Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Joshua B.R. White; Daniel P. Maskell; Andrew Howe; Martin Harrow; Daniel K. Clare; C. Alistair Siebert; Emma L. Hesketh; Rebecca F. Thompson

doi:10.3791/62415

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Biochemistry

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Published: May 29, 2021

doi:

10.3791/62415

Joshua B.R. White¹, Daniel P. Maskell¹, Andrew Howe², Martin Harrow², Daniel K. Clare², C. Alistair Siebert², Emma L. Hesketh¹, Rebecca F. Thompson¹

¹Astbury Centre Structural Molecular Biology, School Molecular and Cellular Biology, Faulty Biological Sciences,University of Leeds, ²Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

La determinación de la estructura de complejos macromoleculares utilizando crioEM se ha convertido en rutina para ciertas clases de proteínas y complejos. Aquí, se resume esta tubería (preparación de muestras, detección, adquisición y procesamiento de datos) y los lectores se dirigen hacia recursos y variables más detallados que pueden alterarse en el caso de especímenes más desafiantes.

Abstract

La criomicroscopía electrónica (cryoEM) es una técnica poderosa para la determinación de la estructura de complejos macromoleculares, a través del análisis de partículas individuales (SPA). El proceso general consiste en i) vitrificar la muestra en una película delgada apoyada en una rejilla crioEM; ii) examinar la muestra para evaluar la distribución de partículas y la calidad del hielo; iii) si la cuadrícula es adecuada, recopilar un conjunto de datos de una sola partícula para su análisis; y iv) procesamiento de imágenes para obtener un mapa de densidad EM. En este protocolo, se proporciona una descripción general de cada uno de estos pasos, centrándose en las variables que un usuario puede modificar durante el flujo de trabajo y la solución de problemas comunes. Con la operación remota del microscopio convirtiéndose en estándar en muchas instalaciones, se describirán las variaciones en los protocolos de imágenes para ayudar a los usuarios en una operación eficiente y la obtención de imágenes cuando el acceso físico al microscopio es limitado.

Introduction

CryoEM de partícula única
Para investigar la vida a nivel molecular debemos entender la estructura. Hay muchas técnicas disponibles para sondear la estructura de las proteínas, como la RMN, la cristalografía de rayos X, la espectrometría de masas y la microscopía electrónica (EM). Hasta la fecha, la mayoría de las estructuras depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) se han resuelto mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, a partir de ~ 2012, la microscopía crioelectrónica (cryoEM) se convirtió en una técnica convencional para la determinación de la estructura de proteínas y su uso aumentó dramáticamente. El número total de mapas EM depositados en el Banco de Datos de Microscopía Electrónica (EMDB) (a diciembre de 2020) fue de 13.421 en comparación con 1.566 en 2012 (Figura 1, www.ebi.co.uk). En 2012, el número de coordenadas atómicas modeladas en mapas de densidad crioEM, depositadas en el PDB fue de solo 67, pero a partir de diciembre de 2020, se han depositado 2.309 estructuras hasta ahora, un aumento de 35 veces. Este crecimiento subyacente en la calidad y cantidad de los mapas de densidad crioEM producidos, a veces denominados la “revolución de la resolución”¹, fue causado por una coalescencia de avances en múltiples áreas: el desarrollo de nuevas cámaras para imágenes conocidas como detectores de electrones directos; nuevo software; y microscopios más estables2,3,4.

Figura 1: Envíos acumulativos al EMDB desde 2012 hasta diciembre de 2020. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El análisis de partículas individuales (SPA) es una poderosa herramienta para generar conocimiento biológico en una amplia variedad de tipos de muestras mediante la elucidación de estructuras de alta resolución de complejos ^aislados5,6 incluyendo ^virus7,8, proteínas de ^membrana9,10, ensamblajes helicoidales11 y otros complejos macromoleculares dinámicos y heterogéneos12,13, cuyos tamaños varían según órdenes de magnitud (desde 39 kDa ^14,15 a decenas de megadaltons). Aquí, se describe un protocolo para una canalización estándar para cryoEM SPA desde la muestra hasta la estructura.

Antes de embarcarse en esta tubería, una muestra purificada debe someterse a un análisis bioquímico para evaluar sus posibilidades de éxito aguas abajo. La preparación de una muestra adecuada es posiblemente la mayor barrera para la SPA, particularmente para complejos transitorios y heterogéneos (tanto composicionales como conformacionales). La preparación del complejo macromolecular debe contener la menor cantidad de contaminantes posible, a una concentración suficiente para producir muchas partículas en cada micrografía crioEM, y en una composición tampón muy adecuada para el análisis crioEM. Ciertos componentes tampón, incluyendo sacarosa, glicerol y altas (~> concentraciones de sales de 350 mM, dependiendo del tamaño de la muestra, las propiedades y otros componentes tampón) pueden interferir con el proceso de vitrificación o reducir la relación señal-ruido en las imágenes, dificultando la determinación de la ^estructura16.

Por lo general, como mínimo, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y el análisis de gel SDS-PAGE deben utilizarse para evaluar la pureza de la ^muestra17,18, pero el dicroísmo circular, los ensayos funcionales, el SEC junto con la dispersión de luz multiángulo y los ensayos de estabilidad térmica son herramientas útiles para el análisis cualitativo de preparaciones complejas macromoleculares antes del análisis crioEM. Sin embargo, los resultados de estos análisis bioquímicos pueden arrojar poca información sobre la heterogeneidad estructural de la muestra y su comportamiento en una cuadrícula crioEM. Por esta razón, la EM de tinción negativa se utiliza rutinariamente como una herramienta rápida, barata y potente para evaluar la heterogeneidad composicional y conformacional y, por lo tanto, una buena manera de determinar qué fracción de elución de una purificación es más prometedora, o para detectar diferentes composiciones ^tampón19,20. Una vez que se ha identificado una muestra prometedora, podemos proceder a la tubería de crioEM SPA. La tinción negativa no siempre se alinea con los resultados posteriores observados en crioEM; a veces una muestra se ve pobre por mancha negativa, pero mejora cuando se ve en hielo vítreo en crioEM. Por el contrario, a veces las muestras se ven excelentes durante los pasos de tinción negativa, pero requieren una optimización adicional significativa cuando progresan a crioEM. Sin embargo, en la mayoría de los casos la tinción negativa proporciona un paso útil de control de calidad.

Vitrificación
El ambiente hostil dentro del sistema de vacío del microscopio electrónico causa daños tanto por deshidratación como por radiación a especímenes biológicos no ^fijos21. Por lo tanto, para obtener imágenes de la muestra en un estado similar al nativo, el espécimen biológico debe preservarse antes de la obtención de imágenes. Para preparaciones purificadas de complejos macromoleculares, la vitrificación es el método de elección para permitir su visualización por crioEM mientras se preservan los detalles atómicos del complejo. El descubrimiento de la vitrificación como método de preparación de muestras fue un avance fundamental en la microscopía electrónica de especímenes biológicos, por lo que Dubochet fue reconocido en el Premio Nobel de Química 2017. La vitrificación de muestras implica la creación de una capa delgada de solución que contiene la muestra de interés, típicamente de decenas de nm de espesor, suspendida en un soporte de rejilla crioEM. La película delgada se congela extremadamente rápidamente en un criógeno como el etano líquido a ~ -175 ° C. La velocidad de congelación es de ~¹⁰⁶ °C/s, lo suficientemente rápida como para que se forme hielo amorfo o vítreo, suspendiendo la muestra en una película delgada y ^sólida22.

La variable inicial a considerar es el soporte de red crioEM ^elegido23. Una rejilla EM consiste típicamente en una película de carbono amorfa con perforaciones (ya sean regulares o irregulares), sobre una estructura de soporte. La estructura de soporte es típicamente una rejilla metálica circular de 3,05 mm de diámetro, generalmente hecha de cobre, pero se pueden utilizar otros metales como el oro o el molibdeno (que tiene propiedades de expansión térmica ^preferidas24). A veces, se aplica un soporte delgado y continuo adicional a través de la rejilla, como grafeno, óxido de grafeno o una capa de carbono amorfa delgada (~ 1-2 nm). Si bien las rejillas crioEM estándar (más comúnmente cobre de malla 400-200 con un soporte de carbono perforado (1,2 μm redondos separados por 1,3 μm (r1.2 / 1.3), o 2 μm separados por 2 μm de carbono (r2/2)) de soporte de carbono, aunque hay muchos patrones diferentes disponibles) se han utilizado en la gran mayoría de las estructuras reportadas hasta la fecha, se han reportado nuevas tecnologías de rejilla con conductividad mejorada y movimiento reducido de ^muestras25 . Las rejillas seleccionadas se someten a un tratamiento de limpieza por descarga de resplandor/plasma para hacerlas hidrófilas y susceptibles de aplicación de ^muestras26.

Después de la descarga de resplandor, la siguiente etapa es la formación de película delgada. Esta película delgada se forma más comúnmente con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido de la rejilla. Si bien esto se puede llevar a cabo manualmente, una serie de dispositivos de congelación por inmersión están disponibles comercialmente, incluidos el Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) y CP3 (Gatan). Con estos dispositivos, ~ 3-5 μL de muestra en solución se aplica a la rejilla EM, seguido de secar el exceso de solución con papel de filtro. La rejilla, con una película delgada suspendida a través de ella, se sumerge en etano líquido enfriado por nitrógeno líquido (_LN2) a ~ -175 ° C. Una vez congelada, la rejilla se mantiene a una temperatura por debajo del punto de desvitrificación (-137 °C) antes y durante la toma de imágenes.

Cribado de muestras y recopilación de datos
Después de la vitrificación de una cuadrícula crioEM, la siguiente etapa es examinar la cuadrícula para evaluar su calidad y determinar si la cuadrícula es adecuada para proceder a la recopilación de datos de alta resolución. Una rejilla crioEM ideal tiene hielo vítreo (opuesto al hielo cristalino) con el espesor del hielo suficiente para acomodar la dimensión más larga de la muestra, asegurando que el hielo circundante contribuya con el menor ruido posible a la imagen resultante. Las partículas dentro del hielo deben tener un tamaño y (si se conocen) forma consistentes con la bioquímica, e idealmente ser monodispersas con una distribución aleatoria de las orientaciones de las partículas. Finalmente, la cuadrícula debe tener suficientes áreas de calidad suficiente para satisfacer la longitud de recopilación de datos deseada. Dependiendo de la muestra, esto puede tomar muchas iteraciones de vitrificación y cribado hasta que se produzcan rejillas óptimas. Tanto afortunada como desafortunadamente, hay una gran variedad de variables que pueden ser probadas empíricamente para alterar la distribución de partículas en las rejillas crioEM (revisado en ^16,27). En este manuscrito se muestran resultados representativos para un proyecto de proteína de ^membrana10.

Una vez que se ha identificado una cuadrícula adecuada, la recopilación de datos puede continuar. Varios modelos de microscopios electrónicos de criotransmisión para especímenes biológicos están optimizados para recopilar datos de alta resolución de manera automatizada. Normalmente, los datos se recopilan en sistemas de 300 kV o 200 kV. La recopilación automatizada de datos se puede lograr utilizando software que incluye EPU (Thermo Fisher Scientific)²⁸, ^Leginon29, ^JADAS30 y ^{SerialEM31,32}. Una recopilación de datos automatizada con detectores modernos generalmente da como resultado terabytes (TB) de datos sin procesar en un período de 24 horas (los conjuntos de datos promedio tienen un tamaño de ~ 4 TB).

Debido a las restricciones de COVID-19 vigentes en gran parte del mundo (hora de escribir este artículo en diciembre de 2020), muchas instalaciones de microscopía se han trasladado a ofrecer acceso remoto. Una vez que las rejillas se han cargado en el cargador automático de un microscopio, la adquisición de datos se puede realizar de forma remota.

Procesamiento de imágenes y construcción de modelos
Cuando una sesión de recopilación de datos puede ser típicamente de 0,5 a 4 días, el procesamiento posterior de imágenes puede tardar muchas semanas y meses, dependiendo de la disponibilidad de recursos informáticos. Es estándar para los pasos iniciales de procesamiento de imágenes, a saber, la corrección de movimiento y la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) que tienen lugar “sobre la marcha” ^33,34. Para el procesamiento posterior, hay una gran cantidad de suites de software disponibles. Las partículas son ‘recogidas’ y extraídas de ^{micrografías35,36}. Una vez que se extraen las partículas, un protocolo estándar sería procesar las partículas a través de varias rondas de clasificación (tanto en dos dimensiones (2D) como en tres dimensiones (3D) y / o centradas en regiones específicas de interés) para llegar a un subconjunto homogéneo de partículas. Este subconjunto homogéneo de partículas se promedia para producir una reconstrucción 3D. En este punto, los datos a menudo se corrigen aún más para producir el mapa de mayor calidad posible, por ejemplo, a través del refinamiento de CTF, las correcciones de ^{distorsión37} y el pulido ^bayesiano38. El resultado de este procesamiento de imágenes es un mapa crioEM 3D del espécimen biológico de interés. El rango de resolución alcanzado en un experimento automatizado de partículas individuales “estándar” a partir de una cuadrícula de calidad suficiente, con datos recopilados en un sistema de microscopio de 300 kV es típicamente entre 10 Å y 2 Å dependiendo del tamaño y la flexibilidad del complejo proteico. Con un espécimen ideal, ahora se han alcanzado resoluciones de ~1.2 Å utilizando flujos de trabajo ^SPA5. Si bien este protocolo detalla los pasos hacia la obtención de un mapa de densidad EM, una vez que esto está en la mano, se puede interpretar aún más mediante el ajuste y refinamiento de un modelo de proteína (si la resolución es < 3.5 Å) o la construcción de ^novo39. Los datos asociados con los experimentos de determinación de estructuras se pueden depositar en repositorios públicos en línea, incluidos los mapas de densidad EM (Banco de Datos de Microscopía Electrónica)⁴⁰, las coordenadas atómicas resultantes (Banco de Datos de Proteínas)⁴¹ y los conjuntos de datos en bruto (Archivo de Imágenes Públicas de Microscopía Electrónica)⁴².

En este protocolo, el complejo proteico de membrana externa RagAB (~340 kDa) de Porphyromonas gingivalis se utiliza como ejemplo complejo macromolecular10 (EMPIAR-10543). Para aquellos que son nuevos en cryoEM, el soporte para muestras a través de esta tubería desde la muestra hasta la estructura está disponible, sujeto a revisión por pares, a través de esquemas de acceso financiados como iNEXT Discovery e Instruct.

Protocol

1. Vitrificación de rejilla NOTA: Para todos los pasos de los pasos 1 y 2, asegúrese de que todas las herramientas estén limpias, secas y a temperatura ambiente antes de enfriarlas a la temperatura LN2 , utilizando LN2 recién decantado para reducir la contaminación por hielo. Siempre que sea posible, trabaje dentro de un ambiente controlado por humedad con < 20% de humedad relativa. Asegúrese de que el equipo de protección personal adecuado y la documentación de H&S estén en su lugar antes de comenzar a trabajar. Asegúrese de que la muestra de interés esté lista para la preparación de la muestra. Elija las rejillas crioEM apropiadas y asegúrese de que se hayan vuelto hidrófilas utilizando la descarga de resplandor o el tratamiento con plasma. Una amplia variedad de sistemas y variaciones del protocolo están disponibles, pero todos implican colocar las rejillas en un sistema de descarga de resplandor / limpieza de plasma y ejecutar un programa que bombeará la cámara al nivel de vacío deseado, antes de introducir una mezcla de gas específica / vapor químico o aire en el sistema. Una corriente eléctrica pasa a través del sistema, ionizando las partículas de gas e induciendo que la superficie de las redes se vuelva más hidrófila. Encienda el dispositivo de congelación por inmersión para la vitrificación de la red encendiendo el sistema con el interruptor de encendido en la parte posterior y espere a que se cargue la pantalla táctil. Usando el lápiz óptico o los dedos provistos, en la consola, establezca la temperatura de trabajo deseada de la cámara (el rango disponible es de 4-60 ° C, recomendado para la mayoría de las macromoléculas de 4-6 ° C). Llene el humidificador con 50 ml de agua de laboratorio tipo II con una jeringa, a través del tubo de goma en la parte inferior del humidificador. Asegúrese de eliminar el aire atrapado en la jeringa antes del llenado. Tenga cuidado de no llenar en exceso el humidificador o el agua exudará en la cámara. Una vez que el humidificador esté lleno, retire el émbolo de la jeringa en 5-10 ml para crear un sello de vacío. En la consola, establezca la humedad relativa deseada para la cámara (el rango disponible es de 0-100%, normalmente se usa una humedad de 95-100%). Deje que la humedad se “apague” hasta inmediatamente antes de la fabricación de la rejilla para que la cámara no se moje demasiado. Obtenga las pinzas del dispositivo de congelación por inmersión y el papel de filtro cortados al tamaño correcto para que quepan en las almohadillas, ya sea comprados o utilizando un sello para cortar una abertura del tamaño apropiado. Prepare el criógeno para la congelación por inmersión. Coloque el soporte de caja de crio-rejilla de metal, la copa de criógeno y las patas de araña de metal en el recipiente de refrigerante. Enfríe el recipiente llenando la cámara exterior con LN2. Mantenga la cámara exterior recargada para cubrir la parte superior del soporte de la caja de crio-rejilla. Agregue ~ 1 cm de LN2 adicional a la copa de criógeno para ayudar al equilibrio del sistema a la temperatura de LN2 .NOTA: El anillo anticontaminación se puede utilizar para limitar la condensación de aire húmedo alrededor de la copa criogénica y conducir a la contaminación por crio-refrigerante / etano. Esto generalmente no se requiere en un ambiente controlado por humedad. Si usa el anillo anticontaminación, tenga cuidado de no llenar demasiado el recipiente con LN2 o puede derramarse cuando el anillo se presiona en el recipiente más adelante en el proceso. Espere de 3 a 5 minutos para observar la ebullición de las patas de araña, y luego espere otros 3 minutos para asegurarse de que la taza de criógeno esté lo suficientemente fría como para condensar el medio de vitrificación. Licuar el criógeno (etano líquido) en la copa de criógeno. Tome el tubo del cilindro de etano con tubos delgados y una boquilla para dispensar el gas. Una punta de pipeta P200 con la abertura abierta cortando la punta con una cuchilla de afeitar es ideal aquí. Se necesita una apertura más amplia para evitar que el etano se solidifique en la punta y bloquee el flujo de gas. Asegurándose de que la copa de criógeno no contenga LN2 restante, tome la boquilla de gas etano y colóquela dentro de la copa de criógeno. Usando el regulador del cilindro de gas, inicie un flujo bajo y dispense gas criógeno en la copa de criógeno para condensar el gas. Mantenga la punta desde la que fluye el gas presionada directamente contra la pared de la copa criogénica, pero muévala suavemente hacia adelante y hacia atrás en un movimiento de golpeteo contra la superficie. Regule el flujo del gas para permitir que un flujo bajo y constante comience a condensarse / licuarse de manera controlada dentro de la copa criogénica. Llene la taza justo debajo del borde de la araña plateada y detenga el flujo de gas, luego retire la línea de gas con cuidado para evitar contaminar el LN2 circundante con etano. Rellene el recipiente de refrigerante con LN2, teniendo mucho cuidado de no derramar nada en el etano líquido. Deje las patas de las arañas en posición durante ~ 3-5 minutos para asegurarse de que el etano líquido se equilibre a una temperatura suficientemente fría. El criógeno comenzará a verse turbio / ligeramente opaco. Esto indica que está cerca de su punto de congelación. En esta etapa, use pinzas para eliminar la araña. Mientras el LN2 se mantenga dentro del recipiente que rodea la copa criogénica, el etano ahora permanecerá licuado y adecuado para la vitrificación durante 1-2 h. Sin embargo, trate de completar el procedimiento lo más rápido posible, especialmente en habitaciones sin control de humedad, para reducir la contaminación por hielo.NOTA: Si la araña parece estar “pegada”, use un objeto de metal como una tuerca y sosténgala contra las patas de la araña para calentarlas ligeramente, y luego retire las patas. Prepare el dispositivo de congelación por inmersión y los accesorios para la vitrificación de muestras. Agregue cajas de almacenamiento de rejilla al soporte de caja de crio-rejilla de metal y durante todo el procedimiento asegúrese de que el LN2 se mantenga recargado hasta justo por encima del nivel de las cajas de rejilla (generalmente cada ~ 5 min). En la pantalla del dispositivo de congelación por inmersión, en el cuadro Parámetros del proceso , ingrese los parámetros elegidos, que incluyen: tiempo de borrado (el tiempo en que las almohadillas del dispositivo de congelación por inmersión se unirán), fuerza (la distancia de las almohadillas de secado de la cuadrícula, que altera el gradiente de formación de hielo) y total (número de veces que las almohadillas de borrado se reunirán). Elija estos parámetros en función del dispositivo de congelación por inmersión individual y el comportamiento de la macromolécula. Los valores típicos son una fuerza de borrado entre 0 y 5, un tiempo de borrado de 1-6 s y un total de borrado de 1. El tiempo de espera típico (tiempo entre el inicio de la mancha y el comienzo de la mancha) y el tiempo de drenaje (tiempo después de la mancha antes de la caída) es de 0-2 s.NOTA: Dependiendo de las preferencias del usuario, se pueden seleccionar opciones adicionales en la sección Opciones, Varios , incluyendo Usar pedal para pasar al siguiente paso en cada pulsación, Omitir transferencia de cuadrícula (omite el paso final donde el brazo de la pinza se eleva ligeramente), Apagar la humedad durante el proceso (mientras se aplica la muestra, detiene la humidificación activa de la cámara, lo que puede dificultar la visualización de la rejilla) y Autoraise Ethanelift (combina el paso de las pinzas que se elevan en la cámara y el levantamiento del contenedor de refrigerante, omite el paso del contenedor de etano ). Aquí, todas estas opciones están activadas. Coloque el recipiente de refrigerante de forma segura en el brazo de la plataforma móvil debajo de la cámara Inserte papel secante fresco en cada brazo secante asegurándose de que los clips de anillo de plástico estén asegurados. Cada papel de filtro permitirá 16 blots (los brazos giran el papel secante). Presione el botón Restablecer borrado de papel en la sección Controles . Ejecute 1 ciclo completo del proceso de vitrificación del dispositivo de congelación por inmersión para garantizar que cada parte móvil se comporte como se esperaba. Pulse (o utilice el pedal) para colocar una nueva cuadrícula, luego Iniciar proceso y, a continuación, Procesar y Continuar. En esta etapa, observe para asegurarse de que los brazos secantes estén en contacto entre sí como se esperaba. Encienda el humidificador. Se producirá vapor de agua (siempre y cuando la humedad establecida sea más alta que actualmente en la cámara). El espécimen de interés ahora puede ser vitrificado. Use el pedal o Coloque New Grid y la varilla de inmersión descenderá de la cámara permitiendo que las pinzas se unan al soporte. Usando las pinzas del dispositivo de congelación por inmersión, recoja la rejilla crioEM descargada por resplandor / limpia con plasma deseada, teniendo cuidado de anotar qué lado es el lado correcto que se utilizará para la aplicación de muestras de acuerdo con el fabricante de la rejilla. Recoge la rejilla por la llanta, teniendo cuidado de evitar el contacto excesivo/innecesario con las pinzas, ya que esto dañará el soporte. Asegure la rejilla en las pinzas moviendo el clip negro hacia abajo hasta la parte estriada de las pinzas. La rejilla debe sujetarse de forma segura, pero el clip no debe estar demasiado abajo, ya que entrará en contacto con las almohadillas de borrado, lo que provocará una limpieza irreproducible y, más tarde, las pinzas deberán mantenerse por debajo de este punto al soltar el clip. Coloque las pinzas del dispositivo de congelación por inmersión que sostienen la rejilla crioEM en el brazo neumático con el lado correcto frente a su mano dominante. El diseño de las pinzas y la cámara del dispositivo de congelación por inmersión son tales que la muestra se puede aplicar a través del lado derecho o izquierdo de la cámara, de acuerdo con la mano del usuario.NOTA: La aplicación de la muestra en diferentes lados con los mismos parámetros de borrado rara vez da como resultado resultados comparables, por lo que los investigadores zurdos pueden necesitar ajustar sus parámetros de borrado independientemente de sus colegas diestros. Presione Start Process y la rejilla sostenida en las pinzas se llevará a la cámara y se levantará el recipiente de refrigerante. Presione Proceso y las pinzas moverán la rejilla a la posición donde se puede usar una pipeta para aplicar la muestra a la rejilla. Abra el puerto lateral que mira hacia el lado correcto de la rejilla y aplique la muestra mediante pipeteo, asegurándose de que la punta de la pipeta no toque la rejilla, ya que puede provocar daños en el soporte de la rejilla / doblando la rejilla, pero dispense el líquido lo suficientemente cerca como para que la gota se dispense en la rejilla. Típicamente, se aplican 3-5 μL. Presione Continuar y los parámetros predefinidos por el usuario borrarán la rejilla y luego sumergirán las pinzas con la rejilla montada en la copa de refrigerante para la vitrificación de la muestra. Las pinzas descenderán junto con el brazo que sostiene el recipiente de refrigerante y el refrigerante, manteniendo la rejilla sumergida en el criógeno. Transfiera la rejilla de la copa de criógeno a la caja de almacenamiento de rejilla sumergida en LN2. Separe las pinzas del brazo de la pinza, teniendo mucho cuidado de no entrar en contacto con la rejilla vitrificada con los lados de la copa criogénica. Ajuste el agarre para que las pinzas se sujeten cómodamente. Tan rápido y cuidadosamente como sea posible, mueva la rejilla del criógeno al LN2. Con una mano, sostenga las pinzas cerradas con los dedos y con la otra mano, deslice el clip negro hacia arriba fuera del camino, manteniendo las pinzas cerradas. Reajuste el agarre y manipule la rejilla en la caja de almacenamiento de la rejilla. Repita los pasos 1.10-1.19 hasta que se hagan todas las cuadrículas (una sesión típica implicará hacer 4-12 cuadrículas). Almacene todas las cajas de almacenamiento de red que contengan rejillas en LN2 dewar hasta las siguientes etapas. 2. Rejillas de recorte para cargar en un microscopio de carga automática Recorte las cuadrículas en el ensamblaje de la cuadrícula automática de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente 28. 3. Inicio de sesión remoto seguro en microscopios NOTA: Con los controles de COVID-19 en el momento de escribir este artículo, pero también con las preocupaciones ambientales asociadas con los viajes internacionales, más instalaciones de microscopía han estado ofreciendo servicios donde el usuario opera de forma remota. El método de implementación para esto variará de acuerdo con la configuración de TI local de cada instalación y las necesidades de su comunidad de usuarios internos y externos. Aquí se describe el proceso para acceder de forma remota a los crioEMs en eBIC y controlar el microscopio a través del software EPU. Inicie sesión de forma remota en cryoEM’ s. El inicio de sesión remoto se media a través del software NoMachine para acceder a la PC de soporte del microscopio y está configurado para permitir el acceso solo a los usuarios que están registrados en una visita a través de las credenciales de inicio de sesión FedID de los usuarios. El acceso permanece activo solo durante la duración de la sesión. Abra NoMachine e inicie una nueva conexión NX para nx-cloud.diamond.ac.uk con autenticación de contraseña. Abra la conexión e inicie sesión con el nombre de usuario fedid@fed.cclrc.ac.uk y la contraseña de FedID. Haga doble clic en el icono correspondiente al microscopio correspondiente de las opciones disponibles para abrir una conexión con el PC de soporte correspondiente. Introduzca el nombre de usuario clrc\FedID y la contraseña en la pantalla de inicio de sesión de Windows. Abra el software TeamViewer desde el icono del escritorio y conéctese a PartnerID: TEM con la contraseña proporcionada. Esto establece la conexión desde el PC de soporte al PC TEM. El botón Siguiente monitor de la cinta de TeamViewer se puede utilizar para alternar entre la interfaz de usuario del microscopio y la ventana de EPU. Las funciones del microscopio pueden ser controladas por los usuarios directamente a través de la interfaz EPU. 4. Carga de muestras en un microscopio de carga automática y detección de hielo y calidad de la muestra NOTA: En esta sección se utiliza un microscopio con un cargador automático y un software EPU para la detección de muestras, pero esto se puede lograr utilizando otro software y un sistema de entrada lateral y crioEMs de otros fabricantes. Cargue las rejillas recortadas en el cargador automático del microscopio como se describió anteriormente28. En la pestaña cargador automático de la interfaz de usuario del microscopio, anote el cuadro de diálogo Opciones con la flecha y pulse el botón Inventario . Esto verificará secuencialmente cada posición en el cassette para determinar si hay un cartucho presente. Las ranuras ocupadas se etiquetarán en azul. Si se han asignado todas las ranuras ocupadas, presione el botón Inventario nuevamente para detenerse después de la posición actual, de lo contrario, deje en ejecución hasta que se hayan asignado todas las ranuras ocupadas. Etiquete todas las ranuras ocupadas con los detalles de la muestra en las cajas proporcionadas. Resalte la cuadrícula que se va a transferir a la columna del microscopio y haga clic en Cargar. La etiqueta de la ranura cambiará de azul a amarillo una vez que la cuadrícula se haya cargado correctamente en el escenario. Proceda a examinar las cuadrículas. Abra el software EPU. En la página Preparación , seleccione Óptica y configuración de adquisición y , a continuación, seleccione el ajuste preestablecido Atlas en el menú desplegable. Elija los ajustes preestablecidos de ajuste de haz apropiados (por ejemplo, mag nominal de 64x, tamaño de punto 5, microsonda, con un área iluminada en el rango paralelo para el detector Falcon; para obtener más información, elija los ajustes preestablecidos de ajuste de haz, consulte 28). Pulse Set para empujar los parámetros al microscopio. Presione Abrir válvulas de columna e inserte el FluScreen. Compruebe que un haz es visible y está lo suficientemente extendido y centrado para cubrir el detector. Si es necesario, navegue a una región más delgada de la cuadrícula usando el joystick o el menú del escenario para controlar los movimientos del escenario en X e Y. Levante el FluScreen y tome una imagen con el botón Vista previa de EPU. Según la imagen adquirida, la dosis se puede aumentar moviéndose a un tamaño de punto de número más bajo, y viceversa. En EPU, vaya a la página Atlas y presione Nueva sesión. Seleccione el formato de imagen MRC e introduzca un nombre de carpeta y una ubicación adecuados para guardar la sesión de selección y, a continuación, haga clic en Aplicar. Seleccione Proyección en el menú de la izquierda. Marque las casillas de verificación junto a cada cuadrícula para adquirir un montaje de atlas. Inicie la sesión de detección en EPU. Se adquirirá un atlas para cada cuadrícula verificada, con una serie de cuadrados de cuadrícula disponibles enumerados al finalizar. Cada atlas se puede ver resaltándolo en la página de selección, completo con un marcado que muestra cuadrados de cuadrícula con un espesor de hielo predicho similar agrupado por color. Al finalizar, revise los atlas recolectados e identifique las rejillas adecuadas para evaluar la calidad de la muestra a aumentos más altos (es decir, aquellas con un número apropiado de cuadrados de cuadrícula que no están secos ni oscurecidos por hielo grueso). Resalte la cuadrícula elegida en el menú de detección de EPU y haga clic en Cargar muestra. Utilice los ajustes preestablecidos de ajuste de haz (consulte 28 para obtener una explicación de los ajustes preestablecidos de haz deseados para cada etapa) y la función de vista previa para examinar los cuadrados de cuadrícula deseados con mayor detalle. En el menú de selección Atlas, seleccione la cuadrícula actualmente cargada y mueva el escenario a un cuadrado de cuadrícula que contenga agujeros rellenos haciendo clic con el botón derecho sobre la ubicación deseada en la imagen de cuadrícula y seleccionando mover al cuadrado de cuadrícula. Vuelva a EPU, página preparación y seleccione el ajuste preestablecido GridSquare . Abra la página EPU, Funciones automáticas y ejecute Auto-eucentric por inclinación de etapa con el ajuste preestablecido GridSquare para mover la muestra a la altura eucéntrica.NOTA: También está disponible la inclinación auto-eucéntrica por haz, que es más rápida pero típicamente menos precisa que la inclinación auto-eucéntrica por etapa. En EPU, Preparación, tome una nueva imagen de vista previa de GridSquare. Tenga en cuenta los diferentes valores de gris en diferentes orificios que indican diferentes espesores de hielo. Mueva el escenario sobre un agujero haciendo clic con el botón derecho > mover el escenario aquí. Seleccione el ajuste preestablecido Hole/Eucentric Height y Preview.NOTA: Dependiendo del peso molecular y la forma de la partícula de interés, puede ser posible identificarla en el aumento de la altura del agujero / eucéntrico. Seleccione el ajuste preestablecido de adquisición de datos y establezca un aumento que permita una fácil identificación de las partículas (correspondiente a un muestreo de objetos de generalmente <2 Å / píxel). Ajuste el desplazamiento de desenfoque a ~-3 a -5 μm con una dosis de electrones de exposición de ~40-80 e-/ Å2. Repita los pasos en 4.4 para evaluar un rango de espesores de hielo para la distribución, orientación y contaminación de partículas en toda la red. La distribución de partículas puede variar cerca de los bordes frente al centro del agujero y, por lo tanto, es importante inspeccionar diferentes ubicaciones con el agujero. Evalúe todas las cuadrículas que muestran la promesa de los atlas de tener suficientes cuadrados de cuadrícula. Manténgalos en el microscopio y proceda a la adquisición de datos utilizando EPU, o descargue las muestras del microscopio y guárdelas bajo LN2 hasta que se programe la recopilación de datos. 5. Recopilación de datos de crioEM de partícula única (con un enfoque en la operación remota) NOTA: Un protocolo detallado para la adquisición de datos con EPU se describe en el manual del fabricante y en otros lugares28. Aquí se destacan las modificaciones de este protocolo para la operación remota (es decir, la reducción del uso de los paneles de mano para realizar tareas y el uso de alternativas basadas en software). A menos que ya se haya recopilado uno durante la sesión, recoja un Atlas para la cuadrícula. Definir cada uno de los ajustes preestablecidos del haz según las necesidades experimentales del proyecto. Realice calibraciones de cambio de imagen28. Configure la sesión de EPU. En EPU, seleccione la página EPU y luego Configuración de sesión, seleccione Nueva sesión y luego Nuevo en las preferencias. Seleccione Nueva sesión aparecerá una ventana emergente que proporciona una opción para usar la configuración anterior. Sí , cargará automáticamente la configuración de la EPU anterior (es decir, portador de muestras, rango de desenfoque, configuración de enfoque automático, tipo de cuadrícula) en la sesión de EPU actual. Al seleccionar Nuevo de las preferencias, el usuario puede elegir un archivo con las preferencias guardadas (es decir, rango de desenfoque, configuración de enfoque automático, tipo de cuadrícula) y esta información se precargará en EPU. Rellene el nombre de la sesión con algo informativo. La instalación local puede sugerir una convención de nomenclatura. En Tipo, seleccione Manual. En el modo Adquisición, seleccione centrado preciso del orificio o adquisición más rápida. En Formato de imagen, seleccione el formato deseado. Seleccione una carpeta de almacenamiento adecuada y EPU creará un directorio con el nombre de la sesión. Seleccione el portador de muestra apropiado según el tipo de cuadrícula y el espaciado de orificio que se utilice (por ejemplo, Quantifoil 1.2 / 1.3) y presione Aplicar. Este protocolo describe el proceso para generar una plantilla para una matriz regular de taladros Seleccione un cuadrado de cuadrícula inicial y establezca una plantilla de adquisición.Vaya a la selección Cuadrado, si todos los cuadrados son verdes, haga clic en anular la selección de todo en la parte superior izquierda. Abrir iconos (haga clic con el botón derecho > abrir mosaico). Seleccione un cuadrado (haga clic con el botón derecho > agregar, haga clic con el botón derecho > Mover etapa al cuadrado de cuadrícula). Vaya a Selección de taladros y pulse Auto Eucentric. Espere hasta que esto se complete y se haya tomado una imagen de Grid Square. Si la función automática falla, esto puede deberse a que la altura está significativamente apagada; si es así, se puede ajustar manualmente utilizando la ampliación FluScreen at Grid Square. Medir el tamaño del agujero. Mueva y ajuste los círculos amarillos para que estén sobre los orificios con el tamaño y el espaciado correctos. Pulse Buscar taladros. Compruebe que los agujeros se han encontrado correctamente. Si no, cambie el tamaño del orificio y vuelva a encontrar agujeros. Repita esto hasta que encuentre el orificio correctamente. Si falla constantemente, considere pasar a un tamaño de punto de número más bajo (más brillante) con un aumento cuadrado de cuadrícula. Utilice el histograma de calidad de hielo del filtro a la derecha para ajustar la selección del orificio. Esto puede ser útil para excluir áreas con hielo grueso y hielo delgado. Esto se recordará para los futuros cuadrados de cuadrícula seleccionados durante esta sesión. Optimice la selección de taladros con las herramientas del menú Seleccionar en la parte superior. Por ejemplo, haga clic en Quitar taladros cerca de la barra de cuadrícula. Vaya a Definición de plantilla y pulse Adquirir. Pulse en Buscar (Find and centre hole). Ahora habrá una imagen de un agujero con un círculo amarillo alrededor del agujero.NOTA: Si tiene dificultades para encontrar el agujero, inserte la apertura del objetivo. Si aún no puede encontrar el agujero, intente aumentar el tiempo de exposición para el ajuste preestablecido de altura del orificio / eucéntrico o aumentar el desenfoque para este ajuste preestablecido o bin la imagen. Un cambio de desenfoque grande puede alterar la alineación del cambio de imagen. Cambie el retardo después del cambio de etapa y el retraso después de los tiempos de cambio de imagen a 1-5 s. Marque el valor máximo de desplazamiento de imagen (si la opción está disponible) es el deseado. Si se utiliza la colección de desplazamiento de imagen sin aberraciones, este valor se define en el archivo de configuración de EPU, de lo contrario 5 μm es un valor estándar. Haga clic en Agregar área de adquisición y, a continuación, haga clic en cualquier lugar de la imagen. Mueva el área de adquisición a la ubicación deseada (es decir, en el borde de un agujero) para que las áreas de adquisición no estén doblemente expuestas con el haz (el cuadrado en el círculo verde representa el área del detector, el círculo verde es el diámetro del haz). En la parte superior derecha, añade el rango de desenfoque. Luego agregue otras áreas de adquisición. Una lista típica de desenfoque para un proyecto de proteína de membrana es de -0,8 a -3 μm de desenfoque. Haga clic en Agregar área de enfoque automático y haga clic en cualquier lugar de la imagen. Mueva el área de enfoque automático al carbono que rodea un agujero. La práctica estándar es enfocar automáticamente después de centrar cuando se usa AFIS, o cada 5-15 μm, dependiendo de la variación de la altura z en todo el cuadrado. Haga clic en Agregar área de medición de deriva, la medición de deriva realizada una vez por cuadrado de cuadrícula, con un umbral establecido de 0.05 nm / s es una configuración estándar. El área de medición de deriva puede (y es una buena idea) superponerse directamente con el área de enfoque automático. Asegúrese de que ni la deriva ni el área de enfoque automático se superpongan con un área de adquisición.NOTA: La plantilla se puede comprobar mediante la función de ejecución de plantilla. Esta es una buena idea para ver si las áreas de adquisición necesitan moverse (por ejemplo, demasiado / no suficiente carbono en las imágenes), pero no es necesario. Vuelva a la selección de cuadrados y, en la cuadrícula, seleccione los cuadrados para la adquisición. Utilice el número de áreas de adquisición y la tasa de adquisición de datos esperada (de la instalación basada en detectores y la configuración experimental) para predecir cuántas áreas de adquisición se requieren. Cuando se seleccionen todos los cuadrados deseados, pulse Preparar todos los cuadrados. Una vez que se haya recogido cada cuadrado, navegue entre los cuadrados de la cuadrícula y ajuste los orificios con el pincel de selección. Muévase a una ubicación de escenario sobre la muestra y use funciones automáticas para establecer la altura eucéntrica. Realice alineaciones de microscopio como se describió anteriormente28, pero en lugar de realizar la alineación sin coma y corregir el astigmatismo objetivo manualmente, haga uso de herramientas de alineación dentro del software. Brevemente, establezca las condiciones del haz de adquisición, asegúrese de que se elimine la apertura del objetivo (OA) y que el escenario se coloque sobre un área estable del haz de la muestra a una altura eucéntrica. Realice una alineación libre de coma dentro de las funciones automáticas antes de reinsertar y centrar la OA y corregir el astigmatismo de la lente objetivo con EPU. Asegúrese de que ambas alineaciones convergen en valores adecuados (<150 nm de coma y astigmatismo cercano a cero. Antes de iniciar la ejecución de adquisición automatizada, asegúrese de que la bomba turbo del cargador automático esté apagada y que se inserte la apertura del objetivo. En Adquisición automatizada, presione Iniciar ejecución para comenzar la adquisición automatizada de datos. 6. Procesamiento de imágenes para obtener un mapa de densidad EM NOTA: La mayoría de las instalaciones de cryoEM ofrecen preprocesamiento de películas micrográficas ‘sobre la marcha’. Hay una amplia variedad de paquetes de software y enfoques disponibles para esto, incluyendo relion pipelines28,33, cryoSPARC43, Scipion34 y WarpEM44. Aquí se describe una canalización basada en RELION y se supone que el usuario ha movido las películas de micrografía a una ubicación de almacenamiento adecuada con acceso a los recursos informáticos. Se proporciona una descripción general del proceso y resultados representativos para un proyecto de proteína de membrana, una descripción detallada y un tutorial paso a paso en la página de inicio de RELION: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion. Realizar análisis ‘sobre la marcha’ de la corrección de movimiento de micrografía y estimación de CTF. Inicie RELION dentro del directorio del proyecto. Programe los trabajos de importación, corrección de movimiento y estimación CTF para que se repitan de modo que sean simultáneos con la recopilación y transferencia de datos. Un script de análisis micrográfico28 proporciona retroalimentación visual en tiempo real sobre el astigmatismo y los valores estimados de desenfoque (ver resultados representativos). Recoger partículas de micrografías preprocesadas. Hay una serie de paquetes de software de selección automatizada de partículas para elegir. Las opciones de selección sin referencia y basadas en plantillas están disponibles en la pestaña Selección automática de RELION37. Se pueden utilizar otros programas para varios pasos, por ejemplo, utilizando crYOLO para la selección de partículas35. Extraiga partículas de las micrografías corregidas por CTF.NOTA: Para reducir el tiempo computacional requerido para los primeros pasos de procesamiento, “limpieza”, reducción de escala / bin de las partículas después de la extracción. Los detalles sobre cómo ejecutar el trabajo de extracción se pueden encontrar en el tutorial de RELION 3.1. Para este proyecto, las partículas se unieron inicialmente por un factor de 2. Realizar promedios de clase 2D. La clasificación en 100-200 clases funciona bien para la mayoría de los conjuntos de datos que contienen ≥100.000 partículas. No se recomienda utilizar muchas más de 200 clases o menos de 50 clases, incluso cuando los conjuntos de datos son pequeños a menos que la muestra tenga una alta simetría (es decir, virus icosaédrico), en cuyo caso menos de 50 clases aún podrían dar un buen resultado. Ajuste el diámetro de la máscara lo suficientemente grande como para acomodar la dimensión más larga de la partícula, pero lo suficientemente apretado como para excluir cualquier partícula vecina (esto puede requerir algo de prueba y error). Seleccione buenas clases (es decir, aquellas con detalles estructurales) utilizando el trabajo de selección de subconjuntos. Ejemplos de promedios de clase 2D buenos y malos se pueden encontrar en la sección de resultados representativos. Genere un modelo inicial de novo a partir de los datos utilizando el trabajo de modelo inicial 3D en RELION.NOTA: Las pilas de partículas menos limpias pueden beneficiarse del refinamiento de SGD (descenso de gradiente estocástico) ab initio de múltiples referencias, ya que esto brinda una oportunidad adicional para filtrar partículas basura / subóptimas. Seleccione un diámetro de máscara que pueda acomodar la partícula de interés y deje los valores predeterminados para los campos en la pestaña ‘SGD’, ya que estos rutinariamente funcionan bien. Asegúrese de que el modelo inicial se vea razonable en Chimera (u otro programa de visualización apropiado) (ver resultados representativos). Realice la clasificación 3D para abordar la heterogeneidad en los datos utilizando la salida del paso 6.6 como modelo de referencia. Evalúa los mapas resultantes en Chimera. Procese pilas de partículas correspondientes a estados conformacionales únicos de forma independiente. Utilice el trabajo de selección de subconjuntos para seleccionar una clase o clases de interés y generar archivos particles.star para las pilas de partículas asociadas. Ejecute el refinamiento automático 3D. Utilice los promedios de clase 3D obtenidos en el paso anterior como referencias para el refinamiento de sus pilas de partículas correspondientes. Si la resolución del refinamiento se acerca al límite de Nyquist de los datos, vuelva a extraer las partículas sin reducir la escala. Después de volver a extraer, repita el trabajo de refinamiento automático 3D con la pila de partículas no enlazadas. En este caso, los modelos de referencia 3D deben reescalarse de tal manera que los tamaños de píxel y caja sean consistentes con los de las imágenes de partículas reextraídas. Utilice la herramienta de línea de comandos relion_image_handler para llevar a cabo esta operación. Utilice la simetría en el refinamiento si es apropiado. Si un mapa reconstruido posee simetría, alinee el mapa en el eje de simetría apropiado mediante la herramienta de línea de comandos relion_align_symmetry. Utilice el mapa alineado resultante como referencia en un nuevo trabajo de refinamiento automático 3D con el operador de simetría apropiado especificado en la ficha referencia. Agudiza mapas desde el refinamiento automático 3D. Esto se hace utilizando el trabajo de post-procesamiento en RELION, pero primero se debe crear una máscara adecuada a partir del mapa refinado. Los pasos de creación y post-procesamiento de máscaras se detallan en el tutorial de RELION (ver también resultados representativos).NOTA: La resolución de muchas reconstrucciones se puede mejorar aún más utilizando las funcionalidades de pulido bayesiano y refinamiento CTF en RELION. Utilice el tipo de trabajo de refinamiento CTF para estimar y corregir aberraciones de orden superior (inclinación del haz, aberraciones del trébol y aberraciones de 4º orden) y, como trabajos separados, aumento anisotrópico y desenfoque por partícula. Después de esto, use el trabajo de pulido bayesiano (entrenado o con valores predeterminados) para abordar el movimiento inducido por el haz por partícula. Como se aborda en el tutorial de RELION 3.1, estos trabajos probablemente se beneficiarán de un enfoque iterativo (refinamiento CTF → pulido bayesiano → auto-refinamiento 3D → post-procesamiento → … loop) ya que ambos se benefician de modelos de mayor resolución. Corrija la manejabilidad de los mapas de densidad EM si es necesario. Examine los mapas para determinar si la mano es correcta, ya sea intentando ajustarse a un modelo atómico existente o evaluando la mano de las regiones helicoidales alfa. Cuando sea necesario, voltee el mapa a lo largo del eje z en UCSF Chimera45 usando el comando ‘vop zflip’.

Representative Results

Durante la detección, las cuadrículas se pueden descartar en la etapa del atlas, donde las características resueltas a bajo aumento marcan que la cuadrícula no es adecuada para la adquisición de datos. Por ejemplo, si una rejilla ha sido objeto de daños mecánicos significativos con la mayoría de los cuadrados de rejilla rotos (Figura 2A), o donde la rejilla parece estar “seca”, sin hielo vítreo (Figura 2B). Tales cuadrículas son típicamente identificables ya que los bordes de los cuadrados de la cuadrícula parecen nítidos y distintos. En la mayoría de las rejillas hechas con el dispositivo de congelación por inmersión, se observa un gradiente de hielo (Figura 2C, D). La distribución de partículas, dependiendo de la muestra de interés, puede variar dramáticamente con el espesor del hielo, por lo que se recomienda examinar una gama de cuadrados de cuadrícula para evaluar la distribución de partículas. Se han implementado herramientas dentro del software EPU durante el paso de selección del atlas para ayudar al usuario a identificar cuadrados de cuadrícula de espesor de hielo similar o diferente, lo que puede ser particularmente útil para los usuarios que son nuevos en el examen de cuadrículas crioEM (Figura 2E, F). Figura 2: Ejemplos de montajes de ‘atlas’ de bajo aumento de las sesiones de proyección. A) Una cuadrícula que ha sufrido daños significativos con la mayoría de los cuadrados de la cuadrícula rotos, inadecuados para la recolección. B) Una rejilla seca sin hielo vítreo – inadecuada para la recolección. C) Una rejilla que demuestre un gradiente de hielo con ~ 50% de la rejilla utilizable. D) Un gradiente de hielo con ~ 33% de la rejilla utilizable. Tanto C como D, son adecuados para la recopilación de datos si los cuadrados de cuadrícula utilizables tienen un espesor de hielo apropiado para la recolección, y hay suficientes áreas de adquisición para satisfacer la duración mínima de una recolección (por ejemplo, 24 h) E) Un atlas de ejemplo con rango de espesores de hielo. F) El mismo atlas presentado en E pero con, cuadrados de cuadrícula categorizados y coloreados por el software EPU según el espesor del hielo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Al examinar la distribución de partículas, asegúrese de que los parámetros de imagen, como la ampliación y la dosis total de electrones, sean similares a los que se espera que se utilicen durante la adquisición de datos para proporcionar una imagen precisa de los resultados esperados. Durante el cribado, una distribución ideal de partículas es monodispersa con un rango de orientaciones de partículas visibles (dependiendo de la muestra y el conocimiento existente de la morfología de la partícula, esto puede ser difícil de determinar) (Figura 3A). El hielo debe ser lo más delgado posible mientras acomoda las partículas de mayor dimensión, si el hielo es demasiado delgado puede derretirse cuando se ilumina con el haz de electrones. Esto causa un movimiento excesivo en la micrografía, y se deben evitar las áreas que muestran esta característica (Figura 3B). Por experiencia colectiva, este efecto se observa con mayor frecuencia cuando hay detergente en el tampón. Esto puede resultar en hielo muy delgado en el centro del agujero y, por lo tanto, las partículas pueden ser físicamente excluidas y forzadas hacia el borde. Este efecto se observa en la Figura 3C, pero en este caso no es un ejemplo extremo y estas imágenes aún contribuirían de manera útil a un conjunto de datos. Finalmente, el hielo debe ser vítreo; excluir cualquier área de la cuadrícula (o cuadrículas) donde la mayoría o todas las imágenes tomadas muestren hielo cristalino (Figura 3D) de la adquisición de datos. A menudo, se observa hielo no vítreo en el borde de los cuadrados de la cuadrícula. Se remite a los lectores a revisiones detalladas de las variables que pueden alterarse durante la vitrificación de la rejilla16 y descripciones del comportamiento de las partículas en el entorno de película delgada46,47 para obtener más información. Figura 3: Micrografías representativas que muestran diferentes distribuciones de partículas. A) Una distribución “ideal” de partículas monodispersas que adoptan un rango de orientaciones. B) Hielo demasiado delgado en el medio del agujero que se deforma al exponerse al haz de electrones causando un movimiento excesivo en la micrografía. Este efecto se observa con mayor frecuencia cuando el detergente está presente en el tampón C) Donde el hielo es más delgado en el centro del agujero, esto excluye físicamente las partículas del centro, causando el apiñamiento de partículas hacia el borde del agujero. En este caso, no es lo suficientemente extremo como para evitar que estas imágenes sean útiles, pero sugiere que vale la pena examinar áreas ligeramente más gruesas. D) El hielo no es vítreo, no se deben recopilar datos sobre áreas que se parecen a esta micrografía de ejemplo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El procesamiento de imágenes sobre la marcha puede ayudar a detectar errores y problemas con la adquisición de datos y, por lo tanto, siempre se recomienda siempre que sea posible. Por ejemplo, el movimiento excesivo dentro de las micrografías puede indicar que la turbobomba del cargador automático está activa, o que se están recopilando datos en un cuadrado de cuadrícula agrietado donde el hielo se mueve significativamente en el haz de electrones, lo que indica que se debe omitir el cuadrado de la rejilla. Sobre la marcha, la estimación de CTF puede revelar circunstancias en las que se aplica un punto de enfoque positivo (en lugar de desenfoque) (donde se utilizan programas y parámetros de estimación de CTF para encontrar estos puntos), y determinar el cambio de fase donde se utiliza una placa de fase Volta48. Las canalizaciones de procesamiento de imágenes sobre la marcha a menudo incluyen un resumen gráfico de los datos (Figura 4A) para facilitar a los usuarios evaluar rápidamente la calidad de la micrografía y decidir si se requieren modificaciones en la recopilación de datos. La selección de partículas a partir de micrografías, evitando al mismo tiempo “falsos positivos” como la contaminación o la película de soporte de la rejilla, puede requerir optimización. Sin embargo, los recolectores de partículas como crYOLO a menudo funcionan lo suficientemente bien utilizando parámetros predeterminados para una “primera pasada” de los datos (Figura 4B), lo que permite la progresión a un promedio de clase 2D donde puede ser más fácil evaluar la calidad de los datos y la probabilidad de éxito posterior. Para la mayoría de los proyectos, la clasificación 2D de ~ > partículas de 10k debería comenzar a revelar clases que tienen detalles de estructura secundaria. Para pasar a 3D, la etapa de clasificación 2D generalmente debe revelar clases que representan un rango de orientaciones de partículas. Si se revela una orientación preferida, pueden requerirse más iteraciones de preparación de la muestra16 o una mayor adquisición de datos con la muestra inclinada49. Todas las clases que muestran detalles de estructura secundaria deben elegirse para pasar al análisis 3D, mientras que las partículas “basura” se descartan (Figura 4C). Figura 4: Pasos iniciales de procesamiento de imágenes. A) Salida de un script de procesamiento de imágenes ‘sobre la marcha’. B) Ejemplo de micrografía (izquierda) con partículas auto-seleccionadas adecuadamente identificadas utilizando el modelo general crYOLO (derecha, con partículas delimitadas por cuadrados rojos) Las barras de escala (blancas) son de 50 nm. C) Resultados de la clasificación 2D que muestran las clases que se descartaron en el cuadrado rojo y las clases de las que se seleccionaron las partículas para su posterior procesamiento en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se puede utilizar un pequeño subconjunto de partículas para generar un modelo inicial (Figura 5A). Este modelo inicial se puede utilizar como modelo inicial en la clasificación y refinamiento 3D. En el caso de RagAB, el conjunto de datos contenía tres conformadores distintos que se pueden separar durante la clasificación 3D (Figura 5B). Las partículas que contribuyen a cada una de estas clases pueden tratarse de forma independiente y utilizarse para refinar un mapa de densidad EM que luego puede estar sujeto a una mayor interpretación y construcción de modelos. Figura 5: Generación de mapa de densidad EM 3D. A) Modelo inicial típico generado mediante RELION. B) Clasificación 3D en 5 clases que muestran la separación de partículas en tres estados conformacionales distintos: abierto-abierto (verde), abierto-cerrado (azul), cerrado-cerrado (púrpura). C) Proceso de creación de máscaras. El mapa del refinamiento 3D (izquierda) debe visualizarse en quimera. El visor de volumen se puede utilizar para identificar el umbral más bajo en el que el mapa está libre de densidad inconexa y ruidosa (medio). Este valor de umbral se introduce como umbral de binarización inicial en el trabajo de creación de máscaras RELION. Una salida de máscara de ejemplo se muestra en gris (derecha). D) Mapa de densidad EM de alta resolución del estado abierto-cerrado de RagAB (EMD-10245), filtrado y coloreado por resolución local (Å). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este protocolo hemos descrito una tubería básica aplicable a especímenes susceptibles de SPA de rutina. Si bien este método de borrado de papel de filtro de formación de película delgada y vitrificación es indudablemente exitoso dado su uso en la gran mayoría de los proyectos de SPA hasta la fecha, viene con una serie de desventajas. Estos incluyen el desperdicio de muestras, las escalas de tiempo lentas (segundos) requeridas para formar la película delgada y congelar la muestra, la irreproducibilidad ^reportada27 y los efectos negativos reportados del uso de papel de filtro para eliminar el exceso de ^líquido50. Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías para mejorar la reproducibilidad de la producción de película ^delgada51,52. Se han desarrollado otras tecnologías que reducen el tiempo entre la aplicación de la muestra y la vitrificación53,54,55. Si bien los métodos basados en papel de filtro para la formación de película delgada siguen siendo el método más ubicuo de preparación de muestras de crioEM SPA en el momento de escribir este artículo, estas nuevas tecnologías pueden aportar una serie de beneficios en términos de eficiencia y reproducibilidad de la vitrificación en rejilla, así como crear nuevas oportunidades para incorporar dimensiones experimentales adicionales, como la resolución del tiempo y la mezcla rápida antes de la vitrificación.

El proceso de selección de la cuadrícula para la mayoría de los usuarios es actualmente un proceso cualitativo que implica la adquisición de atlas de baja ampliación seguidos de la toma de imágenes de gran aumento a través de la cuadrícula para evaluar la distribución de partículas. Si bien este es un enfoque suficientemente robusto para algunos tipos de especímenes, puede ser difícil evaluar a simple vista si el espécimen es realmente lo que el investigador espera obtener o tiene una orientación preferida, por ejemplo, con muestras pequeñas (<200 kDa) o cuando la morfología de baja resolución hace que sea difícil identificar a simple vista si hay un rango de distribuciones de partículas. Para algunos proyectos, es imposible determinar si la muestra es la deseada, por ejemplo, cuando se une un ligando o donde se está examinando la muestra para evaluar si una subunidad pequeña (por ejemplo, 10 kDa) todavía está presente en asociación con un complejo. Para estos proyectos, las canalizaciones totalmente automatizadas para el análisis de datos combinadas con colecciones "cortas" de 0,5 a 1 h, que pueden pasar por los pasos de procesamiento de imágenes hasta la clasificación 2D o incluso la clasificación y el refinamiento 3D ayudarían a determinar de manera eficiente si se justifica una recopilación más larga. Estas tuberías aún están en desarrollo y no se implementan ampliamente en la actualidad, pero tienen el potencial de mejorar la eficiencia de la detección de la red crioEM, especialmente para especímenes desafiantes.

Las mejoras en los detectores de electrones directos, así como las modificaciones en la microscopía combinadas con los avances en el procesamiento de imágenes, como la recopilación de datos de desplazamiento de imagen, han aumentado el rendimiento y la calidad de las imágenes producidas durante la adquisición de datos. Este aumento en la tasa de datos que se recopilan destaca la necesidad de una detección exhaustiva de las redes crioEM antes de que se adquieran muchos datos de TB.

CryoEM SPA se ha convertido en una técnica de biología estructural verdaderamente convencional y, en muchos casos, en el enfoque de “ir a” para algunas clases de especímenes, como los complejos macromoleculares heterogéneos y lábiles. Si bien el protocolo aquí describe una visión general básica de la tubería de SPA, cada sección cubierta aquí (vitrificación y detección de cuadrícula, crioEM y procesamiento de imágenes) es un tema por derecho propio y digno de exploración durante el desarrollo de un proyecto de SPA. A medida que las tecnologías de preparación de muestras y microscopía progresan, y los nuevos algoritmos y enfoques de procesamiento de imágenes se ponen en línea, SPA continuará desarrollándose como una tubería, ayudando a los investigadores a obtener información sobre sistemas biológicos complejos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea. J B. R. White está financiado por el Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Los microscopios FEI Titan Krios fueron financiados por la Universidad de Leeds (premio UoL ABSL) y Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Agradecemos a M Iadanza por el uso de su guión de análisis de micrografías. Reconocemos a Diamond Light Source por el acceso y el apoyo a las instalaciones de crio-EM en el Centro Nacional de Bioimagen electrónica (eBIC) del Reino Unido financiado por Wellcome Trust, MRC y BBRSC.

Materials

Blunt tweezers	Agar Scientific	AGT5022
Cryo EM round storage box	Agar Scientific	AGG3736
CryoEM autogrid boxes	ThermoFisher Scientific	1084591
CryoEM grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Ethane gas	Boc	270595-F
LN2 foam dewar	Agar Scientific	AG81760-500
LN2 storage dewar	Worthington industries	HC 34
Pipette	Gilson	10082012
Pipette tips	Star labs	s1111-1706
Syringe	BD	BD 300869
Type II lab water	Suez	select fusion
Vitrobot	ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot filter paper	Whatman	1001-055
Vitrobot styrophome container assembly	ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot tweesers	ThermoFisher Scientific	72882-D
Software
EPU	ThermoFisher Scientific	2.8.1.10REL
TEM server	ThermoFisher Scientific	6.15.3.22415REL
Tia	ThermoFisher Scientific	5.0.0.2896REL
Titan krios microscope	ThermoFisher Scientific	Titan Krios G2

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White, J. B., Maskell, D. P., Howe, A., Harrow, M., Clare, D. K., Siebert, C. A., Hesketh, E. L., Thompson, R. F. Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure. J. Vis. Exp. (171), e62415, doi:10.3791/62415 (2021).

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