Идентификация белков антибактериального иммунитета в кишечной палочке с использованием MALDI-TOF-TOF-MS/MS и нисходящего протеомного анализа

Анализ и идентификация непереваренных белков методом масс-спектрометрии называется нисходящим протеомным анализом^1,2,3,4. В настоящее время это устоявшийся метод, который использует электрораспрозревшение ионизацию (ESI)⁵ и анализаторы массы высокого разрешения^6,а также сложные методы диссоциации, например, диссоциацию переноса электронов (ETD), диссоциацию захвата электронов (ECD)^7,ультрафиолетовую фотодиссоциацию (UV-PD)⁸и т. Д.

Другим методом мягкой ионизации является матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)^9,10,11, которая менее широко используется для анализа сверху вниз, отчасти потому, что она в основном связана с анализаторами массы времени пролета (TOF), которые имеют ограниченное разрешение по сравнению с другими анализаторами массы. Несмотря на эти ограничения, инструменты MALDI-TOF и MALDI-TOF-TOF были использованы для быстрого нисходящего анализа чистых белков и фракционированных и нефракционированных смесей белков. Для идентификации чистых белков распад в источнике (ISD) является особенно полезным методом, поскольку он позволяет проводить масс-спектрометрический (MS) анализ ионов фрагментов ФРАГМЕНТОВ ISD, а также тандемную масс-спектрометрию (MS / MS) фрагментов ионов белков, обеспечивающих последовательно-специфический фрагмент часто из N- и C-терминов целевого белка, аналогично секвенированию Эдмана^12,13 . Недостатком подхода ISD является то, что, как и в секвенировании Эдмана, образец должен содержать только один белок. Одна потребность в белке обусловлена необходимостью однозначного отнесения фрагментов ионов к иону-предшественнику. Если в образце присутствуют два или более белков, может быть трудно назначить, какие фрагменты ионов принадлежат к каким ионам-предшественникам.

Атрибуция фрагментов ионов/ионов-предшественников может быть решена с помощью MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Как и в любом классическом эксперименте с МС/МС, ионы-предшественники массово выбираются/выделяются до фрагментации, и обнаруженные фрагментированные ионы могут быть отнесены к конкретному иону-предшественнику. Однако методы диссоциации, доступные для этого подхода, ограничены в первую очередь диссоциацией, вызванной столкновением высоких энергий (HE-CID)¹⁴ или распадом после источника (PSD)^15,16. HE-CID и PSD наиболее эффективны при фрагментации пептидов и небольших белков, и охват последовательности в некоторых случаях может быть ограничен. Кроме того, PSD приводит к расщеплению полипептидной магистрали (PBC) в первую очередь на стороне C-концевой стороны остатков аспарагиновой и глутаминовой кислоты явлением, называемым эффектом аспарагиновой кислоты^17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS также нашла нишу в таксономической идентификации микроорганизмов: бактерий^21,грибов²²и вирусов^23. Например, спектры MS используются для идентификации неизвестных бактерий путем сравнения с эталонной библиотекой MS-спектров известных бактерий с использованием алгоритмов распознавания образов для сравнения. Этот подход оказался весьма успешным из-за его скорости и простоты, хотя и требовал ночной культивирования изолята. Ионы белка, обнаруженные при этом подходе (обычно менее 20 кДа), содержат отпечаток РС, позволяющий таксономическое разрешение на уровне рода и вида, а в некоторых случаях и на подвиде²⁴ и штамме^{уровня 25,26.} Однако остается необходимость не только таксономически классифицировать потенциально патогенные микроорганизмы, но и идентифицировать специфические факторы вирулентности, токсины и факторы устойчивости к противомикробным препаратам (УВМ). Для этого масса пептидов, белков или малых молекул измеряется РС и впоследствии выделяется и фрагментируется МС/МС.

Патогенные бактерии часто несут круговые куски ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, наряду с профагами, являются основным вектором горизонтального переноса генов между бактериями и отвечают за быстрое распространение устойчивости к противомикробным препаратам и других факторов вирулентности среди бактерий. Плазмиды могут также нести антибактериальные (AB) гены, например, колицин и бактериоцин. Когда эти гены экспрессируются и белки секретируются, они действуют, чтобы отключить механизм трансляции белка соседних бактерий, занимающих ту же экологическую нишу^27. Однако эти бактерицидные ферменты также могут представлять риск для хозяина, который их произвел. В результате ген совместно экспрессируется хозяином, который специфически ингибирует функцию фермента AB и называется его белком иммунитета (Im).

Повреждающие ДНК антибиотики, такие как митомицин-С и ципрофлоксацин, часто используются для индуцирования ответа SOS у токсин-продуцирующей шига E. coli (STEC), чей ген токсина Шига(stx) обнаружен в геноме профага, присутствующем в бактериальном геноме^28. Ранее мы использовали индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ для обнаружения и идентификации типов и подтипов Stx, продуцируемых штаммами STEC^29,30,31,32. В предыдущей работе штамм STEC O113:H21 RM7788 культивировали в течение ночи на агаровых средах, дополненных митомицином-С. Однако вместо того, чтобы обнаружить ожидаемую B-субъединицу Stx2a при m/z ~7816, другой ион белка был обнаружен при m/z ~7839 и идентифицирован как плазмидно-кодируемый гипотетический белок неизвестной функции^33. В текущей работе мы идентифицировали два плазмидно-кодированных белка AB-Im, продуцируемых этим штаммом, используя индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ с использованием автономного программного обеспечения, разработанного для обработки и сканирования последовательностей белков в силико, полученных из секвенирования всего генома (WGS). Кроме того, в программное обеспечение была включена возможность модификаций постперевода (PTM), включающих усечение последовательностей. Белки иммунитета были идентифицированы с помощью этого программного обеспечения из измеренной массы зрелого иона белка и последовательно-специфических фрагментов ионов из ПБК, вызванных эффектом аспарагиновой кислоты и обнаруженных MS / MS-PSD. Наконец, промотор был идентифицирован выше генов AB / Im в геноме плазмиды, что может объяснить экспрессию этих генов, когда этот штамм подвергается воздействию повреждающего ДНК антибиотика. Части этой работы были представлены на виртуальной встрече и выставке Национального американского химического общества осень 2020 года (17-20 августа 2020 года)³⁴.