単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

1. グリッドガラス化 注: ステップ 1 および 2 のすべてのステップについて、すべての工具がクリーンで乾燥しており、室温で LN2 温度に冷却し、デカンドが新たに LN2 を 使用して氷の汚染を減らしていることを確認してください。可能であれば、20%の相対湿度を<湿度制御された環境内で作業します。作業を開始する前に、適切な個人用保護具とH&Sドキュメントが設置されていることを確認してください。 目的の標本がサンプル調製の準備ができていることを確認します。 適切なクライオEMグリッドを選択し、これらはグロー放電またはプラズマ処理を使用して親水性をレンダリングされていることを確認してください。プロトコルに対する多種多様なシステムとバリエーションが利用可能ですが、グリッドをグロー放電/プラズマクリーニングシステムに配置し、特定のガス混合物/化学蒸気または空気をシステムに導入する前に、チャンバーを所望の真空レベルにポンプで送るプログラムを実行する必要があります。電流がシステムを通過し、ガス粒子を電離し、グリッドの表面をより親水性にレンダリングするように誘導します。 背面の電源スイッチを使用してシステムをオンにしてグリッドガラス化用のプランジ凍結装置を起動し、タッチスクリーンがロードされるまで待ちます。 提供されたスタイラスまたは指を使用して、 コンソールで、チャンバーの所望の作業温度を設定する(利用可能な範囲は4〜60°Cであり、ほとんどの高分子4〜6°Cに推奨される)。 加湿器の底にあるゴムチューブを介して、注射器を使用して50mLのIIラボ水で加湿器を充填します。充填前にシリンジに閉じ込められた空気を取り除くことを確認してください。加湿器や水が部屋に出て出て行き過ぎないように注意してください。加湿器を充填したら、5~10mLずつシリンジプランジャーを引き戻し、真空シールを作成します。 コンソールでは、チャンバーに所望の相対湿度を設定します(利用可能な範囲は0〜100%、湿度95〜100%が一般的に使用されます)。チャンバーが濡れすぎないように、グリッド作成の直前まで湿度を「オフ」に設定します。 プランジ冷凍装置のピンセットを取得し、パッドに収まる適切なサイズにカットされたフィルターペーパーを購入するか、スタンプを使用して適切なサイズの絞りをカットします。 凍結凍結のための凍結を準備します。 金属クライオグリッドボックスホルダー、クライオゲンカップ、金属クモの脚をクーラント容器に入れます。 外側のチャンバーをLN2で満たして容器を冷やします。外側のチャンバーを上に置いて、クライオグリッドボックスホルダーの上部を覆います。〜1cmの追加のLN2 をクライオゲンカップに加え、LN2 温度へのシステムの平衡化を支援します。注:アンチコンタミネーションリングは、クライオゲンカップの周りに凝縮し、クライオクーラント/エタン汚染につながる湿度の高い空気を制限するために使用することができます。これは、一般的に湿度制御環境では必要ありません。汚染防止リングを使用する場合は、容器にLN2 をオーバーフィルしないように注意するか、後で容器にリングを押し込む際にこぼれる可能性があります。 3~5分待ってクモの脚の沸騰を観察し、さらに3分待って、ガラス化培地を凝縮するためにクライオゲンカップが十分に冷たくなるようにします。 クライオゲン(液体エタン)をクライオゲンカップに液化します。 エタンシリンダーパイプに細いチューブとノズルを取り、ガスを分配します。カミソリの刃を使用して非常に先端を切り落とすことによって開いた開口部を持つP200ピペットの先端は、ここで理想的です。先端でエタンが固まり、ガスの流れを遮断するのを防ぐためには、より広い開口部が必要です。 クライオゲンカップに残りのLN2が含まれていないことを確認し、エタンガスノズルを取り、クライオゲンカップ内に置きます。ガスボンベレギュレータを使用して、低流れを開始し、凍結原カップに凍結原ガスを分配してガスを凝縮させます。ガスが流れる先端をクライオゲンカップの壁に直接押し付けておきますが、表面に対してタッピング動作でゆっくりと前後に動かします。ガスの流れを調節して、低く安定した流れがクライオゲンカップ内で制御された方法で凝縮/リキフィーを開始できるようにします。 カップを銀色のスパイダーリムのすぐ下に充填し、ガスの流れを止め、ガスラインを慎重に取り除き、周囲のLN2 をエタンで汚染しないように注意深く取り除いてください。 液状エタンにこぼれないように十分に注意して、LN2で冷却剤容器を上に上げろ。 液体エタンが十分に冷たい温度に平衡化されるように、〜3〜5分間の位置にクモの足を残します。クライオゲンは曇り/少し不透明に見え始めます。これは、その氷点に近いということを示します。この段階では、スパイダーを取り除くためにピンセットを使用します。LN2がクライオゲンカップを取り囲む容器内に保管されている限り、エタンは液化したままで、1-2時間のガラス化に適しています。しかし、氷の汚染を減らすために、特に非湿度制御室で、可能な限り迅速に手順を完了することを目指してください。注:クモが「上に立ち往生している」ように見える場合は、ナットなどの金属オブジェクトを使用し、クモの足に保持して少しウォームアップし、脚を取り外します。 サンプルガラス化用のプランジ凍結装置と付属品を準備します。 金属クライオグリッドボックスホルダーにグリッドストレージボックスを追加し、手順全体を通して、LN2 がグリッドボックスのレベルのすぐ上まで(通常は5分毎に)上に保たれていることを確認します。 プランジ凍結デバイス画面では、[ プロセスパラメータ] ボックスに、ブロット時間(プランジ凍結デバイスパッドが一緒になる時間)、力(氷の形成の勾配を変えるグリッドからのブロッティングパッドの距離)、合計(ブロッティングパッドが満たすために入ってくる回数)を含む選択されたパラメータを入力します。個々のプランジ凍結装置と高分子の挙動に基づいて、これらのパラメータを選択します。典型的な値は、0から5の間のブロット力、1-6 sからのブロット時間、およびブロット合計1です。典型的な待ち時間(ブロットを開始してから、ブロット開始までの時間)とドレイン時間(突っ込む前のブロット後の時間)は0-2sです。注:ユーザーの好みに応じて、 オプション の追加オプション、各プレスで次のステップに移動するために 足のペダルを使用する 、 グリッド転送をスキップ (トゥイザーアームがわずかに上げられた最後のステップをスキップ)、 プロセス中に湿度をオフ にする(サンプルが適用されている間、グリッドを見にくくすることができるチャンバーのアクティブな加湿を停止する)、 およびオートレイズEthanelifte (チャンバーに上げられてクーラント容器を上げるピンセットのステップを組み合わせる – エタンコンテナステップを上げます)。 ここでは、これらのオプションがすべてオンになっています。 冷却剤容器をチャンバーの下の移動プラットフォームアームにしっかりと置く 新鮮なブロッティングペーパーを各ブロッターアームに挿入し、プラスチック製のリングクリップが固定されていることを確認します。各フィルターペーパーは16のブロット(腕回転ブロッティング紙)を可能にします。[コントロール] セクションの [ブロット用紙のリセット] ボタンを押します。 プランジ凍結装置ガラス化プロセスの1サイクルを実行して、各可動部分が期待どおりに動作していることを確認します。 押す (またはフットペダルを使用して) 新しいグリッドを配置し、 プロセスを開始し、次に 処理 してから 続行します。この段階では、ブロッティングアームが期待どおりに互いに接触していることを確認するために見てください。 加湿器を「オンにする」。水蒸気が生成されます(設定された湿度が現在のチャンバーよりも高い限り)。 関心のある標本をガラス化できるようになりました。フットペダルまたは プレイスニューグリッド を使用すると、突っ込んだロッドがチャンバーの外に降りると、ピンセットがマウントに取り付けられます。 プランジ凍結装置ピンセットを使用して、望ましいグロー排出/プラズマ洗浄cryoEMグリッドをピックアップし、グリッドメーカーに応じてサンプルアプリケーションに使用する正しい側に注意してください。これはサポートを損傷するので、ピンセットとの過度/不必要な接触を避けるために注意して、リムでグリッドをピックアップ。ピンセットの隆起部分に黒いクリップを下に移動して、ピンセットのグリッドを固定します。グリッドはしっかりと保持する必要がありますが、クリップはブロッティングパッドに接触するため、あまり下に置かないようにしてください。 クライオEMグリッドを保持するプランジ冷凍装置のピンセットを、あなたの支配的な手に向けた正しい側面を持つ空気圧アームに置きます。プランジ凍結装置ピンセットおよびチャンバーの設計は、サンプルがユーザーの手渡しに応じてチャンバーの右側または左側のいずれかを通して適用することができるようにである。注: 同じブロッティング パラメータを持つ異なる側面にサンプルを適用しても、同等の結果が得られることはほとんどないので、左利きの研究者は右利きの同僚とは独立してブロッティングパラメータを調整する必要があります。 スタートプロセスを押すとピンセットに保持されているグリッドはチャンバーに取り込まれ、クーラント容器が上がります。 プレス 処理 とピンセットは、ピペットを使用して、グリッドに標本を適用できる位置にグリッドを移動します。グリッドの正しい側に面した側ポートを開き、ピペットチップがグリッドのサポート/ベンドグリッドの損傷につながる可能性があるため、ピペットチップがグリッドに触れないようにしてサンプルを適用しますが、液滴がグリッドに分配されるように液体を十分に近づけます。通常、3~5 μL が適用されます。 [続行]を押すと、ユーザーが事前定義したパラメータを使用すると、グリッドがブロットされ、サンプルガラス化のためにクーラントカップに取り付けられたピンセットが突き出ます。ピンセットは、クーラント容器とクーラントを保持する腕と一緒に降下し、グリッドをクライオゲンに沈めておきます。 凍結原カップからLN2に沈められたグリッド収納ボックスにグリッドを転送します。 ピンセットアームからピンセットを外し、クライオゲンカップの側面にガラス状のグリッドに接触しないように細心の注意を払います。ピンセットが快適に保持されるようにグリップを調整します。できるだけ迅速かつ慎重に、グリッドをクライオゲンから LN2 に移動します。片手で、ピンセットを指で閉じ、もう一方の手で黒いクリップを上方にスライドさせ、ピンセットを閉じます。グリップを取り込み、グリッドをグリッドストレージボックスに操作します。 すべてのグリッドが作成されるまで、手順 1.10 ~ 1.19 を繰り返します(一般的なセッションでは 4 ~ 12 のグリッドを作成します)。次の段階まで LN2 デュワーでグリッドを含むすべてのグリッドストレージボックスを保管します。 オートローダー顕微鏡にローディングするためのクリッピンググリッド 前述の プロトコル 28 に従ってグリッドをオートグリッドアセンブリにクリップします。 3. リモートログを顕微鏡に安全に 注意:執筆時点でCOVID-19コントロールを使用するが、国際旅行に関連する環境問題にも伴い、より多くの顕微鏡検査施設がユーザーがリモートで操作するサービスを提供しています。この実装方法は、各施設のローカル IT 構成と、その内部および外部ユーザー コミュニティのニーズによって異なります。ここでは、eBICでクライオエームにリモートアクセスし、EPUソフトウェアを介して顕微鏡を制御するプロセスについて説明します。 リモートでcryoEMのにログインします。リモート ログオンは、顕微鏡サポート PC にアクセスするために NoMachine ソフトウェアを介して仲介され、ユーザーの FedID ログオン資格情報を介して訪問に登録されたユーザーにのみアクセスできるように構成されています。アクセスは、セッションの間だけアクティブなままです。 NoMachine を開き、パスワード認証を使用して nx-cloud.diamond.ac.uk する新しい NX 接続を開始します。 接続を開き、ユーザー名 fedid@fed.cclrc.ac.uk および FedID パスワードでログインします。利用可能なオプションから関連する顕微鏡に対応するアイコンをダブルクリックして、関連するサポートPCへの接続を開きます。 Windows ログオン画面でユーザー名 clrc\FedID とパスワードを入力します。 デスクトップアイコンからTeamViewerソフトウェアを開き、指定されたパスワードでパートナーID:TEMに接続します。これにより、サポート PC から TEM PC への接続が確立されます。TeamViewer リボンの [次のモニター ] ボタンを使用して、顕微鏡のユーザー インターフェイスと EPU ウィンドウを切り替えることができます。 顕微鏡機能は、EPUインターフェイスを介して直接ユーザーによって制御することができます。 4. オートローダー顕微鏡へのサンプルのロードと氷とサンプルの品質のスクリーニング 注:このセクションでは、オートローダーとEPUソフトウェアを搭載した顕微鏡をサンプルスクリーニングに使用しますが、これは他のソフトウェアと他のメーカーのサイドエントリーシステムとクライオOEMを使用して実現できます。 切り取ったグリッドを、前述のとおりに顕微鏡オートローダーにロードします28。 顕微鏡のユーザーインターフェイスの自動ローダータブで、矢印を使用して オプション ダイアログをタブアウトし、 インベントリ ボタンを押します。これにより、カセット内の各位置を順次チェックして、カートリッジが存在するかどうかを確認します。占有スロットは青色で表示されます。すべての占有スロットがマップされている場合は、 インベントリボタンを もう一度押して現在の位置の後に停止し、それ以外の場合は、すべての占有スロットがマップされるまで実行したままにします。表示されたボックスに、すべての占有スロットにサンプルの詳細をラベル付けします。 マイクロスコープ列に転送するグリッドをハイライト表示し、[ 荷重]をクリックします。グリッドがステージに正常にロードされると、スロットラベルは青から黄色に変わります。グリッドのスクリーニングに進みます。 EPUソフトウェアを開きます。[ 準備] ページで、[ 取得用の光学と設定 ] を選択し、ドロップダウン メニューから [アトラス ] プリセットを選択します。適切なビーム設定プリセット(例えば、64x名目マグ、スポットサイズ5、マイクロプローブ、ファルコン検出器の平行範囲の照光領域を使用して、ビーム設定プリセットを選択する詳細については、28を参照してください) [Set] を押して、パラメータを顕微鏡に押し込みます。 [列バルブを開く] を押して、FluScreen を挿入します。ビームが見え、検出器を覆うために十分に広がり、中央に配置されていることを確認します。必要に応じて、ジョイスティックまたはステージメニューを使用してグリッドのより薄い領域にナビゲートし、X と Y のステージの動きを制御します。 FluScreen を持ち上げて、EPU の プレビュー ボタンを使用して画像を撮ります。取得した画像に基づいて、より低い数のスポットサイズに移動することによって線量を増加させることができ、その逆もまた同様である。 EPU で、アトラスページに移動し、新しいセッションを押します。MRC 画像形式を選択し、スクリーニングセッションを保存するための適切なフォルダ名と場所を入力し、[適用]をクリックします。 左側のメニューから[ スクリーニング ]を選択します。各グリッドの横にあるチェックボックスをオンにすると、アトラスモンタージュが取得されます。EPUでスクリーニングセッションを 開始 します。アトラスは、チェックされたグリッドごとに取得され、完了時に利用可能なグリッドの正方形が多数表示されます。各アトラスは、スクリーニングページでそれを強調表示することによって見ることができ、同様の予測氷の厚さを色でグループ化したグリッド正方形を示すマークアップが完成します。 完了したら、収集されたアトラスを確認し、より高い倍率(すなわち、厚い氷によって乾燥も隠れもされていないグリッド四角形の適切な数を持つもの)でサンプル品質を評価するのに適したグリッドを特定します。EPU スクリーニング メニューで選択したグリッドをハイライト表示し、[ サンプルの読み込み] をクリックします。 梁設定プリセット(各ステージで必要なビーム設定プリセットの説明については 28)とプレビュー機能を使用して、目的のグリッドの正方形をより詳細に確認します。 アトラスのスクリーニングメニューから、現在ロードされているグリッドを選択し、グリッドイメージ上の目的の位置を右クリックしてグリッド四角形に移動を選択して、塗りつぶし穴を含むグリッド正方形にステージを移動します。 EPU、準備ページに戻り、グリッドスクエアプリセットを選択します。 EPU、自動機能ページを開き、GridSquareプリセットを使用してステージ傾斜による自動ユーセントリックを実行して、サンプルをユーセント高に移動します。注:ビームチルトによる自動ユーセントリックも利用可能で、ステージチルトによる自動ユーセントリックよりも高速ですが、通常は精度が低くなります。 EPU で、準備、新しいグリッドスクエア プレビューイメージを取ります。異なる穴の間で異なるグレーの値が異なって、異なる氷の厚さを示していることに注意してください。右クリックで右クリックして、ステージを穴の上に移動>ステージを移動します。穴/ユーセント高さのプリセットとプレビューを選択します。注: 目的の粒子の分子量と形状によっては、穴/ユーセント高さの倍率で識別できる場合があります。 [データ収集]プリセットを選択し、パーティクルを簡単に識別できる倍率を設定します(一般的に<2 Å/ピクセルのオブジェクトサンプリングに対応)。露光電子線量が〜40-80 e/Å2の場合は、脱焦点オフセットを~-3~-5 μmに設定します。 4.4のステップを反復処理して、グリッド全体の粒子分布、配向、汚染に対する氷の厚さの範囲を評価します。パーティクルの分布は、穴の中心と対するエッジの近くで変化する可能性があるため、穴を使用して異なる位置を調査することが重要です。 十分なグリッドの正方形を持っているようにアトラスからの約束を示すすべてのグリッドをスクリーニングします。これらを顕微鏡に保管してEPUを使用してデータ収集に進むか、サンプルを顕微鏡からアンロードし、データ収集がスケジュールされるまでLN2 の下に保管します。 5. 単一粒子クライオEMデータ収集(遠隔操作に焦点を当てた) 注: EPU を使用したデータ収集の詳細なプロトコルについては、製造元マニュアルおよび他社 28 に記載されています。ここでは、リモート操作(すなわち、作業を行うためのハンドパネルの使用を減らし、ソフトウェアベースの代替手段を使用する)のこのプロトコルの変更が強調されています。 セッション中に収集済みの場合を除き、グリッドのアトラスを収集します。 プロジェクトの実験ニーズに応じて、ビーム設定のプリセットをそれぞれ定義します。 画像シフトキャリブレーションを実行します28。 EPU セッションをセットアップします。 EPU で、[EPU] ページの [セッションのセットアップ] を選択し、環境設定から [新しいセッション] を選択し、[新規] を選択します。 以前の設定を使用するオプションを提供するポップアップが表示される [新しいセッション ] を選択します。 はい 、現在のEPUセッションに、以前のEPU(すなわち、検体キャリア、焦点解除範囲、自動焦点設定、グリッドタイプ)からの設定を自動的にロードします。 環境設定から「新規」を選択すると、ユーザーは保存された環境設定(フォーカス解除範囲、自動フォーカス設定、グリッドタイプ)を持つファイルを選択でき、この情報はEPUにプリロードされます。 セッション名に有益な情報を入力します。ローカルの施設は、命名規則を提案する場合があります。 [ タイプ] で、[手動] を選択 します。 取得モードでは、正確な穴中心または高速取得を選択します。 [イメージ形式] で、目的の形式を選択します。 適切な ストレージフォルダ を選択すると、EPUはセッション名のディレクトリを作成します。 使用しているグリッドタイプと穴間隔(Quantifoil 1.2/1.3など)に応じて適切な 検体キャリアを選択し、[ 適用]を押します。このプロトコルは、ホールの通常の配列のテンプレートを生成するためのプロセスを記述します 初期グリッドの正方形を選択し、取得テンプレートを設定します。[四角の選択] をクリックし、すべての四角形が緑色の場合は、左上の [すべて選択解除] をクリックします。 タイルを開く (開いているタイル>右クリックします)。正方形を選択します(右クリック>追加し、[ステージ>グリッドの正方形に移動]を右クリックします)。 穴選択に移動し、自動ユーセントリックを押します。これが完了し、グリッドスクエアの画像が撮影されるまで待ちます。オートファンクションが失敗した場合、高さが大幅にオフになっている可能性があります。場合は、グリッドスクエア倍率でFluScreenを使用して手動で調整することができます。 穴のサイズを測定します。黄色の円を移動し、正しいサイズと間隔で穴の上に表示されるように調整します。 [穴を探す]を押します。穴が正しく見つかったことを確認します。穴のサイズを変更し、再び穴を見つける場合。穴が正しく見つかるまで、この操作を繰り返します。一貫して失敗する場合は、グリッドの正方形の倍率で低い(明るい)スポットサイズに移動することを検討してください。 右側の フィルター氷品質 ヒストグラムを使用して、穴の選択を調整します。これは、厚い氷と薄い氷のある領域を除外するのに役立ちます。このセッションで選択したグリッドの四角形に対しては、このオプションが記憶されます。 上部にある[選択]メニューのツールを使用して、穴の 選択 を最適化します。たとえば、[ グリッド バーの近くの穴を削除] をクリックします。 テンプレート定義に移動し、取得を押します。 [ 検索して中心の穴] をクリックします。今度は、穴の周りに黄色い円を持つ穴の画像が表示されます。注: 穴の見つけるのに苦労する場合は、目的の絞りを挿入します。それでも穴が見つからない場合は、穴/ユーセント高さプリセットの露出時間を長くするか、このプリセットのデフォーカスを増やすか、画像をビンに入れてみてください。大きな焦点の変更は、イメージ シフトの位置を変更可能性があります。 ステージシフト後の遅延とイメージシフト後の遅延時間を1~5sに変更します。 [最大イメージ シフト値(オプションが使用可能な場合)] が必要な場合にオンにします。収差フリーイメージシフトコレクションが使用されている場合、この値はEPU構成ファイルで定義され、それ以外の場合は5μmが標準値になります。 [ 取得領域を追加]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。取得領域を目的の位置(すなわち、穴の端)に移動して、集録領域がビームで二重に露出しないようにします(緑色の円の正方形は検出器領域を表し、緑の円はビーム直径です)。 右上に、焦点を解除する範囲を追加します。次に、他の取得エリアを追加します。膜タンパク質プロジェクトの典型的な焦点脱焦点リストは-0.8~-3 μmの焦点脱焦点です。 [ オートフォーカス領域を追加 ]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。オートフォーカス領域を穴を囲むカーボンに移動します。標準的な方法は、正方形全体のz高さの変動に応じて、AFISを使用する場合、または5〜15μmごとに中心を置いた後に自動焦点を合わせる方法です。 0.05 nm/sの設定されたしきい値を使用して、グリッドの正方形ごとに1回実行される ドリフト測定領域を追加をクリックします。ドリフト測定領域は、オートフォーカス領域と直接重なることができます(そして、それは良い考えです)。ドリフト領域とオートフォーカス領域が取得領域と重ならないようにします。メモ: テンプレートの実行機能を使用して、テンプレートを確認できます。これは、取得領域が移動する必要があるかどうかを確認することをお勧めします(例えば、画像にカーボンが多すぎる/不十分な炭素)が必要ではありません。 [四角選択] に戻り、グリッドで取得する正方形を選択します。取得エリアの数と予想データ取得率 (検出器と実験設定に基づく施設から) を使用して、必要な取得エリアの数を予測します。 必要な四角形をすべて選択したら、[ すべての正方形を準備]を押します。 各正方形が収集されたら、グリッドの正方形間を移動し、 選択ブラシを使用して穴を微調整します。 標本上のステージの位置に移動し、ユーセントリックな高さを設定するために自動機能を使用します。前述の28のように顕微鏡の位置合わせを行いますが、コマフリーアライメントを実行して客観的な乱視を手動で補正する代わりに、ソフトウェア内のアライメントツールを使用します。簡単に言えば、ビーム条件を取得し、客観的な開口(OA)が除去され、ステージがユーセントリックな高さで標本のビーム安定した領域の上に配置されていることを確認します。OAを再挿入して中央に配置し、EPUで対物レンズの乱視を補正する前に、オートファンクション内でコマフリーアライメントを行います。両方のアライメントが適切な値(<150 nmの昏睡状態で、ゼロの乱視に近い)に収束することを確認します。 自動取得を開始する前に、オートローダーターボポンプの電源がオフになっていることを確認し、目的の絞りを挿入します。 自動取得で、[開始] をクリックして自動データ取得を開始します。 6. EM密度マップを生成する画像処理 注:cryoEM施設の大半は、顕微鏡写真映画の「オンザフライ」の前処理を提供しています。RELIONパイプライン28,33、cryoSPARC43、Scipion34、WarpEM44など、さまざまなソフトウェアパッケージとアプローチが用意されています。RELION ベースのパイプラインはここで説明されており、ユーザーがマイクログラフ ムービーをコンピューティング リソースにアクセスできる適切なストレージの場所に移動したと想定しています。膜タンパク質プロジェクトのプロセスと代表的な結果の概要が提供され、詳細な説明とステップバイステップチュートリアルは、RELIONホームページで見つけることができます: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion。 顕微鏡写真の動き補正とCTF推定の「オンザフライ」分析を行います。プロジェクト ディレクトリ内で RELION を起動します。インポート、モーション補正、CTF推定ジョブをスケジュールして、データ収集と転送と並行してループします。顕微鏡写真解析スクリプト28は、乱視と推定デフォーカス値に関するリアルタイムの視覚的フィードバックを提供する(代表的な結果を参照)。 事前に処理された顕微鏡写真からパーティクルを選択します。選択する自動パーティクルピッキングソフトウェアパッケージの数があります。RELION37 の [自動ピッキング] タブでは、参照無料およびテンプレート ベースのピッキング オプションを使用できます。他のプログラムは、例えば粒子ピッキング35のためにcrYOLOを使用して、様々なステップに使用され得る。 CTF補正された顕微鏡写真から粒子を抽出する。注: 初期の「クリーンアップ」、処理ステップ、抽出時のパーティクルのダウンスケール/ビンに必要な計算時間を短縮します。抽出ジョブの実行方法の詳細については、RELION 3.1 チュートリアルを参照してください。このプロジェクトでは、パーティクルは最初は 2 倍のビンでビン分割されていました。 2D クラスの平均化を実行します。100 ~200 クラスに分類すると、≥ 100,000 個のパーティクルを含むほとんどのデータセットに適しています。サンプルに高い対称性(すなわち、二面体ウイルス)がない限り、データセットが小さい場合でも、200以上のクラスまたは50クラス未満を使用することは推奨されません。粒子の最も長い次元を収容するのに十分な大きさのマスク直径を設定しますが、隣接するパーティクルを除外するのに十分な十分な長さを設定します(これは試行錯誤を必要とする場合があります)。 サブセット選択ジョブを使用して、優れたクラス(構造詳細を含むクラス)を選択します。良い 2D クラス平均と悪い 2D クラスの平均の例は、代表的な結果セクションにあります。 RELION の 3D 初期モデル ジョブを使用して、データから初期モデル デノボ を生成します。注: クリーンでないパーティクル スタックは、ジャンク/最適でないパーティクルをふるいにかけることができる追加の機会を提供するため、多参照 ab initio SGD (確率的勾配降下) の改良の恩恵を受ける可能性があります。目的のパーティクルに対応できるマスク直径を選択し、[SGD] タブのフィールドの既定値は、通常は適切に機能するためそのままにしておきます。キメラ(または別の適切な視覚化プログラム)で初期モデルが妥当に見えるようにしてください(代表的な結果を参照)。 ステップ 6.6 からの出力を参照モデルとして使用して、データ内の異質性に対処するために 3D 分類を実行します。キメラで結果のマップを評価します。独自の立体構造状態に対応するパーティクルスタックを独立して処理します。サブセット選択ジョブを使用して、対象となるクラス/クラスを選択し、関連付けられたパーティクルスタックの particles.star ファイルを生成します。 3D 自動調整を実行します。前の手順で取得した 3D クラスの平均を、対応するパーティクル スタックのリファインの参照として使用します。絞り込みの解像度がデータのナイキスト限界に近づいている場合は、ダウンスケーリングなしでパーティクルを再抽出します。再抽出した後、ビン分割されていないパーティクル スタックで 3D 自動調整ジョブを繰り返します。この場合、ピクセルとボックスのサイズが再抽出されたパーティクルイメージのサイズと一致するために、3D 参照モデルを再スケールする必要があります。この操作を実行するには、relion_image_handler コマンド ライン ツールを使用します。 必要に応じて、細分化で対称性を利用します。再構築されたマップに対称性がある場合は、relion_align_symmetry コマンド ライン ツールを使用して、適切な対称軸にマップを位置合わせします。作成された位置合わせマップは、参照タブで指定された適切な対称演算子を使用して、新しい 3D 自動細分化ジョブの参照として使用します。 3D 自動調整からマップをシャープにします。これは RELION の後処理ジョブを使用して行われますが、まず、適切なマスクを精製マップから作成する必要があります。マスク作成と後処理の手順は、RELION チュートリアルで詳しく説明しています (代表的な結果も参照)。注: RELION のベイズ研磨機能と CTF 改良機能を使用すると、多くの再構成の解像度をさらに改善できます。CTF の改良ジョブ タイプを使用して、高次収差 (ビームチルト、トレフォイル収差、4 番目 の順序収差) を推定および修正し、別々のジョブとして異方性拡大と粒子単位の焦点の解除を推定および修正します。この後、ベイジアン研磨ジョブ(トレーニング済みまたはデフォルト値)を使用して、粒子単位でビーム誘発運動に対処します。RELION 3.1チュートリアルで取り上げたように、これらのジョブは反復的なアプローチ(CTF精製→ベイズ研磨→3D自動改良→後処理→の恩恵を受けるでしょう。ループ) 両方が高解像度モデルの恩恵を受けるので。 必要に応じて、EM密度マップの利き手を修正します。マップを調べて、既存の原子モデルに適合させようとするか、アルファらせん領域の利き手を評価することによって、利き手が正しいかどうかを判断します。必要に応じて、’vop zflip’ コマンドを使用して UCSF Chimera45 の z 軸に沿ってマップを反転します。