Summary

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Published: September 14, 2021
doi:

Summary

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Abstract

La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).

La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.

El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios.

El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.

Introduction

Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP inducen la fosforilación de SMAD1/5/8. Sin embargo, se acumulan evidencias de que los BMP y TGFβs/Activinas también activan los R-SMAD de la otra subfamilia respectiva, en un proceso denominado como ‘señalización lateral’3,4,5,6,7,8 y que existen complejos SMAD mixtos formados por ambos, SMAD1/5 y SMAD2/3, miembros3,9 . Dos R-SMAD activados posteriormente forman complejos triméricos con el mediador común SMAD4. Estos complejos de factores de transcripción son capaces de translocarse al núcleo y regular la transcripción de genes diana. Los SMADs pueden interactuar con una variedad de diferentes co-activadores transcripcionales y co-represores, lo que lleva a la diversificación de las posibilidades de regular los genes diana10. La desregulación de la señalización SMAD tiene graves implicaciones en una variedad de enfermedades. En línea con esto, la señalización desequilibrada de TGFβ/BMP puede conducir a patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria o aterosclerosis3,11,12,13,14.

Las células endoteliales (CE) forman la capa más interna de los vasos sanguíneos y, por lo tanto, están expuestas al estrés cortante (SS), una fuerza de fricción ejercida por el flujo viscoso de la sangre. Curiosamente, las CE que residen en las partes de la vasculatura, que están expuestas a altos niveles de SS laminar uniforme, se mantienen en un estado homeostático y quiescente. Por el contrario, las CE que experimentan SS bajas y no uniformes, por ejemplo, en bifurcaciones o en la menor curvatura del arco aórtico, son proliferativas y activan vías inflamatorias15. A su vez, los sitios de CE disfuncionales son propensos a desarrollar aterosclerosis. Curiosamente, las CE en estas áreas de ateróprona muestran niveles aberrantemente altos de SMAD2/3 y SMAD1/516 activados,17,18. En este contexto, se encontró que la señalización mejorada de TGFβ/BMP era un evento temprano en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas19 y se encontró que la interferencia con la señalización de BMP reduce notablemente la inflamación vascular, la formación de ateroma y la calcificación asociada20.

El Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA) es una técnica bioquímica para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína21,22. Se basa en la especificidad de anticuerpos de diferentes especies que pueden unirse a proteínas diana de interés, lo que permite una detección altamente específica de interacciones de proteínas endógenas a nivel de una sola célula. Aquí, los anticuerpos primarios tienen que unirse a su epítopo objetivo a una distancia de menos de 40 nm para permitir la detección23. Por lo tanto, el PLA es muy beneficioso sobre los enfoques tradicionales de coinmunoprecipitación, donde se necesitan varios millones de células para detectar interacciones endógenas de proteínas. En el PLA, los anticuerpos secundarios específicos de la especie, unidos covalentemente a fragmentos de ADN (denominados sondas Plus y Minus), se unen a los anticuerpos primarios y si las proteínas de interés interactúan, las sondas Plus y Minus se acercan mucho. El ADN se liga en el siguiente paso y la amplificación del círculo rodante del ADN circular es posible. Durante la amplificación, los oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente se unen al ADN sintetizado, lo que permite que estas interacciones proteicas se visualicen mediante microscopía de fluorescencia convencional.

El protocolo descrito aquí permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de transcripción SMAD activos en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas in vitro utilizando PLA. SS se genera a través de un sistema de bomba neumática programable que es capaz de generar flujo unidireccional laminar de niveles definidos y permite aumentos escalonados de los caudales. Este método permite la detección de interacciones entre SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, así como complejos mixtos-R-SMAD. Se puede ampliar fácilmente para analizar las interacciones de los SMAD con los co-reguladores transcripcionales o con complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD. La Figura 1 muestra los principales pasos del protocolo que se presentan a continuación.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del protocolo descrito. (A) Las células sembradas en portaobjetos de 6 canales se exponen a la tensión de cizallamiento con un sistema de bomba neumática. (B) Las células fijas se utilizan para experimentos de PLA o para condiciones de control. (C) Las imágenes de los experimentos de PLA se adquieren con un microscopio de fluorescencia y se analizan utilizando el software de análisis ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS. Cubra el portaobjetos de 6 canales con gelatina de piel porcina al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 °C. HUVEC de semillas en portaobjetos pre-recubiertos de 6 canales a una …

Representative Results

Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de SMAD28. Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en c…

Discussion

El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.

Materials

µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

References

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. . Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012)
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019)
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Play Video

Cite This Article
Mendez, P., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

View Video