Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.
Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) Signalisierung ist während der Entwicklung und Homöostase des Gefäßsystems streng reguliert und ausgeglichen Daher führt eine Deregulation in diesem Signalweg zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie und Atherosklerose. Endothelzellen (ECs), als innerste Schicht der Blutgefäße, sind ständig Flüssigkeitsscherstress (SS) ausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass abnormale Muster von Fluid-SS die TGFβ / BMP-Signalgebung verbessern, die zusammen mit anderen Reizen eine Atherogenese induzieren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass atheroprones, niedriges laminares SS die TGFβ / BMP-Signalisierung verbessert, während atheroprotektives, hochlaminares SS diese Signalisierung verringert. Um die Aktivierung dieser Signalwege effizient zu analysieren, haben wir einen Workflow entwickelt, um die Bildung von Transkriptionsfaktorkomplexen unter niedrigen laminaren SS- und hohen laminaren SS-Bedingungen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen pneumatischen Pumpensystems und eines Proximity Ligation Assay (PLA) zu untersuchen.
Aktive TGFβ/BMP-Signalisierung erfordert die Bildung von trimeren SMAD-Komplexen, die aus zwei regulatorischen SMADs (R-SMAD) bestehen; SMAD2/3 bzw. SMAD1/5/8 für TGFβ bzw. BMP Signalisierung) mit einem gemeinsamen Mediator SMAD (Co-SMAD; SMAD4). Mit Hilfe von PLA, das auf verschiedene Untereinheiten des trimeren SMAD-Komplexes abzielt, d.h. entweder R-SMAD/co-SMAD oder R-SMAD/R-SMAD, kann die Bildung aktiver SMAD-Transkriptionsfaktorkomplexe quantitativ und räumlich mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.
Die Verwendung von Strömungsschienen mit 6 kleinen parallelen Kanälen, die in Reihe geschaltet werden können, ermöglicht die Untersuchung der Komplexbildung des Transkriptionsfaktors und die Einbeziehung notwendiger Kontrollen.
Der hier erläuterte Workflow kann leicht für Studien angepasst werden, die auf die Nähe von SMADs zu anderen Transkriptionsfaktoren oder zu Transkriptionsfaktorkomplexen außer SMADs unter verschiedenen flüssigen SS-Bedingungen abzielen. Der hier vorgestellte Workflow zeigt eine schnelle und effektive Möglichkeit, die fluid-SS-induzierte TGFβ/BMP-Signalisierung in ECs sowohl quantitativ als auch räumlich zu untersuchen.
Proteine der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGFβ) sind pleiotrope Zytokine mit einer Vielzahl von Mitgliedern, darunter TGFβs, knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und Activine1,2. Die Ligandenbindung induziert die Bildung von Rezeptoroligomeren, die zur Phosphorylierung und damit zur Aktivierung der zytosolischen regulatorischen SMAD (R-SMAD) führen. Je nach Unterfamilie der Liganden werden unterschiedliche R-SMADs aktiviert1,2. Während TGFβs und Activine hauptsächlich die Phosphorylierung von SMAD2/3 induzieren, induzieren BMPs die SMAD1/5/8-Phosphorylierung. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass BMPs und TGFβs/Activine auch R-SMADs der jeweiligen anderen Unterfamilie in einem als “laterale Signalisierung” bezeichneten Prozess aktivieren3,4,5,6,7,8 und dass es gemischte SMAD-Komplexe gibt, die sowohl aus SMAD1/5 als auch AUS SMAD2/3 bestehen, Mitglieder3,9 . Zwei aktivierte R-SMADs bilden anschließend trimerische Komplexe mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Diese Transkriptionsfaktorkomplexe sind dann in der Lage, in den Zellkern zu translozieren und die Transkription von Zielgenen zu regulieren. SMADs können mit einer Vielzahl verschiedener transkriptioneller Koaktivatoren und Co-Repressoren interagieren, was zur Diversifizierung der Möglichkeiten zur Regulierung von Zielgenen führt10. Die Deregulierung der SMAD-Signalgebung hat schwerwiegende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten. Dementsprechend kann eine unausgewogene TGFβ/BMP-Signalgebung zu schweren vaskulären Pathologien wie pulmonaler Arterienhypertonie, hereditärer hämorrhagischer Teleangiektasie oder Atherosklerose führen3,11,12,13,14.
Endothelzellen (ECs) bilden die innerste Schicht der Blutgefäße und sind daher Scherstress (SS) ausgesetzt, einer Reibungskraft, die durch den viskosen Blutfluss ausgeübt wird. Interessanterweise werden ECs, die sich in den Teilen des Gefäßsystems befinden, die einem hohen Maß an einheitlichem, laminarem SS ausgesetzt sind, in einem homöostatischen und ruhenden Zustand gehalten. Im Gegensatz dazu sind ECs, die eine niedrige, ungleichmäßige SS erfahren, z. B. bei Verzweigungen oder der geringeren Krümmung des Aortenbogens, proliferativ und aktivieren Entzündungswege15. Im Gegenzug neigen Stellen von dysfunktionalen ECs dazu, Atherosklerose zu entwickeln. Interessanterweise zeigen ECs in diesen atheropronen Bereichen ungewöhnlich hohe Konzentrationen von aktiviertem SMAD2/3 und SMAD1/516,17,18. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, dass eine verbesserte TGFβ/BMP-Signalisierung ein frühes Ereignis in der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen19 ist und eine Interferenz mit der BMP-Signalgebung die vaskuläre Entzündung, die Atherombildung und die damit verbundene Verkalkung deutlich reduziert20.
Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine biochemische Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in situ21,22. Es beruht auf der Spezifität von Antikörpern verschiedener Spezies, die Zielproteine von Interesse binden können, was den hochspezifischen Nachweis endogener Proteininteraktionen auf Einzelzellebene ermöglicht. Dabei müssen primäre Antikörper in einem Abstand von weniger als 40 nm an ihr Zielepitop binden, um den Nachweis zu ermöglichen23. Daher ist PLA gegenüber herkömmlichen Co-Immunpräzipitationsansätzen, bei denen mehrere Millionen Zellen benötigt werden, um endogene Proteininteraktionen nachzuweisen, von großem Vorteil. Bei PLA binden speziesspezifische sekundäre Antikörper, kovalent verknüpft mit DNA-Fragmenten (sogenannte Plus- und Minus-Sonden), die primären Antikörper und wenn die proteininteressierten Proteine interagieren, kommen Plus- und Minus-Sonden in unmittelbarer Nähe. Die DNA wird im folgenden Schritt ligiert und die Rolling Circle Amplification der zirkulären DNA wird ermöglicht. Während der Amplifikation binden fluoreszenzmarkierte komplementäre Oligonukleotide an die synthetisierte DNA, so dass diese Proteininteraktionen durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anzahl der aktiven SMAD-Transkriptionskomplexe unter atheroprotektiven und atheropronen SS-Bedingungen in vitro unter Verwendung von PLA quantitativ zu vergleichen. SS wird über ein programmierbares pneumatisches Pumpensystem erzeugt, das in der Lage ist, laminaren unidirektionalen Durchfluss definierter Füllstände zu erzeugen und schrittweise Erhöhungen der Durchflussraten zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht den Nachweis von Wechselwirkungen zwischen SMAD1/5 oder SMAD2/3 mit SMAD4 sowie von Mixed-R-SMAD-Komplexen. Es kann leicht erweitert werden, um Wechselwirkungen von SMADs mit transkriptionellen Co-Regulatoren oder auf andere Transkriptionsfaktorkomplexe als SMADs zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte des unten dargestellten Protokolls.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Protokolls. (A) Zellen, die in 6-Kanal-Objektträgern ausgesät sind, werden mit einem pneumatischen Pumpensystem einer Schubbeanspruchung ausgesetzt. (B) Feste Zellen werden für PLA-Experimente oder für Kontrollbedingungen verwendet. (C) Bilder von PLA-Experimenten werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der Analysesoftware ImageJ analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das hier beschriebene PLA-basierte Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, die Nähe von zwei Proteinen (z. B. deren direkte Interaktion) in ECs, die Scherspannung ausgesetzt sind, mit quantitativer und räumlicher Auflösung zu bestimmen. Durch den Einsatz von Strömungsobjektträgern mit mehreren parallelen Kanälen können mehrere verschiedene Proteininteraktionen gleichzeitig in Zellen unter identischen mechanischen Bedingungen untersucht werden. Im Gegensatz dazu verwenden speziell angefertigte Durchflusskamm…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Maria Reichenbach und Dr. Christian Hiepen für ihre Unterstützung beim Flow-Setup-System und Eleanor Fox und Yunyun Xiao für die kritische Lektüre des Manuskripts. P-L.M. wurde von der internationalen Max Planck Research School IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC) gefördert. PK wurde vom DFG-SFB1444 gefördert. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.
µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
FIJI | Image Analysis software | ||
Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
HUVECs | |||
ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |