Бесклеточная система OnePot PURE

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает получение бесклеточной системы TX-TL из рекомбинантных компонентов. Для удобства работа разделена на пять частей. В первой части описываются этапы подготовки, которые должны быть выполнены перед началом протокола. Во второй части описывается приготовление белкового раствора OnePot. Третья часть описывает очистку рибосом, четвертая часть подробно описывает приготовление энергетического раствора, а последняя часть содержит руководство по настройке реакции PURE. Для удобства протоколы разделены на дни и сведены в ежедневные расписания в таблице 1. Следуя графику, вся система может быть подготовлена за 1 неделю одним человеком. 1. Предварительная работа Подготовьте бактериальные питательные среды и добавки к средам, как описано в дополнительной таблице 1. Подготовьте и стерилизуйте необходимые материалы, включая наконечники пипеток, 96 пластин для глубоких скважин. Подготовка штамма Преобразуйте выражения деформации, указанные в таблице 2, с соответствующими векторами выражений с помощью метода теплового удара. Добавьте очищенную плазмиду к химически компетентным бактериям и инкубировать на льду в течение 20-30 мин. Поместите смесь при 42 °C в течение 30 с (тепловой удар), а затем поместите ее обратно на лед на 2 мин. Пипетка 20 мкл бактерий непосредственно на агаровые пластины, содержащие ампициллин (АМФО), и инкубируют при 37 °C в течение ночи. Хранить пластины при 4 °C до 1 недели. Инокулируют 3 мл LB-среды, содержащей AMP, одной колонией бактерий из агаровых пластин. Насиживать при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин в течение ночи. Смешайте 250 мкл культуры с 250 мкл 50% (v/v) глицерина и храните при -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для более быстрой подготовки в будущем храните штаммы в 96-колодезной пластине в виде запасов глицерина. Подтвердить все векторные превращения с помощью колониальных ПЦР и секвенирования. Секвенировать ген, промоторную область и сайт связывания рибосом. Экспресс-тест Инокулируют 300 мкл среды LB, содержащей AMP, примерно 1 мкл подготовленных запасов глицерина в пластине глубиной 1,3 мл. Запечатайте пластину дышащей мембраной, а затем инкубируют при 37 °C, встряхивая при 260 оборотах в минуту в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе все выражения выполняются отдельно. Инокулируют 300 мкл свежей ЛБ среды, содержащей АМП, 1 мкл ночных культур. Насиживать при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин в течение ночи. Через 2 ч индуцируют клетки 100 мкМ изопропила β-D-1-тиогалакопиранозида (IPTG) и растут еще 3 ч. Смешайте 10 мкл культуры с 10 мкл 2x буфера Laemmli и нагревайте до 95 °C в течение 10 мин. Раскрутите образцы в течение 1 мин с помощью настольной центрифуги и загрузите 10 мкл супернатанта на гель PAGE. Запустите гель в буфере Tris/Glycine/SDS при 200 В в течение 30 мин. Хорошо промойте его деионизированной водой. Покрыть гель протеиновым пятном Кумасси и инкубировать в течение 1 ч. При необходимости размяните гель в воде (репрезентативные результаты для экспрессивного теста на рисунке 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте градиентные (4%-15% или 4%-20%) гели PAGE для достижения хорошего разделения. Восстановление и очистка смолы Сефарозы IMAC Подготовка колонны. Хорошо перемешайте смолу Сефарозы путем вихря. Пипетка необходимого количества смолы в пустую колонку гравитационного потока.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимой смолы варьируется между очисткой Гис-рибосом и очисткой белка и указано в соответствующих разделах. Промыть смолу 30 мл деионизированной воды. Перезачисляем плату за колонку, как указано в разделе 1.4.4.ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда позволяйте всей жидкости проходить через колонну, прежде чем переходить к следующему шагу. Однако убедитесь, что колонна никогда не пересыхает. Всякий раз, когда жидкость проходит через колонну, убедитесь, что вы остановили поток или переходите к следующему шагу, как только жидкость достигнет смолы. Восстановление. Промыть колонну 30 мл деионизированной воды. Применяют 10 мл раствора 0,2 М ЭДТА и 0,5 М Раствор NaCl. Добавьте 30 мл раствора NaCl 0,5 М. Промыть колонну 50 мл деионизированной воды. Хранить в 20% (v/v) этаноле при 4 °C или продолжить следующий этап. Чистка.ВНИМАНИЕ: Носите защитное снаряжение. Промыть колонну 30 мл 0,5 М NaOH. Промыть колонну 30 мл деионизированной воды. Промыть колонну 30 мл 0,1 М уксусной кислоты. Промыть колонну 30 мл деионизированной воды. Промыть колонну 30 мл 70% (v/v) этанола. Промыть колонну 50 мл деионизированной воды. Хранить в 20% (v/v) этаноле при 4 °C или продолжить следующий этап. Подзарядка. Добавить в колонку 10 мл раствора 0,1 М раствора сульфата никеля.ВНИМАНИЕ: Сульфат никеля токсичен. Отходы сульфата никеля должны быть выброшены с соблюдением мер предосторожности, указанных поставщиком. Промыть колонну 50 мл деионизированной воды. Хранить в 20% ((v/v)) этаноле при 4 °C или продолжать с уравновешивать колонку.ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонка хранится в этаноле между этапами, обязательно удалите все следы этанола, промыв столб водой. 2. Экспрессия и очистка белкового раствора OnePot ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол состоит из трех частей, разделенных на дни(рисунок 2). Идеальная процедура приготовления производит 1,5 мл 13,5 мг/мл белкового раствора OnePot, что соответствует более чем одной тысяче 10 мкл PURE реакций. Однако количество и идеальная концентрация раствора будут варьироваться от партии к партии. Опытные пользователи могут выполнять несколько препаратов OnePot PURE одновременно. День 1: Приготовьте бактериальные питательные среды и добавки к средам, как описано в дополнительной таблице 1. Подготовьте и стерилизуйте необходимые материалы, включая наконечники пипеток, две пластины из глубоких скважин на 96 и одну 1-литую колбу Эрленмейера. Подготовьте буферы и добавки, как описано в дополнительной таблице 2. Фильтр стерилизует все буферы с помощью бутылочных верхних фильтров (0,45 мкм) и хранит их при 4 °C. Дополняйте все буферы 1 мМ TCEP непосредственно перед использованием, если не указано иное. Используйте 2 мл сефарозной смолы для очистки белка OnePot. Подготовьте столбец, как описано в разделе 1.4. Для приготовления заквасок соедините 20 мл среды LB с 20 мкл AMP. В стерильной пластине глубиной 96, 1,3 мл добавьте 300 мкл среды в 35 скважин. Инокулируйте каждый из них соответствующей деформацией, за исключением термостабильного коэффициента удлинения (EF-Tu), и запечатайте пластину дышащей мембраной.ПРИМЕЧАНИЕ: Привить пластину с помощью репликатора с 96 скважинами (см. Таблицу материалов). Объем скважины глубокой плиты скважины и объем закваски имеют важное значение. Большие объемы среды или меньшие объемы скважин приведут к различной бактериальной плотности из-за несоответствий аэрации. Для культуры EF-Tu привить 3 мл среды LB в культурную трубку 14 мл с защелкиванием колпачка. Одного 3 мл культуры для EF-Tu достаточно для одной культуры выражения OnePot. Насиживать при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин в течение ночи. День 2:ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги при комнатной температуре, если не указано иное. Перенесите 500 мл LB-среды и 500 мкл AMP в стерильную перемешанный колбу. Инокулируют культуру OnePot PURE 1675 мкл культуры EF-Tu и 55 мкл каждой из культур из пластины глубокой скважины(таблица 2).ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе общий состав белка может быть скорректирован путем настройки коэффициентов прививки. Убедитесь, что общий объем прививки остается постоянным на уровне 3,6 мл.ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Чтобы подтвердить, что все штаммы выросли за ночь, измерьте оптическую плотность ночных культур на уровне 600 нМ (OD600)в 96-скважинной пластине с помощью пластинчатого считывателя. Используйте разбавление 10x для измерения оптической плотности. Инкубировать культуру в течение 2 ч при 37 °С с встряхиванием 260 об/мин или до тех пор, пока OD600 культуры не достигнет 0,2-0,3. Индуцируют культуру с 500 мкл 0,1 мМ IPTG и растут еще 3 ч. Собирают клетки центрифугированием при 4 °C и 3220 х г в течение 10 мин и хранят гранулу ячейки при -80 °C до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации сроков подготовьте энергетический раствор, описанный в разделе 4, во время инкубации на 2-й день(таблица 1). День 3: Измерьте количества буферов, необходимых для очистки, описанных на этапах ниже, и добавьте TCEP ко всем из них, как указано в дополнительной таблице 2. Храните оставшиеся буферы без TCEP при 4 °C для будущих очистк. Уравновешивают заряженную колонну (секция 2.4) 30 мл буфера А. После того, как 25 мл буфера А пройдут, закройте колонну снизу. Параллельно переходите к шагам 2.15-2.17. Разморозить клетки и использовать серологическую пипетку для повторного суспендирования клеточной гранулы в 7,5 мл буфера А. Различите ячейки с помощью 130-ваттного зондового ультразвукового аппарата (см. Таблицу материалов,диаметр наконечника зонда: 6 мм) со следующими параметрами: 4 x 20 с импульс включен, импульс 20 с выключен, амплитуда 70%. Если ультразвуковая ю прошла успешно, решение станет темнее(рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки хранятся на льду во время ультразвуковой работы. Поместите зонд достаточно глубоко в раствор, не касаясь трубки. Если образуется большое количество пены, передача энергии будет демпфирована. В этом случае дайте пене осесть, опустите зонд глубже в раствор и продлите время ультразвуковой работы. Удаляют остатки клеток центрифугированием при 21130 х г в течение 20 мин при 4 °C сразу после ультразвуковой обшивки. Держите лисат на льду. Добавьте супернатант в уравновешивающий столбец. Закройте колонну сверху и убедитесь, что нет утечки. Инкубируют колонну в течение 3 ч при 4 °C при вращении с помощью трубчатого ротатора. Элюйте несвязанные компоненты из колонны и промывайте 25 мл буфера А. Промыть колонну 25 мл имидазолового буфера 25 мМ (23,95 мл буфера А и 1,25 мл буфера В). Элюдирует белки с помощью 5 мл имидазолового буфера 450 мМ (0,5 мл буфера А и 4,5 мл буфера В). Всегда держите элюированные белки на льду. Разбавить элюат 25 мл HT буфера, держите смесь на льду. Добавьте 15 мл в центробежный фильтр объемом 15 мл и концентрат в объеме 1,5 мл. Оставшиеся 15 мл добавляют в фильтр с концентрированным раствором и еще раз концентрируют до 1,5 мл. Добавьте 10 мл HT-буфера к концентрированной пробе и сконцентрируйте до 1 мл. Добавьте равное количество запасного буфера B и храните при -80 °C до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Один раунд обмена/концентрации занимает около 60 мин вращения при 3220 х г при 4 °C. Во время буферного обмена восстановите столбец, как указано в разделе 1.4. День 4: Измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, как описано поставщиком. Сконцентрировать образец с помощью отсечкового центробежного фильтра 0,5 мл 3 кДа до 20 мг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте белковый раствор в 25 или 50 раз перед измерениями концентрации, чтобы избежать перенасыщения анализа Брэдфорда. Чтобы установить идеальную концентрацию белка, выполните экспресс-тест на этом этапе (раздел 5.2) с различными концентрациями белкового раствора. Для выполнения титрования держите общий объем раствора постоянным и пипетку белкового раствора OnePot, включая запасной буфер B, в пяти различных соотношениях(Дополнительная таблица 7). Проверьте белковую композицию OnePot PURE с помощью SDS-PAGE(рисунок 3A). Разбавить 2,5 мкл образца 7,5 мкл воды, смешать с 10 мкл 2x буфера Laemmli, а затем загрузить 5 мкл и 2,5 мкл образцов в гель. Запустите SDS-PAGE, как указано в разделе 1.3.3. Аликвотирование белкового раствора в 50 мкл аликвот после проверки экспрессии и корректировки концентрации. Храните белковый раствор OnePot PURE при -80 °C до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Если предполагается, что белковый компонент отсутствует или присутствует в более низкой, чем ожидалось, концентрации в OnePot PURE, выполните следующие действия. Проверьте, росла ли ночная культура соответствующего штамма со скоростью, сопоставимой с другими культурами, выполняя измерения оптической плотности (OD600)всех культур. Выполните дополнительный экспресс-тест конкретного штамма, чтобы проверить экспрессию подозрительного белка. 3. Рибосомный раствор ПРИМЕЧАНИЕ: Введены две различные стратегии очистки рибосом, одна для гексаистидин-метки и одна для неметированных рибосом. Основным преимуществом метода очистки с использованием His-очистки на стандартной сродной ni-NTA гравитационной проточной колонне является то, что очистка проста, быстра и не требует дополнительного лабораторного оборудования, такого как система FPLC и ультрацентрифуга. Тем не менее, способность производства белка в реакциях OnePot PURE составляет около одной трети по сравнению с рибосомами без меток. Поэтому выбирайте способ получения рибосом исходя из того, важен ли высокий выход для данного применения. Его метка рибосомная очисткаПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует штамм E. coli RB1, подарок от профессора Ванга (Колумбийский университет, США)18. Этот штамм имеет геномную вставку гексаистидиновой метки на конце C рибосомального белка 50S (L7 / L12), что позволяет очищать с использованием колонки гравитационного потока Ni-NTA. Обычный выход составляет около 0,5 мл рибосом 3,45 мкМ, что достаточно для более чем пятисот 10 мкл реакций PURE. День 1: Приготовьте бактериальные питательные среды и добавки к средам, как описано в дополнительной таблице 1. Подготовьте и стерилизуйте необходимые материалы, включая наконечники пипеток, одну колбу Эрленмейера объемом 5 л и одну колбу Эрленмейера объемом 100 мл. Подготовьте буферы и добавки, как описано в дополнительной таблице 2. Фильтр стерилизует все буферы с помощью бутылочных верхних фильтров (0,45 мкм) и хранит их при 4 °C. День 2: Пипетку 5 мл смолы на столбец и подготовьте столбец, как указано в разделе 1.4.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большего объема смолы восстановление и очистка занимают значительно больше времени. Используйте другую колонку для очистки рибосом, чтобы избежать перекрестного загрязнения и тщательно очистите ее перед очисткой. Приготовьте ночную культуру штамма E. coli RB1 путем инокуляции 35 мл среды LB в колбу Эрленмейера 100 мл. Инкубировать при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин. День 3:ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги при комнатной температуре, если не указано иное. Добавьте 2 л lb-среды в 5-литую колбу, привите 12 мл ночной культуры, а затем инкубируйте в течение 3-4 ч при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, выполнить бактериальное культивирование в 4 х 500 мл культур в 1 л сбитых колбах. Гранулируют ячейки центрифугированием в течение 10 мин при 3220 х г и 4 °C. Хранить при -80 °C до дальнейшего использования. День 4: Уравновешивают колонку, подготовленную на этапе 3.1.4. с 30 мл лизисного буфера. Повторно суспендируют гранулу в 20 мл лизисного буфера с помощью серологической пипетки. Разжижайте ячейки с помощью 130-ваттного зондового ультразвукового устройства (см. Таблицу материалов,диаметр наконечника зонда: 6 мм) на льду со следующими параметрами: импульс 11 х 20 с; 20 с импульса выключено, амплитуда 70% (подробности процедуры см. на шаге 2.16). Сразу после ультразвуковой мушки удаляют остатки клеток центрифугированием в течение 20 мин при 21130 х г при 4 °C. Держите лисат на льду. Загрузите супернатант в колонны и пропустите его. Промыть колонну следующими смесями буферов лизиса и элюирования. Промывка 0: используйте 30 мл лизисного буфера. Промывка 1: используйте 30 мл имидазола 5 мМ (29 мл лизисного буфера, 1 мл буфера элюирования). Промывка 2: использовать 60 мл имидазола 25 мМ (50 мл лизисного буфера, 10 мл буфера элюирования). Промывка 3: использовать 30 мл имидазола 40 мМ (22 мл лизисного буфера, 8 мл буфера элюирования). Промывка 4: использовать 30 мл имидазола 60 мМ (18 мл лизисного буфера, 12 мл буфера элюирования). Элюируют рибосомы 7,5 мл буфера элюдения. Всегда держите элюированные белки на льду. Добавьте 22 мкл чистого β-меркаптоэтанола к 45 мл рибосомного буфера.ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол токсичен. Примите меры предосторожности и работайте в вытяжном вытяжке. Добавьте элюат в центробежный фильтр 15 мл и сконцентрируйте до 1 мл. Добавьте 15 мл рибосомного буфера к концентрированной пробе и снова сконцентрируйте до 1 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите предыдущий шаг дважды. Хранить при -80 °C до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Один раунд обмена/концентрации занимает около 60 мин центрифугирования при 3220 х г при 4 °C. Во время буферного обмена восстановите столбец, как указано в разделе 1.4. День 5: Определение концентрации рибосом путем измерения абсорбирующей силы при 260 нМ образца, разбавленного 1:100 в буфере рибосом. Величина абсорбции 10 разбавленного раствора соответствует 23 мкМ неразбавленному раствору, как описаноранее 16. Ввести конечную концентрацию запаса 3,45 мкМ. Для регулировки концентрации рибосомы разбавляют рибосомным буфером или концентрируют их дополнительно центрифугированием при 14000 х г в центробежном фильтре 3 кДа 0,5 мл при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальной экспрессии системы проводят титрование концентрации рибосом (раздел 5.2, дополнительная таблица 7). Проверьте состав рибосом с помощью SDS-PAGE(рисунок 3A),как указано в разделе 1.3.3. Разбавьте 2,5 мкл образца 7,5 мкл воды, смешайте с 10 мкл 2x буфера Laemmli, а затем загрузите 5 мкл и 2,5 мкл образцов на гель. Очистка рибосом без метокПРИМЕЧАНИЕ: Очистка рибосом без меток выполняется с использованием системы FPLC(Таблица материалов)и основана на гидрофобной хроматографии взаимодействия с использованием 2 х 5 мл бутильных столбцов(Таблица материалов). Хотя рибосомы могут быть очищены от любого штамма, использование штамма E. coli A19 (генетические ресурсыE. coli в Йельском университете CGSC) является выгодным из-за его удаления RNase I22. Выполните очистку при 4 °C в холодильной камере или в охлаждающем шкафу. Обычный выход составляет около 0,5 мл рибосом 10 мкМ, что соответствует более чем пятистам 10 мкл реакций PURE. День 1: Приготовьте бактериальные питательные среды и добавки к средам, как описано в дополнительной таблице 1. Подготовьте и стерилизуйте необходимые материалы, включая наконечники пипеток, колбу Эрленмейера объемом 5 л и колбу Эрленмейера объемом 100 мл. Подготовьте буферы и добавки, как описано в дополнительной таблице 2. Фильтр стерилизует все буферы с помощью бутылочных верхних фильтров (0,45 мкм) и хранит их при 4 °C. День 2: Чтобы приготовить ночную культуру штамма E. coli A19, привите 35 мл среды LB в колбу Эрленмейера 100 мл. Инкубировать при 37 °C при встряхивании при 260 об/мин. День 3: Переложите 2 л ЛБ среды в 5 л стерильную перемешанный колбу, привите 30 мл ночной культуры, а затем инкубируйте в течение 3-4 ч при 37 °C при встряхивании при 200 об/мин. Гранулируют ячейки центрифугированием при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °С. Повторно суспендируют гранулы в 25 мл суспензионного буфера и хранят при -80 °C до дальнейшего использования. День 4: Выполните шаги 3.2.8-3.2.12 параллельно с шагами 3.2.13-3.2.19. Оттаивайте и лизируйте ячейки с помощью 130-ваттного зондового ультразвукового аппарата (см. Таблицу материалов и диаметр наконечника зонда: 6 мм) на льду со следующими параметрами: импульс 12 x 20 с; Импульс выключен 20 с, амплитуда 70% (см. шаг 2.16 подробностей процедуры). Немедленно удаляют остатки клеток центрифугированием при 20000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Аспирировать супернатант и измерить объем. Добавьте равный объем буфера суспензии (с высоким содержанием соли) для регулировки конечной концентрации сульфата аммония до 1,5 М и хорошо перемешайте. Удаляют осадок центрифугированием при 20000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Отфильтруйте супернатант с помощью мембранного шприцевого фильтра полиэфирсульфона 0,45 мкм перед очисткой FPLC и соберите фильтрат в стеклянную бутылку объемом 100 мл. Держите супернатант при 4 °C в любое время. Настройте систему FPLC для очистки хроматографии гидрофобного взаимодействия с использованием двойной бутиловой колонки (2 х 5 мл) следующим образом. Для этой установки объем одного столбца (CV) относится к объему 10 мл. Потребуется три входа: два в качестве буферных линий и один в качестве линии образца. Благодаря настройкам очистителя по умолчанию удобно выбирать линии A1 и B1 для буфера C и buffer D соответственно, а также строку A2 в качестве выборочной линии. Применяйте расход по умолчанию 4 мл/мин, за исключением промывок насоса (10 мл/мин) или если не указано иное.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку TCEP является дорогостоящим реагентом, добавляйте соответствующее количество к буферам C и D только после этапа уравновешивания. Выполните промывку системного насоса в 20% ((v/v)) этаноле, чтобы очистить систему и удалить потенциальное загрязнение от предыдущих очистк. Вручную установите расход 0,2 мл/мин и установите колонну. Остановите поток. Выполните промывку системного насоса водой. Вымойте колонну 3 CV воды. Уравновешивание: поместите входы A1 и A2 в буфер C и вход B1 в буфер D без TCEP. Выполните промывку насоса и уравновесьте колонну 4 CV буфера C. Добавьте TCEP в буферы C и D. Подготовьте трубки по 15 мл или очистите круглые фракционные коллекторные трубки к коллектору фракций для сбора фракций элюирования 4-5 мл. Загрузка: Поместите вход A2 в бутылку с отфильтрованным образцом. Загрузите примерно 90% объема образца на колонку. Разбавьте образец 20 мл TCEP-содержащего буфера C и загрузите 10 мл образца на колонку. Повторите этап разбавления по крайней мере дважды и загрузите в колонну как можно больше пробы. Очень важно убедиться, что воздух не всасывается в машину. Этап стирки 1: промыть 3 CV буфера C для удаления несвязаных компонентов. Этап стирки 2: промывка с 5 CV 80% буфера C и 20% буфера D. Элюирование: элюируют продукт, применяя 50% буфера C и 50% буфера D, с общим объемом элюирования 5 CV. Соберите эту фракцию в коллекторные трубки. Этап промывки 3: Элюйте все сильно взаимодействующие загрязняющие вещества с использованием 100% буфера D общим объемом 5 CV. Анализ спектра поглощения фракции образца при 260 или 280 нМ(рисунок 4). Первый пик показывает неусвоенные белки, элюированные во время загрузки и первой ступени промывки; второй пик показывает загрязняющие вещества, которые были элюированы во время второй ступени промывки. Третий пик контролирует конечный продукт, а последний пик показывает сильно взаимодействующие загрязняющие вещества. Объедините все фракции образца, соответствующие третьему пику, для дальнейшей обработки. Всегда держите элюированные белки на льду. Аккуратно наложите восстановленную фракцию на 15 мл буфера подушки в четырех ультрацентрифугированных трубках из поликарбоната. Добавьте максимум 15 мл образца к 15 мл буфера подушки. Убедитесь, что вес трубки хорошо сбалансирован. Гранулирование рибосом ультрацентрифугированием при 100000 х г при 4 °С в течение 16 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в ультрацентрифугационных трубках нет трещин. Очистите и сбросьте столбец следующим образом. Скорость потока 5 мл/мин работает хорошо. Поместите все впускные вводы и выполните промывку насоса. Вымойте колонну 2 CV воды. Поместите вход в раствор NaOH 0,5 М, выполните промывку насоса, а затем промыть колонну с 3 CV NaOH. Поместите впускное отверстие в воду, выполните промывку насосом, а затем промыть колонну в 2 CV воды. Поместите на входное отверстие в 0,1 М раствор уксусной кислоты, выполните промывку насоса, а затем промыть колонну 3 CV раствора уксусной кислоты. Насос мойте и мойте колонну 2 CV воды. Поместите все входы в 20% ((v/v)) этанол, выполните этап промывки насоса и храните колонку в 20% ((v/v)) этаноле, промыв ее 3 CV 20% ((v/v)) раствора этанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что система никогда не высыхает и не всасывает воздух. Никогда не применяйте буфер непосредственно к этанолу или этанол к буферу. Всегда добавляйте шаг промывки водой между ними, так как в противном случае существует риск засорения колонны осадками. Обязательно добавьте достаточное количество пробирок для сбора проб. День 5: Выбросьте супернатант и осторожно, не нарушая полупрозрачную гранулу, промыть каждую гранулу 0,5 мл ледяного рибосомного буфера. Повторите этот шаг дважды. Повторно суспендируют каждую из прозрачных гранул в 100 мкл буфера рибосом на льду с помощью магнитного перемешивания (диаметр 3 мМ, длина 10 мМ) на магнитной мешалке с минимально возможной скоростью. Соберите повторно суспендированные рибосомы и промыть трубки дополнительными 50 мкл рибосомного буфера.ПРИМЕЧАНИЕ: Полупрозрачную гранулу трудно увидеть. Поэтому тщательно промывайте гранулу с боков трубки. Определение концентрации рибосом путем измерения абсорбции при 260 нМ образца, разбавленного в соотношении 1:100 в рибосомном буфере. Абсорбцию 10 разбавленного раствора соответствует 23 мкМ неразбавленному раствору, как описаноранее 16. Внедрить конечную концентрацию запаса 10 мкМ. Для регулировки концентрации разбавляют рибосомы рибосомным буфером или концентрируют их дополнительно центрифугированием при 14000 х г в центробежном фильтре 3 кДа при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальной экспрессии системы проводят титрование рибосом (раздел 5.2, дополнительная таблица 7). Проверьте состав рибосом с помощью SDS-PAGE(рисунок 3A),как указано в разделе 1.3.3. Разбавить 2,5 мкл образца 7,5 мкл воды, смешать с 10 мкл 2x буфера Laemmli, а затем загрузить 5 мкл и 2,5 мкл образцов в гель. 4. Энергетическое решение ПРИМЕЧАНИЕ: Представленная здесь композиция для 2,5-кратного энергетического раствора является примером раствора, который хорошо работал для стандартной реакции TX-TL. Чтобы оптимизировать сроки, подготовьте энергетический раствор в течение 2 дня. Приготовление раствора аминокислот подробно объясняется с последующей заключительной процедурой приготовления. Раствор аминокислотПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор аминокислоты навалом. Приготовление количества растворов аминокислотного запаса, необходимого для конечного объема не менее 2000 мкл, уменьшит погрешность взвешивания для очень небольших количеств. Общая концентрация раствора аминокислот ограничена растворимостью аминокислот и соответствующими концентрациями в растворе. Для стандартной системы PURE готовят раствор с конечной концентрацией 3,25 мМ. Используйте таблицу расчета аминокислотного раствора (Дополнительная таблица 3) в качестве шаблона. Используют цистеин в виде соли для обеспечения достаточной растворимости. Избегайте использования методов приготовления аминокислот на основе KOH. Можно непосредственно взвесить точное количество аминокислот в конечный раствор аминокислот без приготовления запасного раствора для всех аминокислот. Однако это более сложно и менее точно. Готовят стоковые растворы для каждой аминокислоты, как описано в дополнительной таблице 3,за исключением тирозина.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за различной растворимости аминокислот в воде соответствующие рекомендуемые концентрации запасного раствора различаются. Минимальная масса [мг] обеспечивает приблизительную минимальную массу, необходимую для получения достаточного количества запасного раствора для целевого общего объема, в качестве эталона.ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная масса рассчитывается с избытком 10%. Для более легкого приготовления растворов не взвешивайте точное количество аминокислоты, а вместо этого, для массы под рукой, отрегулируйте количество воды для достижения желаемой концентрации. Рассчитайте необходимое количество деионизированной воды (воды для добавления [мкл]) на основе фактической заполненной массы (светло-желтые ячейки) и желаемой концентрации с помощью электронной таблицы в дополнительной таблице 3. Солюбилизируйте растворы аминокислот путем вихря до тех пор, пока весь осадок не растворится. Отдельные растворы аминокислот могут храниться при -20 °C в течение нескольких недель.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые аминокислоты трудно растворяются в воде; процесс может занять некоторое время. Взвесьте точное количество тирозина, необходимое для получения конечной концентрации 3,25 мМ непосредственно в пробирке для раствора аминокислоты.ПРИМЕЧАНИЕ: Тирозин очень трудно растворить в воде. Добавьте его напрямую, а не готовь складской раствор. Добавьте соответствующие количества растворов аминокислотного запаса и воды, как указано в окончательном объеме, чтобы добавить колонку [мкл] (светло-голубые клетки) и хорошо вихрь раствора. Хранить готовый раствор аминокислоты при -80 °C до дальнейшего использования. Приготовление энергетического раствораПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 2,5-кратный энергетический раствор содержит 0,75 мМ каждой аминокислоты, 29,5 мМ ацетата магния, 250 мМ глутамата калия, 5 мМ АТФ и ГТФ каждый, 2,5 мМ CTP, UTP и TCEP, соответственно, 8,75 мг/мл тРНК из E. coli MRE 600, 50 мМ креатинфосфата, 0,05 мМ фолиновой кислоты, 5 мМ спермидина и 125 мМ HEPES. Первые пользователи готовят энергетический раствор небольшими партиями по 200 мкл. Храните отдельные растворы, приготовленные в соответствии с дополнительной таблицей 4, при -20 °C или -80 °C для последующего использования. Разморозить на льду все водные растворы, упомянутые в Дополнительной таблице 5. Тем временем подготовьте складовые решения для остальных компонентов, перечисленных в Дополнительной таблице 4. Все растворы после приготовления держите на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 500 мкл воды без РНКазы и ДНКазы непосредственно во флакон для растворения лиофилизированных тРНК. Хорошо перемешать мягким вихрем; ограничить пипетирование, чтобы избежать введения РНКаз. Сложите рассчитанные объемы(Дополнительная таблица 5)запасов растворов и воды и хорошо перемешайте с помощью вихря. Всегда держите раствор на льду. Измерьте рН раствора, пипетируя 1 мкл на полосу рН, чтобы убедиться, что рН раствора нейтрален. Аликвот энергетический раствор по 50-100 мкл на пробирку на льду и хранят при -80 °С до дальнейшего использования. Во время аликвотирования часто вихряйте основной запас, чтобы предотвратить осаждение компонентов.ПРИМЕЧАНИЕ: При желании провести анализ активности вновь созданного энергетического решения по коммерческим энергетическим решениям, например, раствору А в PURExpress. Если наблюдается значительно более низкая производительность системы с энергетическим раствором, оптимизация концентраций ионов, особенно ионов магния, путем титрования (5-20 мМ) может быть выгодной. 5. Реакция OnePot PURE Шаблон ДНКПРИМЕЧАНИЕ: Белки, кодируемые ниже по течению промотора Т7, могут быть экспрессированы в PURE из линейной или круговой ДНК. Генерируя линейный шаблон ДНК с использованием расширения ПЦР, утомительные шаги клонирования могут быть опущены. Линейные шаблоны для этого исследования были сгенерированы с помощью ПЦР, как описано ниже, с использованием высокоточной ДНК-полимеразы(Таблица материалов). Последовательности грунтовок, температуры плавления и настройки термоциклера, используемые в этом исследовании, указаны в дополнительной таблице 6. Подготовка шаблона ДНК не входит в ежедневный график. Настройте реакцию ПЦР в соответствии с рекомендацией поставщика полимеразы.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизированные параметры для высокоточной ДНК-полимеразы(Таблица материалов)приведены в Дополнительной таблице 6. Амплифицировать ген-мишень (например, eGFP) в виде линейного шаблона из плазмиды или генома с помощью ген-специфических праймеров (500 нМ) (параметры см. в дополнительной таблице 6). Амплификация генерирует короткие расширения для обеспечения последовательностей отжига для следующих этапов ПЦР расширения. Проверьте ампликон на агарозном геле на правильный размер и чистоту. Используйте амплифицированную ДНК в качестве шаблона для последующих этапов расширения. Устанавливают реакцию не менее 50 мкл. Запустите 10 циклов амплификации ПЦР с помощью удлинительных праймеров (2,5 нМ). После завершения циклов амплификации немедленно добавьте конечные праймеры (500 нМ) к той же реакции и выполните 30 циклов для усиления расширенного продукта ПЦР. Температуры плавления и последовательности грунтовок приведены в дополнительной таблице 6. Очистите фрагменты ДНК с помощью набора для очистки ДНК и элюируйте ДНК в воде без нуклеаз вместо ЭДТА, содержащего буфер элюации. Проверьте линейный шаблон на агарозном геле на правильный размер и чистоту. Измерьте концентрацию ДНК в нг/мкл с помощью спектрофотометра UV-Vis. Настройка реакции PUREПРИМЕЧАНИЕ: Конечная реакционная композиция состоит из 1x энергетического раствора, рибосом без меток или рибосом His-tag, белков OnePot PURE и шаблона ДНК. Объемное отношение реакции содержит 40% энергетического раствора, 30% раствора белка и рибосомы и 30% ДНК и воды. Типичные реакционные объемы варьируются от 5 мкл до 25 мкл. Количественное измерение экспрессии флуоресцентного белка непрерывно на пластинчатом считывателе. Используйте зеленый Lys in vitro Система трансляции маркировки, которая включает флуоресцентно меченый остаток лизина во вновь синтезированные белки для проверки экспрессии нефлуоресцентных белков на гегеле SDS-PAGE. Пример шаблона реакции приведен в Дополнительная таблица 7 чтобы помочь установить реакцию экспрессии PURE без клеток. Ячейки желтого цвета указывают на введенные пользователем значения, а ячейки оранжевого цвета указывают на дополнительные реагенты, которые необходимо дополнительно добавить в реакцию. Поддерживайте точность объемных соотношений компонентов, чтобы обеспечить правильный ионный баланс. Например, для достижения более высокой концентрации белка увеличьте концентрацию белкового раствора OnePot; однако не следует увеличивать объем белкового раствора, добавленного в реакцию.Заполните концентрацию [нг/мкл] и длину [пары оснований] ДНК в соответствующих желтых клетках в электронной таблице. Используйте 2-10 нМ ДНК для реакции. Заполните желаемый общий объем реакции в мкл. Извлеките необходимые реагенты из морозильной камеры и разморозьте их на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное замораживание компонентов возможно без снижения функциональности. Тем не менее, сведите к минимуму количество циклов замораживания-оттаивания и время, в течение которого образцы хранятся на льду, насколько это возможно. Пипетка рассчитанного количества воды, ДНК и энергетического раствора на одну сторону ПЦР-трубки или один угол скважины на 384-скважинной пластине. Добавьте необходимое количество любого дополнительного реагента на ту же сторону. Минимизируйте количество образцов в эксперименте, чтобы избежать испарения образца и смещения времени начала эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы энергетический компонент физически отделялся от белковых компонентов, чтобы избежать преждевременного потребления источников энергии и снижения урожайности. Пипетка рассчитанных количеств белка и рибосомного раствора на другую сторону ПЦР-трубки или противоположный угол 384-й колодезной пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности используйте мастер-миксы, чтобы уменьшить влияние ошибок пипетки. После первоначального тестирования рибосомные и белковые растворы можно смешивать и хранить в виде одного раствора. Открутите в течение короткого времени (30 с) для слияния реакционных компонентов. Чтобы предотвратить испарение во время экспериментов со считывателем пластин, добавьте 35 мкл жидкого воска и запечатайте пластину прозрачным герметином (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение минимум 3 ч при 37 °C. Для считывания показаний на пластинчатом считывателе измеряйте интенсивность флуоресценции на требуемой длине волны каждые 2 мин (репрезентативные результаты показаны на рисунке 3В). Выполните следующие действия для образцов с метками Green Lys. После бесклеточной экспрессии инкубируют образец с 0,16 мкг/мкл РНКазы А в течение 30 мин при 37 °C, чтобы удалить флуоресцентный фон набора маркировки Green Lys.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте РНКазу А, так как другие типы РНКаз недостаточно хорошо удаляют фон. Визуализируйте экспрессию белка, запустив SDS-PAGE, как указано в разделе 1.3.3. Осторожно вымойте неокрашивающийся гель в деионизированной воде и визуализируйте его на флуоресцентном томоире с длиной волны возбуждения 488 нм. Впоследствии окрашивают гель с помощью обычных методов окрашивания Кумасси. Подходящие параметры см. в разделе 1.3.3.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните титрование белкового раствора с рекомендуемой концентрацией рибосом и, при необходимости, титруйте рибосомы с оптимальной концентрацией белка OnePot после этого. Используйте коммерческий комплект PURExpress ΔRibosome в качестве положительного элемента управления. Раствор А, Фактор Микс и раствор рибосомы соответствуют приготовленной энергии, белковому раствору OnePot и очищенным рибосомам соответственно.