Summary

Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Published: September 14, 2021
doi:

Summary

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalisierung ist während der Entwicklung und Homöostase des Gefäßsystems streng reguliert und ausgeglichen Daher führt eine Deregulation in diesem Signalweg zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie und Atherosklerose. Endothelzellen (ECs), als innerste Schicht der Blutgefäße, sind ständig Flüssigkeitsscherstress (SS) ausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass abnormale Muster von Fluid-SS die TGFβ / BMP-Signalgebung verbessern, die zusammen mit anderen Reizen eine Atherogenese induzieren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass atheroprones, niedriges laminares SS die TGFβ / BMP-Signalisierung verbessert, während atheroprotektives, hochlaminares SS diese Signalisierung verringert. Um die Aktivierung dieser Signalwege effizient zu analysieren, haben wir einen Workflow entwickelt, um die Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter niedrigen laminaren SS- und hohen laminaren SS-Bedingungen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen pneumatischen Pumpensystems und eines Proximity Ligation Assay (PLA) zu untersuchen.

Aktive TGFβ/BMP-Signalisierung erfordert die Bildung von trimeren SMAD-Komplexen, die aus zwei regulatorischen SMADs (R-SMAD) bestehen; SMAD2/3 bzw. SMAD1/5/8 für TGFβ bzw. BMP Signalisierung) mit einem gemeinsamen Mediator SMAD (Co-SMAD; SMAD4). Mit Hilfe von PLA, das auf verschiedene Untereinheiten des trimeren SMAD-Komplexes abzielt, d.h. entweder R-SMAD/co-SMAD oder R-SMAD/R-SMAD, kann die Bildung aktiver SMAD-Transkriptionsfaktorkomplexe quantitativ und räumlich mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.

Die Verwendung von Strömungsschienen mit 6 kleinen parallelen Kanälen, die in Reihe geschaltet werden können, ermöglicht die Untersuchung der Komplexbildung des Transkriptionsfaktors und die Einbeziehung notwendiger Kontrollen.

Der hier erläuterte Workflow kann leicht für Studien angepasst werden, die auf die Nähe von SMADs zu anderen Transkriptionsfaktoren oder zu Transkriptionsfaktorkomplexen außer SMADs unter verschiedenen flüssigen SS-Bedingungen abzielen. Der hier vorgestellte Workflow zeigt eine schnelle und effektive Möglichkeit, die fluid-SS-induzierte TGFβ/BMP-Signalisierung in ECs sowohl quantitativ als auch räumlich zu untersuchen.

Introduction

Proteine der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGFβ) sind pleiotrope Zytokine mit einer Vielzahl von Mitgliedern, darunter TGFβs, knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und Activine1,2. Die Ligandenbindung induziert die Bildung von Rezeptoroligomeren, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der zytosolischen regulatorischen SMAD (R-SMAD) führen. Je nach Unterfamilie der Liganden werden unterschiedliche R-SMADs aktiviert1,2. Während TGFβs und Activine hauptsächlich die Phosphorylierung von SMAD2/3 induzieren, induzieren BMPs die SMAD1/5/8-Phosphorylierung. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass BMPs und TGFβs/Activine auch R-SMADs der jeweiligen anderen Unterfamilie in einem als “laterale Signalisierung” bezeichneten Prozess aktivieren3,4,5,6,7,8 und dass es gemischte SMAD-Komplexe gibt, die sowohl aus SMAD1/5 als auch AUS SMAD2/3 bestehen, Mitglieder3,9 . Zwei aktivierte R-SMADs bilden anschließend trimerische Komplexe mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Diese Transkriptionsfaktorkomplexe sind dann in der Lage, in den Zellkern zu translozieren und die Transkription von Zielgenen zu regulieren. SMADs können mit einer Vielzahl verschiedener transkriptioneller Koaktivatoren und Co-Repressoren interagieren, was zur Diversifizierung der Möglichkeiten zur Regulierung von Zielgenen führt10. Die Deregulierung der SMAD-Signalgebung hat schwerwiegende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten. Dementsprechend kann eine unausgewogene TGFβ/BMP-Signalgebung zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie oder Atherosklerose führen3,11,12,13,14.

Endothelzellen (ECs) bilden die innerste Schicht der Blutgefäße und sind daher Scherstress (SS) ausgesetzt, einer Reibungskraft, die durch den viskosen Blutfluss ausgeübt wird. Interessanterweise werden ECs, die sich in den Teilen des Gefäßsystems befinden, die einem hohen Maß an einheitlichem, laminarem SS ausgesetzt sind, in einem homöostatischen und ruhenden Zustand gehalten. Im Gegensatz dazu sind ECs, die eine niedrige, ungleichmäßige SS erfahren, z. B. bei Verzweigungen oder der geringeren Krümmung des Aortenbogens, proliferativ und aktivieren Entzündungswege15. Im Gegenzug neigen Stellen von dysfunktionalen ECs dazu, Atherosklerose zu entwickeln. Interessanterweise zeigen ECs in diesen atheropronen Bereichen ungewöhnlich hohe Konzentrationen von aktiviertem SMAD2/3 und SMAD1/516,17,18. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass eine verbesserte TGFβ/BMP-Signalisierung ein frühes Ereignis in der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen19 ist und eine Interferenz mit der BMP-Signalgebung die vaskuläre Entzündung, die Atherombildung und die damit verbundene Verkalkung deutlich reduziert20.

Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine biochemische Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in situ21,22. Es beruht auf der Spezifität von Antikörpern verschiedener Spezies, die Zielproteine von Interesse binden können, was den hochspezifischen Nachweis endogener Proteininteraktionen auf Einzelzellebene ermöglicht. Dabei müssen primäre Antikörper in einem Abstand von weniger als 40 nm an ihr Zielepitop binden, um den Nachweis zu ermöglichen23. Daher ist PLA gegenüber herkömmlichen Co-Immunpräzipitationsansätzen, bei denen mehrere Millionen Zellen benötigt werden, um endogene Proteininteraktionen nachzuweisen, von großem Vorteil. Bei PLA binden speziesspezifische sekundäre Antikörper, kovalent verknüpft mit DNA-Fragmenten (sogenannte Plus- und Minus-Sonden), die primären Antikörper und wenn die proteininteressierten Proteine interagieren, kommen Plus- und Minus-Sonden in unmittelbarer Nähe. Die DNA wird im folgenden Schritt ligiert und die Rolling Circle Amplification der zirkulären DNA wird ermöglicht. Während der Amplifikation binden fluoreszenzmarkierte komplementäre Oligonukleotide an die synthetisierte DNA, so dass diese Proteininteraktionen durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anzahl der aktiven SMAD-Transkriptionskomplexe unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen in vitro unter Verwendung von PLA quantitativ zu vergleichen. SS wird über ein programmierbares pneumatisches Pumpensystem erzeugt, das in der Lage ist, laminaren unidirektionalen Durchfluss definierter Füllstände zu erzeugen und schrittweise Erhöhungen der Durchflussraten zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen SMAD1/5 oder SMAD2/3 mit SMAD4 sowie von Mixed-R-SMAD-Komplexen. Es kann leicht erweitert werden, um Wechselwirkungen von SMADs mit transkriptionellen Co-Regulatoren oder auf andere Transkriptionsfaktorkomplexe als SMADs zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte des unten dargestellten Protokolls.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Protokolls. (A) Zellen, die in 6-Kanal-Objektträgern ausgesät sind, werden mit einem pneumatischen Pumpensystem einer Schubbeanspruchung ausgesetzt. (B) Feste Zellen werden für PLA-Experimente oder für Kontrollbedingungen verwendet. (C) Bilder von PLA-Experimenten werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der Analysesoftware ImageJ analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Exposition gegenüber Zellkultur- und Flüssigkeitsscherstress HINWEIS: Menschliche Nabelschnurvenen-ECs (HUVECs) wurden als Beispiel verwendet, um die SS-induzierte Interaktion von SMADs zu untersuchen. Das unten beschriebene Protokoll kann auf jeden SS-responsiven Zelltyp angewendet werden. 6-Kanal-Objektträger mit 0,1% Schweinehautgelatine in PBS für 30 min bei 37 °C bestreichen. Seed HUVECs in vorbeschichteten 6-Kanal-Objektträgern mit einer Dichte von 2,5 x <sup…

Representative Results

Wir haben pla zuvor verwendet, um Wechselwirkungen verschiedener SMAD-Proteine3 zu detektieren und scherspannungsinduzierte Veränderungen in der SMAD-Phosphorylierung zu analysieren28. Hier wurden beide Methoden mit dem oben beschriebenen Protokoll kombiniert. HUVECs wurden einer Scherspannung von 1 Dyn/cm2 und 30 Dyn/cm2 ausgesetzt und auf Wechselwirkungen von SMAD-Transkriptionsfaktoren analysiert. Wir zeigen, dass im Ver…

Discussion

Das hier beschriebene PLA-basierte Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, die Nähe von zwei Proteinen (z. B. deren direkte Interaktion) in ECs, die Scherspannung ausgesetzt sind, mit quantitativer und räumlicher Auflösung zu bestimmen. Durch den Einsatz von Strömungsobjektträgern mit mehreren parallelen Kanälen können mehrere verschiedene Proteininteraktionen gleichzeitig in Zellen unter identischen mechanischen Bedingungen untersucht werden. Im Gegensatz dazu verwenden speziell angefertigte Durchflusskamm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Maria Reichenbach und Dr. Christian Hiepen für ihre Unterstützung beim Flow-Setup-System und Eleanor Fox und Yunyun Xiao für die kritische Lektüre des Manuskripts. P-L.M. wurde von der internationalen Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) gefördert. PK wurde vom DFG-SFB1444 gefördert. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.

Materials

µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

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Cite This Article
Mendez, P., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

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