Summary

Yakınlık-Ligasyon-Tahlil Kullanarak Farklı Sıvı Kesme Stres Koşulları Altında TGFβ/BMP/SMAD Sinyalinin Görselleştirilmesi ve Nicelleştirilmesi

Published: September 14, 2021
doi:

Summary

Burada, patolojik ve fizyolojik sıvı kesme stres koşullarına maruz kalan endotel hücrelerinde yakınlık ligasyon testini (PLA) kullanarak birden fazla SMAD kompleksini aynı anda görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol oluşturuyoruz.

Abstract

Büyüme Faktörü β (TGFβ)/Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyalinin dönüştürülmesi, vaskülür sisteminin gelişimi ve homeostazı sırasında sıkı bir şekilde düzenlenir ve dengelenir Bu nedenle, bu sinyal yolundaki deregülasyon pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi ve ateroskleroz gibi ciddi vasküler patolojilerle sonuçlanır. Kan damarlarının en iç tabakası olarak endotel hücreleri (VC’ ler) sürekli olarak sıvı kesme stresine (SS) maruz kalır. Anormal sıvı SS paternlerinin, diğer uyaranlarla birlikte aterogenez indükleyen TGFβ/BMP sinyalini arttırdığı gösterilmiştir. Bununla ilgili olarak, ateroprotektif, yüksek laminar SS bu sinyali azaltırken, ateroprotektif, düşük laminar SS’nin TGFβ/ BMP sinyalini artırdığı bulunmuştur. Bu yolların aktivasyonunu verimli bir şekilde analiz etmek için, piyasada bulunan bir pnömatik pompa sistemi ve yakınlık ligasyon tahlilini (PLA) kullanarak düşük laminar SS ve yüksek laminar SS koşulları altında transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumunu araştırmak için bir iş akışı tasarladık.

Aktif TGFβ/BMP-sinyalizasyon, iki düzenleyici SMAD’den (R-SMAD) oluşan trimerik SMAD komplekslerinin oluşumunu gerektirir; SMAD2/3 ve SMAD1/5/8 sırasıyla TGFβ ve BMP sinyalizasyon için) ortak bir arabulucu SMAD (ortak SMAD; SMAD4). Trimerik SMAD kompleksinin farklı alt birimlerini, yani R-SMAD/co-SMAD veya R-SMAD/R-SMAD’ı hedefleyen PLA kullanılarak, aktif SMAD transkripsiyon faktörü komplekslerinin oluşumu floresan mikroskopisi kullanılarak nicel ve mekansal olarak ölçülebilir.

Seri olarak bağlanabilen 6 küçük paralel kanallı akış slaytlarının kullanımı, transkripsiyon faktörü karmaşık oluşumunun araştırılmasına ve gerekli kontrollerin dahil edilmesine olanak tanır.

Burada açıklanan iş akışı, farklı sıvı SS koşullarında SMAD’lerin diğer transkripsiyon faktörlerine veya SMAD’ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine yakınlığını hedefleyen çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Burada sunulan iş akışı, VC’lerde sıvı SS kaynaklı TGFβ/BMP sinyalini hem nicel hem de mekansal olarak incelemenin hızlı ve etkili bir yolunu göstermektedir.

Introduction

Dönüşen büyüme faktörleri beta (TGFβ) süper ailenin proteinleri, TGFβs, kemik morfogenetik proteinleri (BMP’ler) ve Activins1,2 dahil olmak üzere çeşitli üyelere sahip pleiotropik sitokinlerdir. Ligand bağlama, fosforilasyona ve böylece sitosolik düzenleyici SMAD’nin (R-SMAD) aktivasyonuna yol açan reseptör oligomerlerinin oluşumuna neden olandır. Ligandların alt ailesine bağlı olarak, farklı R-SMAD’ler etkinleştirilir1,2. TGFβs ve Activins esas olarak SMAD2/3 fosforilasyonuna neden olurken, BMP’ler SMAD1/5/8 fosforilasyona neden olur. Bununla birlikte, BMP’lerin ve TGFβs/Activins’in de ilgili diğer alt ailenin R-SMAD’lerini etkinleştirdiğine dair kanıtlar vardır, ‘yanal sinyal’3,4,5,6,7,8 olarak adlandırılan bir süreçte ve her iki SMAD1/5 ve SMAD2/3, üyeden oluşan karışık SMAD kompleksleri vardır. . İki aktif R-SMAD daha sonra ortak mediatör SMAD4 ile trimerik kompleksler oluşturur. Bu transkripsiyon faktörü kompleksleri daha sonra çekirdeğe yerle bir olabilir ve hedef genlerin transkripsiyonunu düzenleyebilir. SMAD’ler çeşitli transkripsiyonal ko-aktivatörler ve yardımcı baskılayıcılarla etkileşime girebilir ve bu da hedef genleri düzenleme olanaklarının çeşitlendirilmesine yol açabilir10. SMAD sinyalinin deregülasyonunun çeşitli hastalıklarda ciddi etkileri vardır. Buna paralel olarak dengesiz TGFβ/BMP sinyali pulmoner arter hipertansiyonu, kalıtsal hemorajik telanjiektazi veya ateroskleroz3,11,12,13,14 gibi ciddi damar patolojilerine yol açabilir.

Endotel hücreleri (VC’ ler) kan damarlarının en iç tabakasını oluşturur ve bu nedenle kanın viskoz akışı tarafından uygulanan sürtünme kuvveti olan kesme stresine (SS) maruz kalır. İlginçtir ki, vaskülatın yüksek düzeyde üniforma, laminar SS’ye maruz kalan kısımlarında bulunan VC’ler homeostatik ve sessiz bir durumda tutulur. Buna karşılık, düşük, homojen olmayan SS deneyimine sahip VC’ler, örneğin bifurkasyonlarda veya aort kemerinin daha az eğriliğinde, proliferatiftir ve enflamatuar yolları aktive eder15. Buna karşılık, işlevsiz EC siteleri ateroskleroz geliştirmeye eğilimlidir. İlginçtir ki, bu ateropron alanlarındaki VC’ler anormal derecede yüksek aktif SMAD2/3 ve SMAD1/516,17,18 seviyeleri gösterir. Bu bağlamda, gelişmiş TGFβ/BMP sinyalinin aterosklerotik lezyonların gelişiminde erken bir olay olduğu saptanmıştır19 ve BMP sinyaline müdahalenin damar iltihabını, aterom oluşumunu ve ilişkili kireçlenmeyi belirgin şekilde azalttığı bulunmuştur20.

Yakınlık Ligasyon Tahlil (PLA), protein-protein etkileşimlerini yerinde incelemek için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir21,22. Hedef proteinleri birbirine bağlayabilen farklı türlerdeki antikorların özgüllüğüne dayanır ve endojen protein etkileşimlerinin tek hücre düzeyinde son derece spesifik olarak tespit edilmesine izin verir. Burada, primer antikorların tespite izin vermek için 40 nm’den daha az bir mesafede hedef epitoplarına bağlanmaları gerekir23. Bu nedenle PLA, endojen protein etkileşimlerini tespit etmek için birkaç milyon hücreye ihtiyaç duyulan geleneksel eş-immüno-immün premünipitasyon yaklaşımları üzerinde büyük ölçüde faydalıdır. PLA’da, DNA parçalarına (Artı ve Eksi problar olarak added) yaygın olarak bağlanan türe özgü ikincil antikorlar, birincil antikorları bağlar ve ilgi proteinleri etkileşime girerse, Artı ve Eksi probları yakın mesafededir. DNA aşağıdaki adımda liglenir ve dairesel DNA’nın yuvarlanan daire amplifikasyonu mümkün olur. Amplifikasyon sırasında, floresan olarak etiketlenmiş tamamlayıcı oligonükleotidler sentezlenmiş DNA’ya bağlanır ve bu protein etkileşimlerinin geleneksel floresan mikroskopi ile görselleştirilmesini sağlar.

Burada açıklanan protokol, bilim adamlarının PLA kullanarak ateroprotektif ve ateropron SS koşullarındaki aktif SMAD transkripsiyon komplekslerinin sayısını nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. SS, tanımlanmış seviyelerde laminar tek yönlü akış üretebilen ve akış hızlarının adım adım artmasına izin veren programlanabilir bir pnömatik pompa sistemi ile üretilir. Bu yöntem, SMAD4 ile SMAD1/5 veya SMAD2/3 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra karışık R-SMAD komplekslerinin algılanmasını sağlar. SMAD’lerin transkripsiyonal yardımcı düzenleyicilerle etkileşimlerini analiz etmek veya SMAD’ler dışındaki transkripsiyon faktörü komplekslerine kolayca genişletilebilir. Şekil 1 aşağıda sunulan protokolün ana adımlarını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Açıklanan protokolün şematik gösterimi. (A) 6 kanallı kaydıraklarda tohumlanan hücreler pnömatik pompa sistemi ile kesme stresine maruz kalır. (B) Sabit hücreler PLA deneyi veya kontrol koşulları için kullanılır. (C) PLA deneylerinin görüntüleri floresan mikroskop ile elde edilir ve ImageJ analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Hücre kültürü ve sıvı kesme stresine maruz kalma NOT: SMAD’lerin SS kaynaklı etkileşimini incelemek için örnek olarak insan göbek damarı EBC’leri (HUVEC) kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan iletişim kuralı her SS duyarlı hücre türüne uygulanabilir. 37 °C’de 30 dakika boyunca PBS’de % 0,1 porcine cilt jelatin ile 6 kanallı kaydırağı kapleyin. 30 μL M199 tam ortamda mL başına 2,5 x 106 hücre yoğunluğunda önceden kaplanmış 6…

Representative Results

Daha önce farklı SMAD proteinlerinin etkileşimlerini tespit etmek için PLA kullandık3 ve SMAD fosforilasyonundaki kesme stresi kaynaklı değişiklikleri analiz ettik28. Burada her iki yöntem de yukarıda açıklanan protokol ile birleştirildi. HUVEC’ler 1 dyn/cm2 ve 30 dyn/cm2 kesme stresine maruz kaldı ve SMAD transkripsiyon faktörlerinin etkileşimleri için analiz edildi. Yüksek kesme stresi (30 dyn/cm2</s…

Discussion

Burada açıklanan PLA tabanlı protokol, nicel ve mekansal çözünürlükle kesme stresine maruz kalan VC’lerde iki proteinin (örneğin doğrudan etkileşimlerinin) yakınlığını belirlemenin etkili bir yolunu sunar. Birden fazla paralel kanallı akış slaytları kullanılarak, aynı mekanik koşullar altında hücrelerde aynı anda birkaç farklı protein etkileşimi incelenebilir. Buna karşılık, özel yapım akış odası sistemleri genellikle bir cam kapak parçası etrafında inşa edilen tek bir kanaldan y…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Maria Reichenbach ve Dr. Christian Hiepen’e akış sistemine verdikleri destek için, Eleanor Fox ve Yunyun Xiao’ya ise makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz. P-L.M. uluslararası Max Planck Araştırma Okulu IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) tarafından finanse edildi. PK, DFG-SFB1444 tarafından fon aldı. Şekil 1 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Materials

µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

References

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. . Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012)
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019)
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Play Video

Cite This Article
Mendez, P., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

View Video