Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

El análisis e identificación de proteínas no digeridas por espectrometría de masas se conoce como el análisis proteómico de arriba^{hacia abajo 1,2,3,4}. Ahora es una técnica establecida que utiliza ionización por electrospray (ESI)⁵ y analizadores de masa de alta resolución^6,y técnicas sofisticadas de disociación, por ejemplo, disociación por transferencia de electrones (ETD), disociación por captura de electrones (ECD)^7,fotodesociación ultravioleta (UV-PD)^8,etc.

La otra técnica de ionización suave es la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)^9,10,11 que se ha utilizado menos ampliamente para el análisis de arriba hacia abajo, en parte porque está acoplada principalmente a analizadores de masa de tiempo de vuelo (TOF), que tienen una resolución limitada en comparación con otros analizadores de masas. A pesar de estas limitaciones, los instrumentos MALDI-TOF y MALDI-TOF-TOF han sido explotados para el análisis rápido de arriba hacia abajo de proteínas puras y mezclas fraccionadas y no fraccionadas de proteínas. Para la identificación de proteínas puras, la desintegración en la fuente (ISD) es una técnica particularmente útil porque permite el análisis de espectrometría de masas (MS) de iones de fragmentos de ISD, así como la espectrometría de masas en tándem (MS / MS) de fragmentos de iones de proteínas que proporcionan fragmentos específicos de secuencia a menudo de los N- y C-termini de la proteína objetivo, análogo a la secuenciación de Edman^12,13 . Un inconveniente del enfoque ISD es que, como en la secuenciación de Edman, la muestra debe contener solo una proteína. El único requerimiento de proteína se debe a la necesidad de una atribución inequívoca de iones fragmento a un ion precursor. Si dos o más proteínas están presentes en una muestra, puede ser difícil asignar qué iones fragmento pertenecen a qué iones precursores.

La atribución de iones de fragmentos/iones precursores se puede abordar utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Al igual que con cualquier experimento clásico de MS / MS, los iones precursores se seleccionan en masa / se aíslan antes de la fragmentación, y los iones de fragmento detectados se pueden atribuir a un ion precursor específico. Sin embargo, las técnicas de disociación disponibles para este enfoque se limitan principalmente a la disociación inducida por colisión de alta energía (HE-CID)¹⁴ o a la desintegración posterior a la fuente (PSD)^15,16. HE-CID y PSD son más eficaces en la fragmentación de péptidos y proteínas pequeñas, y la cobertura de la secuencia puede, en algunos casos, ser limitada. Además, la DSP da como resultado una escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC) principalmente en el lado C-terminal de los residuos de ácido aspártico y glutámico por un fenómeno llamado efecto del ácido aspártico^17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS también ha encontrado una aplicación de nicho en la identificación taxonómica de microorganismos: bacterias^21,hongos²²y virus^23. Por ejemplo, los espectros de EM se utilizan para identificar bacterias desconocidas en comparación con una biblioteca de referencia de espectros de EM de bacterias conocidas utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones para la comparación. Este enfoque ha demostrado ser muy exitoso debido a su velocidad y simplicidad, aunque requiere un cultivo nocturno del aislado. Los iones proteicos detectados por este enfoque (generalmente por debajo de 20 kDa) comprenden una huella dactilar MS que permite la resolución taxonómica a nivel de género y especie y, en algunos casos, en la subespecie²⁴ y el nivel de cepa^25,26. Sin embargo, sigue siendo necesario no solo clasificar taxonómicamente los microorganismos potencialmente patógenos, sino también identificar factores específicos de virulencia, toxinas y factores de resistencia a los antimicrobianos (AMR). Para lograr esto, la masa de péptidos, proteínas o moléculas pequeñas se mide por EM y posteriormente se aísla y fragmenta por EM / EM.

Las bacterias patógenas a menudo transportan piezas circulares de ADN llamadas plásmidos. Los plásmidos, junto con los profagos, son un vector importante de transferencia horizontal de genes entre bacterias y son responsables de la rápida propagación de la resistencia a los antimicrobianos y otros factores de virulencia a través de las bacterias. Los plásmidos también pueden portar genes antibacterianos (AB), por ejemplo, colicina y bacteriocina. Cuando estos genes se expresan y las proteínas se secretan, actúan para desactivar la maquinaria de traducción de proteínas de las bacterias vecinas que ocupan el mismo nicho ambiental²⁷. Sin embargo, estas enzimas bactericidas también pueden representar un riesgo para el huésped que las produjo. En consecuencia, un gen es co-expresado por el huésped que inhibe específicamente la función de una enzima AB y se conoce como su proteína de inmunidad (Im).

Los antibióticos dañinos para el ADN como la mitomicina-C y la ciprofloxacina se utilizan a menudo para inducir la respuesta SOS en la E. coli productora de toxina Shiga (STEC) cuyo gen de la toxina Shiga(stx) se encuentra dentro de un genoma de profagos presente en el genoma bacteriano²⁸. Hemos utilizado previamente la inducción antibiótica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, y el análisis proteómico de arriba hacia abajo para detectar e identificar tipos y subtipos stx producidos por las cepas STEC^29,30,31,32. En el trabajo anterior, la cepa RM7788 de STEC O113:H21 se cultizó durante la noche en medios de agar suplementados con mitomicina-C. Sin embargo, en lugar de detectar la subunidad B anticipada de Stx2a en m/z ~7816, se detectó un ion proteico diferente en m/z ~7839 y se identificó como una proteína hipotética codificada por plásmidos de función desconocida³³. En el trabajo actual, identificamos dos proteínas AB-Im codificadas en plásmidos producidas por esta cepa utilizando inducción de antibióticos, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, y análisis proteómico de arriba hacia abajo utilizando un software independiente desarrollado para procesar y escanear secuencias de proteínas in silico derivadas de la secuenciación del genoma completo (WGS). Además, se incorporó al software la posibilidad de modificaciones posteriores a la traducción (PTM) que impliquen truncamiento de secuencia. Las proteínas de inmunidad se identificaron utilizando este software a partir de la masa medida del ion proteína madura y los iones de fragmento específicos de secuencia de PBC causados por el efecto del ácido aspártico y detectados por MS / MS-PSD. Finalmente, se identificó un promotor aguas arriba de los genes AB/Im en un genoma de plásmido que puede explicar la expresión de estos genes cuando esta cepa está expuesta a un antibiótico dañino para el ADN. Partes de este trabajo se presentaron en la Reunión y Exposición Virtual de otoño de 2020 de la National American Chemical Society (17-20 de agosto de 2020)³⁴.