JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Abstract

Dit protocol identificeert de immuniteitseiwitten van de bacteriedodende enzymen: colicine E3 en bacteriocine, geproduceerd door een pathogene Escherichia coli-stam met behulp van antibiotica-inductie, en geïdentificeerd door MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met software die intern is ontwikkeld. Het immuniteitseiwit colicine E3 (Im3) en het immuniteitseiwit van bacteriocine (Im-Bac) werden geïdentificeerd uit prominente b- en/of y-type fragmentionen gegenereerd door de polypeptide backbone cleavage (PBC) aan de C-terminale kant van asparaginezuur, glutaminezuur en asparagineresiduen door het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect. De software scant snel in silico-eiwitsequenties die zijn afgeleid van de hele genoomsequencing van de bacteriestam. De software verwijdert ook iteratief aminozuurresiduen van een eiwitsequentie in het geval dat de volwassen eiwitsequentie wordt afgekapt. Een enkele eiwitsequentie bezat massa- en fragmentionen die consistent waren met die gedetecteerd voor elk immuniteitseiwit. De kandidaatsequentie werd vervolgens handmatig geïnspecteerd om te bevestigen dat alle gedetecteerde fragmentionen konden worden toegewezen. De N-terminale methionine van Im3 werd post-translationeel verwijderd, terwijl Im-Bac de volledige sequentie had. Bovendien ontdekten we dat slechts twee of drie niet-complementaire fragmentionen gevormd door PBC nodig zijn om de juiste eiwitsequentie te identificeren. Ten slotte werd een promotor (SOS-box) geïdentificeerd vóór de antibacteriële en immuniteitsgenen in een plasmidegenoom van de bacteriestam.

Introduction

Analyse en identificatie van onverteerde eiwitten door massaspectrometrie wordt de top-down proteomische analyse1,2,3, 4genoemd. Het is nu een gevestigde techniek die gebruik maakt van elektrospray ionisatie (ESI)5 en hoge resolutie massaanalysatoren6, en geavanceerde dissociatie technieken, bijvoorbeeld elektron overdracht dissociatie (ETD), elektronenvangst dissociatie (ECD)7, ultraviolette foto-dissociatie (UV-PD)8, enz.

De andere zachte ionisatietechniek is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI)9,10,11 die minder uitgebreid is gebruikt voor de top-down analyse, deels omdat het voornamelijk is gekoppeld aan time-of-flight (TOF) massaanalysatoren, die een beperkte resolutie hebben in vergelijking met andere massaanalysatoren. Ondanks deze beperkingen zijn MALDI-TOF- en MALDI-TOF-TOF-instrumenten gebruikt voor de snelle top-down analyse van zuivere eiwitten en gefractioneerde en ongefractioneerde mengsels van eiwitten. Voor de identificatie van zuivere eiwitten is in-source decay (ISD) een bijzonder nuttige techniek omdat het massaspectrometrie (MS) analyse van ISD-fragmentionen mogelijk maakt, evenals tandem massaspectrometrie (MS / MS) van eiwitionfragmenten die sequentiespecifiek fragment leveren, vaak van de N- en C-termini van het doeleiwit, analoog aan Edman-sequencing12,13 . Een nadeel van de ISD-benadering is dat, net als bij Edman-sequencing, het monster slechts één eiwit mag bevatten. De enige eiwitbehoefte is te wijten aan de behoefte aan eenduidige toeschrijving van fragmentionen aan een voorloperion. Als er twee of meer eiwitten in een monster aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om toe te wijzen welke fragmentionen tot welke voorloperionen behoren.

Fragment ion/precursor ion attributie kan worden aangepakt met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Zoals bij elk klassiek MS/MS-experiment worden precursorionen massaal geselecteerd/geïsoleerd voorafgaand aan fragmentatie, en de gedetecteerde fragmentionen kunnen worden toegeschreven aan een specifiek voorloperion. De voor deze benadering beschikbare dissociatietechnieken zijn echter beperkt tot voornamelijk hoge-energie botsing-geïnduceerde dissociatie (HE-CID)14 of post-source decay (PSD)15,16. HE-CID en PSD zijn het meest effectief in het fragmenteren van peptiden en kleine eiwitten, en de sequentiedekking kan in sommige gevallen beperkt zijn. Bovendien resulteert PSD in polypeptide backbone cleavage (PBC) voornamelijk aan de C-terminale kant van asparagine- en glutaminezuurresiduen door een fenomeen dat het asparaginezuureffect wordt genoemd17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS heeft ook een nichetoepassing gevonden in de taxonomische identificatie van micro-organismen: bacteriën21,schimmels22en virussen23. MS-spectra worden bijvoorbeeld gebruikt om onbekende bacteriën te identificeren in vergelijking met een referentiebibliotheek van MS-spectra van bekende bacteriën met behulp van patroonherkenningsalgoritmen voor vergelijking. Deze aanpak is zeer succesvol gebleken vanwege de snelheid en eenvoud, hoewel het een nachtelijke kweek van het isolaat vereist. De eiwitionen die door deze benadering worden gedetecteerd (meestal minder dan 20 kDa) bestaan uit een MS-vingerafdruk die taxonomische resolutie mogelijk maakt op geslachts- en soortniveau en in sommige gevallen op de ondersoort24 en stamniveau25,26. Er blijft echter een noodzaak om niet alleen taxonomisch potentieel pathogene micro-organismen te classificeren, maar ook specifieke virulentiefactoren, toxines en antimicrobiële resistentie (AMR) factoren te identificeren. Om dit te bereiken, wordt de massa van peptiden, eiwitten of kleine moleculen gemeten door MS en vervolgens geïsoleerd en gefragmenteerd door MS / MS.

Pathogene bacteriën dragen vaak cirkelvormige stukjes DNA die plasmiden worden genoemd. Plasmiden, samen met profagen, zijn een belangrijke vector van horizontale genoverdracht tussen bacteriën en zijn verantwoordelijk voor de snelle verspreiding van antimicrobiële resistentie en andere virulentiefactoren over bacteriën. Plasmiden kunnen ook antibacteriële (AB) genen dragen, bijvoorbeeld colicine en bacteriocine. Wanneer deze genen tot expressie worden gebracht en de eiwitten worden uitgescheiden, werken ze om de eiwitvertalingsmachinerie van naburige bacteriën die dezelfde milieuniche bezetten uit te schakelen27. Deze bacteriedodende enzymen kunnen echter ook een risico vormen voor de gastheer die ze heeft geproduceerd. Als gevolg hiervan wordt een gen mede tot expressie gebracht door de gastheer dat specifiek de functie van een AB-enzym remt en wordt aangeduid als het immuniteitseiwit (Im).

DNA-beschadigende antibiotica zoals mitomycine-C en ciprofloxacine worden vaak gebruikt om de SOS-respons te induceren in Shiga-toxineproducerende E. coli (STEC) waarvan het Shiga-toxinegen(stx) wordt aangetroffen in een profaaggenoom dat aanwezig is in het bacteriële genoom28. We hebben eerder antibiotica-inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS en top-down proteomische analyse gebruikt om Stx-typen en subtypen geproduceerd door STEC-stammen29,30,31, 32te detecteren enteidentificeren. In het vorige werk werd STEC O113:H21 stam RM7788 ‘s nachts gekweekt op agarmedia aangevuld met mitomycine-C. In plaats van de verwachte B-subeenheid van Stx2a bij m/z ~7816 te detecteren, werd echter een ander eiwition gedetecteerd bij m/z ~7839 en geïdentificeerd als een plasmide-gecodeerd hypothetisch eiwit met onbekende functie33. In het huidige werk identificeerden we twee plasmide-gecodeerde AB-Im-eiwitten geproduceerd door deze stam met behulp van antibiotische inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, en top-down proteomische analyse met behulp van stand-alone software die is ontwikkeld om silico-eiwitsequenties afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) te verwerken en te scannen. Daarnaast werd de mogelijkheid van post-translation modifications (PTM) met sequentie-afkapping in de software opgenomen. De immuniteitseiwitten werden met behulp van deze software geïdentificeerd uit de gemeten massa van het volwassen eiwition en sequentiespecifieke fragmentionen van PBC veroorzaakt door het asparaginezuureffect en gedetecteerd door MS / MS-PSD. Ten slotte werd een promotor geïdentificeerd stroomopwaarts van de AB / Im-genen in een plasmide-genoom dat de expressie van deze genen kan verklaren wanneer deze stam wordt blootgesteld aan een DNA-beschadigend antibioticum. Delen van dit werk werden gepresenteerd op de National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 augustus 2020)34.

Protocol

1. Microbiologische monstervoorbereiding Ent 25 ml Luria-bouillon (LB) in een conische buis van 50 ml met E. coli O113:H21 stam RM7788 (of een andere bacteriestam) uit een glycerolvoorraad met behulp van een steriele lus van 1 μL. Beding de buis en de voorkweek op 37 °C met schudden (200 rpm) gedurende 4 uur. Aliquot 100 μL voorgekweekte bouillon en verspreid op een LB agarplaat aangevuld met 400 of 800 ng / ml mitomycine-C. Kweek agar platen statisch ‘s nachts in een incubator bij 37 °C….

Representative Results

Figuur 3 (bovenpaneel) toont de MS van STEC O113:H21 stam RM7788 ‘s nachts gekweekt op LBA aangevuld met 400 ng/ml mitomycine-C. Pieken bij m/z 7276, 7337 en 7841 waren eerder geïdentificeerd als cold-shock protein C (CspC), cold-shock protein E (CspE) en een plasmide-borne protein met onbekende functie, respectievelijk33. Het eiwition bij m/z 9780 [M+H]+ werd geanalyseerd door MS/MS-PSD zoals weergegeven in figuur 3 (onderste…

Discussion

Overwegingen bij het protocol
De belangrijkste sterke punten van het huidige protocol zijn de snelheid, eenvoud van monstervoorbereiding en het gebruik van een instrument dat relatief eenvoudig te bedienen, te trainen en te onderhouden is. Hoewel bottom-up en top-down proteomische analyse door vloeistofchromatografie-ESI-HR-MS alomtegenwoordig zijn en in veel opzichten veel beter dan top-down door MALDI-TOF-TOF, vereisen ze meer tijd, arbeid en expertise. De complexiteit van instrumenten kan vaak van …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Protein Biomarker Seeker software is vrij beschikbaar (gratis) door contact op te nemen met Clifton K. Fagerquist op clifton.fagerquist@usda.gov. We willen de steun van dit onderzoek erkennen door ARS, USDA, CRIS-subsidie: 2030-42000-051-00-D.

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image