מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה
Summary
קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.
Abstract
מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryoEM) היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים, באמצעות ניתוח חלקיקים יחיד (SPA). התהליך הכולל כרוך i) vitrifying הדגימה בסרט דק נתמך על רשת cryoEM; ii) סינון הדגימה להערכת התפלגות החלקיקים ואיכות הקרח; iii) אם הרשת מתאימה, איסוף ערכת נתונים חלקיקית אחת לניתוח; ו-iv) עיבוד תמונה כדי להניב מפת צפיפות EM. בפרוטוקול זה, מסופקת מבט כולל עבור כל אחד מהצעדים הללו, תוך התמקדות במשתנים שהמשתמש יכול לשנות במהלך זרימת העבודה ובפתרון בעיות נפוצות. עם פעולת מיקרוסקופ מרחוק הופכת לסטנדרט במתקנים רבים, יתואר וריאציות על פרוטוקולי הדמיה כדי לסייע למשתמשים בתפעול והדמיה יעילים כאשר הגישה הפיזית למיקרוסקופ מוגבלת.
Introduction
קריום חלקיק יחיד
כדי לחקור את החיים ברמה המולקולרית עלינו להבין את המבנה. טכניקות רבות לבדיקת מבנה החלבון זמינות, כגון NMR, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרומטריית מסה ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). עד כה, רוב המבנים שהופקדו במאגר נתוני החלבון (PDB) נפתרו באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, משנת 2012 ואילך, מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryoEM) הפכה לטכניקה מיינסטרים לקביעת מבנה החלבון והשימוש בה גדל באופן דרמטי. המספר הכולל של מפות EM שהופקדו במאגר הנתונים אלקטרון מיקרוסקופיה (EMDB) (נכון לדצמבר 2020) היה 13,421 לעומת 1,566 בשנת 2012 (איור 1, www.ebi.co.uk). בשנת 2012 מספר הקואורדינטות האטומיות שעוצבו במפות צפיפות cryoEM, שהופקדו ל- PDB היה רק 67 אך נכון לדצמבר 2020 הופקדו עד כה 2,309 מבנים, גידול של פי 35. צמיחה זו באיכות ובכמות מפות צפיפות cryoEM המיוצרות, המכונות לעתים “מהפכת הרזולוציה”1, נגרמה על ידי התמזגות של התקדמות בתחומים מרובים: פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות גלאי אלקטרונים ישירים; תוכנה חדשה; ומיקרוסקופים יציבים יותר2,3,4.
איור 1: הגשות מצטברות ל- EMDB מ- 2012 עד דצמבר 2020. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
ניתוח חלקיקים יחיד (SPA) הוא כלי רב עוצמה ליצירת תובנה ביולוגית במגוון רחב של סוגי מדגמים על ידי ביסוס מבנים ברזולוציה גבוהה של מתחמים מבודדים5,6 כולל וירוסים7,8, חלבונים ממברנה9,10, מכלולים סלילים11 ומתחמים מאקרומולקולריים דינמיים והטרוגניים אחרים12,13, שגודלם משתנה לפי סדרי גודל (מ- 39 kDa 14,15 עד עשרות מגדונים). כאן, פרוטוקול עבור צינור סטנדרטי עבור spa cryoEM מדגם למבנה מתואר.
לפני ההחלמה על צינור זה, מדגם מטוהר צריך להיות נתון לניתוח ביוכימי כדי להעריך את סיכוייה להצלחה במורד הזרם. הכנת מדגם מתאים היא ללא ספק המחסום הגדול ביותר לספא, במיוחד עבור מתחמים ארעיים והטרוגניים (קומפוזיציה וקונפורמיים כאחד). ההכנה המורכבת המקרומולקולרית צריכה להכיל כמה שפחות מזהמים, בריכוז מספיק כדי להניב חלקיקים רבים בכל מיקרוגרף cryoEM, ובהרכב חיץ מתאים היטב לניתוח cryoEM. מרכיבי חיץ מסוימים, כולל סוכרוז, גליצול וגבוה (~ > 350 mM ריכוזים של מלחים, בהתאם לגודל המדגם, תכונות ומרכיבי חוצץ אחרים) יכול להפריע לתהליך של vitrification או להפחית את יחס אות לרעש בתמונות, לעכב את קביעת המבנה16.
בדרך כלל, ככרומטוגרפיה מינימלית של אי-הכללת גודל (SEC) וניתוח ג’ל SDS- PAGE יש להשתמש כדי להעריך טוהר מדגם17,18, אך דיכרויזם מעגלי, בדיקות תפקודיות, SEC בשילוב עם פיזור אור רב-זוויתי, ובוחות יציבות תרמית הם כלים שימושיים לניתוח איכותי של הכנות מורכבות מקרומולקולריות לפני ניתוח cryoEM. עם זאת, התוצאות של ניתוחים ביוכימיים אלה עשויות להניב תובנה מועטה על ההטרוגניות המבנית של המדגם והתנהגותה ברשת cryoEM. מסיבה זו, כתם שלילי EM משמש באופן שגרתי ככלי מהיר, זול ורב עוצמה להערכת הטרוגניות קומפוזיציה וקונפורמציה, ולכן דרך טובה לברר איזה שבר חמקן מטיהור הוא המבטיח ביותר, או הקרנת קומפוזיציות חיץ שונות19,20. ברגע שזוהתה דגימה מבטיחה, נוכל להמשיך לצינור ההקפאה של הספא. כתם שלילי לא תמיד ליישר עם התוצאות הבאות לראות cryoEM; לפעמים מדגם נראה עני על ידי כתם שלילי אבל משתפר כאשר נראה בקרח הזגוגות cryoEM. לעומת זאת, לפעמים דגימות נראות מצוינות במהלך שלבי כתם שליליים אך דורשות מיטוב משמעותי נוסף כאשר מתקדמים ל- cryoEM. עם זאת, ברוב המקרים כתם שלילי מספק שלב בקרת איכות שימושי.
ויטריפיקציה
הסביבה הקשה בתוך מערכת הוואקום של מיקרוסקופ האלקטרונים גורמת הן להתייבשות והן לנזק לקרינה לדגימות ביולוגיות שלא פתורות21. לכן, כדי לדמיין את המדגם במצב דמוי יליד, הדגימה הביולוגית חייבת להישמר לפני ההדמיה. עבור הכנות מטוהרות של מתחמים מקרומולקולריים, vitrification היא שיטת הבחירה כדי לאפשר הדמיה שלה על ידי cryoEM תוך שמירה על הפרטים האטומיים של המתחם. גילוי ה-vitrification כשיטה להכנת מדגם היה התקדמות בסיסית במיקרוסקופיה אלקטרונית של דגימות ביולוגיות, אשר דובוצ’ה הוכר בפרס נובל לכימיה לשנת 2017. vitrification לדוגמה כרוך ביצירת שכבה דקה של פתרון המכיל את הדגימה של עניין, בדרך כלל עשרות ננומטר עובי, מושעה על תמיכה ברשת cryoEM. הסרט הדק קפוא במהירות רבה בקריוגן כגון אתאן נוזלי ב ~ -175 °C (70 °F). קצב ההקפאה הוא ~ 106 °C/s, מהיר מספיק כדי אמורפי, או קרח זוועתי צורות, השעיית הדגימה בסרט דק, מוצק22.
המשתנה ההתחלתי שיש לקחת בחשבון הוא התמיכה ברשת cryoEM שנבחרה23. רשת EM מורכבת בדרך כלל מסרט פחמן אמורפי עם ניקובים (רגילים או לא סדירים), על מבנה תמיכה. מבנה התמיכה הוא בדרך כלל רשת מתכת עגולה בקוטר 3.05 מ”מ, בדרך כלל עשוי נחושת, אבל מתכות אחרות כגון זהב, או מוליבדן (אשר העדיף תכונות התפשטות תרמית24) ניתן להשתמש. לעיתים, תמיכה דקה ורציפה נוספת מוחלת על פני הרשת, כגון גרפן, תחמוצת גרפן או שכבת פחמן אמורפית דקה (~1-2 ננומטר). בעוד רשתות cryoEM סטנדרטיות (הנפוצות ביותר 400-200 נחושת רשת עם מחורר (1.2 מיקרומטר חורים עגולים מופרדים על ידי 1.3 מיקרומטר (r1.2/1.3), או 2 מיקרומטר מופרד על ידי 2 מיקרומטר של פחמן (r2/2)) תמיכה בפחמן – למרות דפוסים רבים ושונים זמינים) שימשו ברוב המכריע של מבנים שדווחו עד כה, טכנולוגיות רשת חדשניות עם מוליכות משופרת ותנועה מופחתת דגימה דווחו25 . רשתות נבחרות כפופות לטיפול ניקוי זוהר-פריקה/פלזמה כדי להפוך אותם הידרופיליים ומקובל לדגום application26.
לאחר פריקת זוהר, השלב הבא הוא היווצרות סרט דק. סרט דק זה נוצר בדרך כלל באמצעות נייר סינון כדי להסיר נוזל עודף מהרשת. בעוד זה יכול להתבצע באופן ידני, מספר מכשירי הקפאת צלילה זמינים מסחרית, כולל Vitrobot Mk IV (תרמו פישר מדעי), EM GP II (לייקה) ו CP3 (גטן). עם התקנים אלה, ~ 3-5 μL של מדגם בפתרון מוחל על רשת EM, ואחריו סופג את פתרון עודף באמצעות נייר מסנן. הרשת, עם סרט דק תלוי על פני זה, הוא צלל לתוך אתאן נוזלי מקורר על ידי חנקן נוזלי (LN2) כדי ~ -175 °C (70 °F). לאחר הקפאת, הרשת נשמרת בטמפרטורה מתחת לנקודת הפיחות (-137 °C)-C לפני, ובמהלך ההדמיה.
סינון דגימה ואיסוף נתונים
לאחר vitrification של רשת cryoEM, השלב הבא הוא לסנן את הרשת כדי להעריך את איכותה ולקבוע אם הרשת מתאימה להמשיך לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה. רשת cryoEM אידיאלית כוללת קרח זגוכי (בניגוד לקרח גבישי) עם עובי הקרח מספיק כדי להכיל את הממד הארוך ביותר של הדגימה, מה שמבטיח שהקרח שמסביב תורם כמה שפחות רעש לתמונה המתקבלת. החלקיקים בתוך הקרח צריכים להיות בגודל (אם ידוע) צורה עולה בקנה אחד עם ביוכימיה, באופן אידיאלי להיות monodisperse עם התפלגות אקראית של כיווני חלקיקים. לבסוף, הרשת צריכה להיות מספיק אזורים באיכות מספקת כדי לספק את אורך איסוף הנתונים הרצוי. בהתאם לדגימה, זה עשוי לקחת איטרציות רבות של vitrification והקרנה עד רשתות אופטימליות מיוצרים. למרבה המזל ולמרבה הצער, יש מגוון עצום של משתנים שניתן לבדוק אמפירית כדי לשנות את התפלגות החלקיקים ברשתות cryoEM (נבדק ב-16,27). בכתב יד זה, תוצאות מייצגות עבור פרויקט חלבון ממברנה10 מוצגים.
לאחר זיהוי רשת מתאימה, איסוף הנתונים יכול להמשיך. מספר מודלים של מיקרוסקופ אלקטרונים בהעברת קריו עבור דגימות ביולוגיות מותאמים לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה באופן אוטומטי. בדרך כלל, נתונים נאספים במערכות 300 kV או 200 kV. איסוף נתונים אוטומטי ניתן להשיג באמצעות תוכנה כולל EPU (תרמו פישר מדעי)28, Leginon29, JADAS30 ו SerialEM31,32. איסוף נתונים אוטומטי עם גלאים מודרניים בדרך כלל גורם לטרה-בתים (TB) של נתונים גולמיים בפרק זמן של 24 שעות (ערכות נתונים ממוצעות הן ~ 4 TB בגודל).
בשל מגבלות COVID-19 במקום על רוב העולם (זמן כתיבת דצמבר 2020), מתקני מיקרוסקופיה רבים עברו להציע גישה מרחוק. לאחר שהרשתות נטענו לתוך המטען האוטומטי של מיקרוסקופ, ניתן לבצע רכישת נתונים מרחוק.
עיבוד תמונה ובניית מודל
כאשר הפעלת איסוף נתונים עשויה להיות בדרך כלל 0.5-4 ימים, עיבוד תמונה עוקב עשוי להימשך שבועות וחודשים רבים, בהתאם לזמינות משאבי המחשוב. זה סטנדרטי עבור שלבים ראשוניים עיבוד תמונה, כלומר תיקון תנועה והערכת פונקציית העברת ניגודיות (CTF) להתקיים ‘תוך כדי תנועה’ 33,34. עבור עיבוד במורד הזרם, יש שפע של חבילות תוכנה זמינות. חלקיקים ‘נקטפים’ ומופקים ממיקרוגרפים35,36. לאחר חילוץ החלקיקים, פרוטוקול סטנדרטי יהיה לעבד את החלקיקים באמצעות מספר סבבי סיווג (בשני הממדים (2D) ושלושה ממדים (3D) ו / או התמקד באזורים ספציפיים של עניין) כדי להגיע תת קבוצה הומוגנית של חלקיקים. תת-קבוצה הומוגנית זו של חלקיקים היא אז ממוצע יחד כדי לייצר שחזור 3D. בשלב זה נתונים מתוקנים לעתים קרובות עוד יותר כדי לייצר את המפה באיכות הגבוהה ביותר האפשרית, למשל באמצעות עידון CTF, תיקוני עיוות37 ו ליטוש בייסיאן38 . התוצאה של עיבוד תמונה זה היא מפת cryoEM תלת-ממדית של הדגימה הביולוגית של עניין. טווח הרזולוציה אליו הגיע בניסוי חלקיקים יחידים אוטומטי ‘סטנדרטי’ מרשת באיכות מספקת, כאשר הנתונים הנאספים במערכת מיקרוסקופ של 300 קילוואט הוא בדרך כלל בין 10 Å ל- 2 Å בהתאם לגודל ולגמישות של קומפלקס החלבון. עם דגימה אידיאלית, רזולוציות של ~ 1.2 Å הגיעו כעת באמצעות זרימות עבודה של SPA5. בעוד פרוטוקול זה מפרט צעדים לקראת קבלת מפת צפיפות EM, ברגע זה ביד זה יכול להתפרש עוד יותר באמצעות התאמה ועידון מודל חלבון (אם הרזולוציה היא < 3.5 Å) או בניית דה novo39. נתונים הקשורים לניסויי קביעת מבנים יכולים להיות מופקדים במאגרים ציבוריים מקוונים, כולל מפות צפיפות EM (אלקטרון מיקרוסקופיה Data Bank)40, וכתוצאה מכך קואורדינטות אטומיות (Protein Data Bank)41 וערכת נתונים גולמית (ארכיון התמונות הציבוריות של אלקטרון מיקרוסקופיה)42.
בפרוטוקול זה, קומפלקס חלבון הממברנה החיצונית RagAB (~ 340 kDa) מ Porphyromonas gingivalis משמש קומפלקס מקרומולקולרי דוגמה10 (EMPIAR-10543). עבור אלה חדשים cryoEM, תמיכה עבור דגימות דרך צינור זה מדגם למבנה זמין, בכפוף לביקורת עמיתים, באמצעות תוכניות גישה ממומנות כגון גילוי iNEXT והוראה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה תיארנו צינור בסיסי החל על דגימות המקובלות על ספא שגרתי. בעוד ששיטת כתמי נייר מסנן זו של היווצרות סרט דק ו- vitrification היא ללא ספק מוצלחת בהתחשב בשימוש ברוב המכריע של פרויקטי ספא עד כה, היא מגיעה עם מספר חסרונות. אלה כוללים בזבוז מדגם, צירי הזמן האיטיים (שניות) הנדרשים כדי ליצור את הסרט הדק ולהקפיא את הדגימה, דיווח על חוסר תפוקה27 ודיווח על השפעות שליליות של שימוש בנייר מסנן כדי למחוק עודף נוזל50. לאחרונה פותחו טכנולוגיות חדשות לשיפור יכולת הרבייה של הפקת סרטים דקים51,52. טכנולוגיות אחרות פותחו אשר לקצר את הזמן בין יישום מדגם ו vitrification53,54,55. בעוד ששיטות מבוססות נייר סינון להיווצרות סרט דק נשארות השיטה הנפוצה ביותר להכנת מדגם SPA CryoEM בזמן הכתיבה, טכנולוגיות חדשות אלה עשויות להביא מגוון יתרונות מבחינת יעילות ושחזור של vitrification רשת, כמו גם יצירת הזדמנויות חדשות להביא ממדים ניסיוניים נוספים, כגון רזולוציית זמן וערבוב מהיר לפני vitrification.
תהליך סינון הרשת עבור רוב המשתמשים הוא כיום תהליך איכותי הכולל רכישת אטלסים הגדלה נמוכה ואחריו צילום תמונות הגדלה גבוהה על פני הרשת כדי להעריך את התפלגות החלקיקים. אמנם זוהי גישה חזקה מספיק עבור סוגים מסוימים של דגימה, זה יכול להיות קשה להעריך על ידי העין אם הדגימה היא אכן מה החוקר מקווה לדמיין או יש אוריינטציה מועדפת, למשל עם דגימות קטנות (<200 kDa) או שבו מורפולוגיה ברזולוציה נמוכה מקשה לזהות על ידי העין אם מגוון של התפלגות חלקיקים קיימים. עבור פרויקטים מסוימים, לא ניתן לקבוע אם הדגימה היא כרצונה, לדוגמה, כאשר ליגנד מאוגד או היכן המדגם נבדק כדי להעריך אם ארון משנה קטן (לדוגמה, 10 kDa) עדיין קיים בשיתוף עם קומפלקס. עבור פרוייקטים אלה, צינורות אוטומטיים לחלוטין לניתוח נתונים בשילוב עם אוספים 'קצרים' של 0.5 – 1 שעות, שיכולים להמשיך בשלבי עיבוד תמונה לסיווג 2D או אפילו סיווג ושיפור תלת-ממדי יסייעו לקבוע ביעילות אם יש צורך באיסוף ארוך יותר. צינורות אלה עדיין נמצאים בפיתוח ואינם מיושמים באופן נרחב כיום, אך יש להם פוטנציאל לשפר את היעילות של הקרנת רשת CryoEM, במיוחד עבור דגימות מאתגרות.
שיפורים בגלאי אלקטרונים ישירים, כמו גם שינויים במיקרוסקופיה בשילוב עם התקדמות בעיבוד תמונה כגון איסוף נתוני העברת תמונה, הגבירו את התפוקה והאיכות של תמונות שהופקו במהלך רכישת נתונים. עלייה זו בשיעור איסוף הנתונים מדגישה את הצורך בסינון יסודי של רשתות cryoEM לפני ש-TB רבים של נתונים נרכשים.
CryoEM SPA הפך לטכניקה ביולוגית מבנית מיינסטרים באמת, ובמקרים רבים הגישה ‘ללכת אל’ עבור סוגים מסוימים של דגימות, כגון קומפלקסים מקרומולקולריים הטרוגניים ושפתיים. בעוד הפרוטוקול כאן מתאר סקירה בסיסית של צינור הספא, כל סעיף מכוסה כאן (vitrification רשת וסינון, cryoEM ועיבוד תמונה) הוא נושא בפני עצמו וראוי לחקירה במהלך פיתוח פרויקט SPA. ככל שמתקדמות טכנולוגיות הכנת הדגימה והמיקרוסקופיה, ואלגוריתמים וגישות חדשות לעיבוד תמונה עולים לרשת, SPA תמשיך להתפתח כצינור, ותסייע לחוקרים להשיג תובנות על מערכות ביולוגיות מורכבות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית. J. B. R. White ממומן על ידי קרן Wellcome (215064/ Z / 18 /Z). המיקרוסקופים של FEI Titan Krios מומנו על ידי אוניברסיטת לידס (פרס ABSL UoL) וקרן Wellcome (108466/Z/15/Z). אנו מודים לאם איאדנזה על השימוש בתסריט ניתוח המיקרוגרף שלו. אנו מכירים במקור אור יהלום לגישה ותמיכה במתקני cryo-EM במרכז הלאומי להדמיה ביולוגית אלקטרונים (eBIC) בבריטניה הממומן על ידי קרן Wellcome, MRC ו- BBRSC.
Materials
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W. The Resolution Revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R. Direct Electron Detectors. Methods in Enzymology. , (2016).
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al. Structure of the shutdown state of myosin-2. Nature. , (2020).
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation Damage in Electron Cryomicroscopy. Methods in enzymology. 481, 371-388 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (02), 129-228 (1988).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -. G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
