T7 promotörünün aşağı akışında kodlanmış proteinler doğrusal veya dairesel DNA’dan PURE ile ifade edilebilir. Uzantı PCR kullanarak doğrusal bir DNA şablonu oluşturarak, sıkıcı klonlama adımları atlanabilir. Bu çalışmanın doğrusal şablonları, aşağıda açıklandığı gibi PCR tarafından yüksek kaliteli bir DNA polimerazı (Malzeme Tablosu)kullanılarak oluşturulmuştır. Astar dizileri, erime sıcaklıkları ve bu çalışmada kullanılan termosikler ayarları Ek Tablo 6 ‘da belirtilmiştir. DNA şablonunun hazırlanması günlük programa dahil değildir. Polimeraz tedarikçisi tarafından önerildiği şekilde bir PCR reaksiyonu ayarlayın.NOT: Yüksek kaliteli DNA polimeraz(Malzeme Tablosu)için optimize edilmiş parametreler Ek Tablo 6’da verilmiştir. Hedef geni (örneğin, eGFP) genlere özgü astarlar (500 nM) kullanarak plazmid veya genomdan doğrusal bir şablon olarak yükseltin (parametreler için bkz. Ek Tablo 6). Amplifikasyon, aşağıdaki uzantı PCR adımları için tavlama dizileri sağlamak için kısa uzantılar oluşturur. Doğru boyut ve saflık için bir agarose jel üzerindeki amplicon’ı kontrol edin. Sonraki uzantı adımları için yükseltilmiş DNA’yı şablon olarak kullanın. En az 50 μL reaksiyon ayarlayın. Uzatma astarları (2,5 nM) ile 10 PCR amplifikasyon döngüsü çalıştırın. Amplifikasyon döngülerini tamamladıktan sonra, aynı reaksiyona hemen son astarları (500 nM) ekleyin ve genişletilmiş PCR ürününü yükseltmek için 30 döngü çalıştırın. Erime sıcaklıklarını ve astar dizilerini Ek Tablo 6’dabulun. DNA parçalarını DNA arıtma kiti kullanarak arındırın ve DNA’yı elüasyon tamponu içeren EDTA yerine nükleaz içermeyen suda elüte edin. Doğru boyut ve saflık için bir agarose jel üzerindeki doğrusal şablonu kontrol edin. UV-Vis spektrofotometre kullanarak NG/μL’deki DNA konsantrasyonunu ölçün. PURE reaksiyonun ayarlanmasıNOT: Son reaksiyon bileşimi 1x enerji çözeltisi, etiketsiz ribozomlar veya His etiketi ribozomları, OnePot PURE proteinleri ve DNA şablonudur. Reaksiyon hacmi oranı enerji çözeltisi, protein ve ribozom çözeltisi ve DNA ve sudan oluşmaktadır. Tipik reaksiyon hacimleri 5 μL ile 25 μL arasında değişir. Yeşil Lys Kullanın in vitro Bir SDS-PAGE jelinde floresan olmayan proteinlerin ekspresyonunun doğrulanması için floresan etiketli Lizin kalıntılarını yeni sentezlenmiş proteinlere dahil eden Çeviri Etiketleme Sistemi. Örnek bir reaksiyon şablonu Tamamlayıcı Tablo 7 PURE hücresiz ifade reaksiyoni oluşturmaya yardımcı olmak için. Sarı renkteki hücreler kullanıcı giriş değerlerini, turuncudaki hücreler ise isteğe bağlı olarak reaksiyona eklenecek ek reaktifleri gösterir. Doğru iyon dengesini sağlamak için bileşenlerin hacim oranlarını hassas tutun. Örneğin, daha yüksek bir protein konsantrasyonu elde etmek için OnePot protein çözelti konsantrasyonu artar; ancak reaksiyona eklenen protein çözeltisinin hacmini arttırmayın.Elektronik tablodaki ilgili sarı hücrelerde DNA’nın konsantrasyon [ng/μL] ve uzunluğunu [baz çiftleri] doldurun. Reaksiyon için 2-10 nM DNA kullanın. İstenilen toplam reaksiyon hacmini μL olarak doldurun. Gerekli reaktifleri dondurucudan çıkarın ve buzda çözün.NOT: İşlevsellik azalmadan bileşenlerin yeniden freezing mümkündür. Bununla birlikte, donma-çözülme döngülerinin sayısını ve zaman örneklerinin buz üzerinde depolanmasını mümkün olduğunca en aza indirin. Hesaplanan miktarda su, DNA ve enerji çözeltisini PCR tüpünün bir tarafına veya 384 kuyu plakasındaki bir kuyunun bir köşesine pipetlayın. Aynı tarafa gerekli miktarda ek reaktif ekleyin. Numune buharlaşmasını ve deneysel başlangıç zamanı önyargısını önlemek için deney başına numune sayısını en aza indirin.NOT: Enerji kaynaklarının erken tüketimini ve daha düşük verimleri önlemek için enerji bileşenini protein bileşenlerinden fiziksel olarak ayrı tutmak çok önemlidir. Pipet, hesaplanan protein ve ribozom çözeltisini bir PCR tüpünün diğer tarafına veya 384 kuyu plakasının karşı köşesine koyun.NOT: Pipetleme hatalarının etkisini azaltmak için mümkün olduğunda ana karışımları kullanın. İlk testlerden sonra ribozom ve protein çözeltileri karıştırılabilir ve tek bir çözelti olarak saklanabilir. Reaksiyon bileşenlerini birleştirmek için kısa bir süre (30 s) döndürün. Plaka okuyucu deneyleri sırasında buharlaşmayı önlemek için 35 μL sıvı balmumu ekleyin ve plakayı şeffaf bir dolgu macunu ile kapatın (bkz. Malzeme Tablosu). 37 °C’de en az 3 saat kuluçkaya yatırın. Bir plaka okuyucuda okuma için, floresan yoğunluğunu her 2 dakikada bir gerekli dalga boyunda ölçün (temsili sonuçlar Şekil 3B’degösterilmiştir). Green Lys etiketli örnekler için aşağıdaki adımları uygulayın. Hücresiz ifadeden sonra, Green Lys etiketleme kitinin floresan arka planını çıkarmak için numuneyi 37 °C’de 30 dakika boyunca 0,16 μg/μL RNase A ile kuluçkaya yatırın.NOT: Diğer RNase türleri arka planı yeterince iyi kaldırmadığı için RNase A kullanın. Bölüm 1.3.3’te belirtildiği gibi SDS-PAGE’i çalıştırarak protein ifadesini görselleştirin. Lekelenmemiş jeli deiyonize suda hafifçe yıkayın ve 488 nm’lik bir heyecan dalga boyu kullanarak floresan bir görüntüleyicide görüntüleyin. Daha sonra, geleneksel Coomassie boyama yöntemlerini kullanarak jeli lekele. Uygun parametreler için bölüm 1.3.3’e bakın.NOT: Protein çözeltisinin önerilen ribozom konsantrasyonu ile titrasyonunu gerçekleştirin ve gerekirse daha sonra optimal OnePot protein konsantrasyonu ile ribozomları titrat edin. Pozitif kontrol olarak ticari PURExpress ΔRibosome kitini kullanın. Çözelti A, Faktör Karışımı ve ribozom çözeltisi sırasıyla hazırlanan enerjiye, OnePot protein çözeltisine ve saflaştırılmış ribozomlara karşılık gelir.