Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.
Heute ist die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) die einzige Technik, die strukturnahe Daten über makromolekulare Komplexe in situliefern kann. Aufgrund der starken Wechselwirkung eines Elektrons mit der Materie beschränken sich hochauflösende Kryo-ET-Studien auf Proben mit einer Dicke von weniger als 200 nm, was die Anwendbarkeit von Kryo-ET nur auf die peripheren Regionen einer Zelle beschränkt. Ein komplexer Workflow, der die Vorbereitung dünner zellulärer Querschnitte durch kryofokussierte Ionenstrahlmikrobearbeitung (Kryo-FIBM) umfasst, wurde in den letzten zehn Jahren eingeführt, um die Erfassung von Kryo-ET-Daten aus dem Inneren größerer Zellen zu ermöglichen. Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung von zellulären Lamellen aus einer Probe, die durch Tauchgefrieren unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als prototypisches Beispiel einer eukaryotischen Zelle mit breiter Nutzung in der zellulären und molekularbiologischen Forschung verglast wurde. Wir beschreiben Protokolle zur Vitrifikation von S. cerevisiae in isolierte Flecken einiger Zellen oder eine kontinuierliche Monoschicht der Zellen auf einem TEM-Gitter und stellen für diese beiden Proben ein Protokoll zur Lamellenpräparation mittels Kryo-FIB zur Verfügung.
Jüngste Technologie- und Softwareentwicklungen haben die Elektronen-Kryomikroskopie (Kryo-EM) von verglasten biologischen Proben zu einer der Schlüsseltechniken in der strukturbiologischen Forschung in den letzten zehn Jahren gemacht1,2. Die Herstellung einer Probe für Kryo-EM besteht in der Regel aus dem Auftragen eines gereinigten Proteins oder eines Proteinkomplexes mit Nukleinsäure auf den Probenträger (TEM-Gitter), gefolgt von der Entfernung des größten Teils der Flüssigkeit mit einem Filterpapier und dem Einfrieren des Gitters mit der restdünnen Schicht einer Probe in flüssiges Ethan oder Propan3 . Die Probe wird somit in einer dünnen Schicht (typischerweise <80 nm) amorphen Puffers in einem vollständig hydratisierten Zustand, unter nahezu nativen Bedingungen und ohne chemische Fixierung oder Schwermetallkontrast fixiert. Die Abbildung der strukturell homogenen Probe im Transmissionselektronenmikroskop liefert dann Daten, die zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur des Makromoleküls bei nahezu atomarer Auflösung mit einem Einzelpartikelanalyseprotokoll2verwendet werden können. Eine solche in vitro Struktur entspricht der Darstellung des Makromoleküls unter den Bedingungen und der Behandlung, die während der Probenvorbereitung verwendet werden. Obwohl die unter den In-vitro-Bedingungen ermittelten Strukturen in der Regel dem voll funktionsfähigen Zustand des Makromoleküls entsprechen, würde die Fähigkeit, räumliche Beziehungen zwischen verschiedenen Makromolekülen innerhalb der Zelle abbilden, einen zusätzlichen funktionalen Kontext zu den Strukturdaten liefern.
Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) wird verwendet, um 3D-Volumina pleomorpher Objekte oder makromolekularer Komplexe in situ4,5zurekonstruieren. Der Vorteil von Kryo-ET besteht darin, dass die dreidimensionale Information durch Die Abbildung einer einzelnen Entität erhalten wird. Die Auflösung, mit der einzelne makromolekulare Komplexe oder Organellen beobachtet werden, ist jedoch sehr begrenzt. Daher ist eine Mittelung der Makromoleküle (Sub-Tomogramm-Mittelung, STA) mit der gleichen Struktur aus einer größeren Anzahl von Tomogrammen notwendig, um 4-8 Å-Auflösungsmodelle aus den Kryo-ET-Daten6,7zu erreichen. Kürzlich wurde gezeigt, dass Kryo-ET und STA auch zur Bestimmung hochauflösender Strukturen makromolekularer Maschinen wie Ribosomen im Kontext der zellulären Umgebung eingesetzt werden können7. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie ist jedoch durch die Probendicke begrenzt. Im Allgemeinen ist dies kein Problem für Einzelpartikel-Kryo-EM, wo die Optimierung der Vitrifikationsbedingungen schließlich zur Einbettung der Probe in eine dünne Eisschicht führen kann. Auf der anderen Seite sind die meisten Zellen für den 300 keV Elektronenstrahl tatsächlich nicht elektronentransparent. Der unelastische mittlere freie Weg in den verglasten biologischen Proben für die 300 keV-Elektronen beträgt etwa 395 nm8, was bedeutet, dass Kryo-ET-Studien für die meisten Zellen auf die zelluläre Peripherie beschränkt sind.
Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Probe auf eine ausreichende Dicke für Kryo-ET zu verdünnen. Die Kryo-Ultramikrotomie nutzt das mechanische Schneiden der Probe mit einem Diamantmesser bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs (-196 °C), um 60-80 nm dicke Abschnitte bereitzustellen, die für Kryo-ET9,10,11geeignet sind. Mehrere Schnitte können aus einer einzigen Zelle vorbereitet werden und die Datenanalyse kann schließlich 3D-Strukturinformationen für den größeren Teil der Zelle erzeugen. Das mechanische Slicing kann jedoch mehrere Artefakte wie gekrümmte Abschnitte, Spalten oder Probenkompression verursachen, die die resultierende Struktur beeinflussen und die Kryo-ET-Daten verzerren können10,11,12. Die kryofokussierte Ionenstrahlmikrobearbeitung (Kryo-FIBM) stellt einen alternativen Ansatz dar, bei dem ein dünner Zellschnitt durch allmähliche Ablation der Probe unter Verwendung eines fokussierten Strahls von Ga+ Ionen (FIB) in einem mehrstufigen Prozess hergestellt wird, was zu einem 80–300 nm dicken zellulären Querschnitt (Lamelle) führen kann13,14,15 . Im Gegensatz zur Kryo-Ultramikrotomie wird nur eine Lamelle aus einer einzigen Zelle hergestellt, die ~ 0,3-3% ihres Volumens ausmacht, und die Mikrobearbeitung mehrerer Zellen ist in der Regel notwendig, um einen Bereich von Interesse im gefrästen Querschnitt zu finden. Darüber hinaus ist der Durchsatz des gesamten Workflows heutzutage noch recht gering, oft beschränkt auf 6-8 hochwertige Lamellen aus einer 8-stündigen Kryo-FIBM-Sitzung. Zum anderen sind die Kryo-FIBM-Querschnitte frei von jeglichen Kompressionsartefakten und bieten einen geeigneten Eingang für hochauflösendes Kryo-ET. Darüber hinaus ist die Übertragung der Lamelle auf den Probenträger für Kryo-ET nicht notwendig, da die Probe während des gesamten Lamellenvorbereitungsprozesses auf dem TEM-Gitter zurückgehalten wird und dasselbe Gitter anschließend auf TEM übertragen werden kann. Wir gehen davon aus, dass der Durchsatz des Kryo-FIBM bald deutlich verbessert wird, vor allem durch die Verfügbarkeit von Software für das unbeaufsichtigte Lamellenfräsen16,17 und die Verwendung von FIBs, die nach dem Prinzip des Charge-Couple-Plasmas arbeiten, was eine schnellere Materialablation ermöglicht.
Saccharomyces cerevisiae (Hefe) sind eukaryotische Zellen mit Kugelform und Durchmesser von ~2-5 μm. Dank ihrer Größe, Zugänglichkeit, Genetik, Generationszeit und einfachen Manipulation wird die Hefe als eukaryotischer Modellorganismus in der zell- und molekularbiologischen Forschung umfassend untersucht, ähnlich wie Escherichia coli,die als prokaryotischer Modellorganismus in der Bakteriologie gut untersucht ist. Die Hefe kann leicht in Suspension kultiviert werden und in kurzer Zeit wird eine hohe Menge an Zellen erzeugt (Verdopplungszeit 1 – 2 Stunden). Noch wichtiger ist, dass Hefe eine komplexe interne Zellstruktur mit tierischen und pflanzlichen Zellen teilt, während sie ein kleines Genom behält, das aus einem geringen Gehalt an nicht-kodierender DNA besteht. Die strukturelle Charakterisierung des Hefeproteoms aus den hochauflösenden In-situ-Daten kann somit helfen, eine mechanistische Beschreibung für die umfangreiche Menge an funktionellen Daten in der Literatur zu liefern.
Hiermit stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Erfassung von in situ Kryo-ET-Daten an der Hefeprobe zur Verfügung, das alle Schritte von der Probenkultivierung über die Kryo-FIBM-Lamellenvorbereitung bis hin zum Probentransfer zu TEM zur Kryo-ET-Datenerfassung abdeckt.
Die Vorbereitung der Zellproben für Kryo-ET ist ein komplexer Workflow, der den Einsatz mehrerer High-End-Instrumente erfordert. Die Probenqualität kann bei jedem Vorbereitungsschritt beeinträchtigt werden, der den Durchsatz des gesamten Protokolls beeinflusst. Darüber hinaus stellt die Notwendigkeit des Probentransfers zwischen einzelnen Instrumenten ein zusätzliches Risiko der Probenkontamination oder Devitrifikation dar. Daher ist die Optimierung einzelner Schritte im Probenvorbereitungs-Workflow von hoher Bedeutung, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit des Lamellenvorbereitungs-Workflows zu erhöhen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die optimierte Herstellung von Saccharomyces cerevisiae zur strukturellen Charakterisierung makromolekularer Komplexe in situ mittels Kryo-ET.
Das Protokoll beschreibt die Herstellung von zwei Arten von Hefeproben, die sich hauptsächlich in der Konzentration der Zellen auf dem TEM-Gitter unterscheiden. Beide Hefeproben ergaben hochwertige Lamellen für Kryo-ET und die Auswahl des Probentyps kann entsprechend den Zielen der jeweiligen Studie erfolgen. Die Hefe bildet isolierte Cluster von wenigen Zellen, die im ersten Fall zufällig über die Gitteroberfläche verstreut sind, während für den zweiten Probentyp eine kontinuierliche Monoschicht von Zellen auf der TEM-Gitteroberfläche vorhanden ist. Ersteres eignet sich dank des geringen Volumens des zu fräsenden Materials für die schnelle Lamellenvorbereitung. Die endgültige Lamelle ist ziemlich kurz und enthält daher nur 2-4 zelluläre Querschnitte. Die für die Probenvorbereitung geeigneten Bereiche sind zufällig über die Gitteroberfläche einschließlich der Gitterquadrate verteilt, was die Automatisierung des Lamellenvorbereitungsworkflows teilweise einschränken kann. Letztere Art der Probe erfordert die Verwendung größerer Ströme während der anfänglichen Mahlphase, um die Gesamtmahlzeit beizubehalten. Darüber hinaus ist diese Art von Probe anfälliger für Artefakte, die durch ungleichmäßiges Fräsen (Vorhang) entstehen. Daher wird GIS 50% länger auf die Probenoberfläche gesputtert als bei der Probe mit kleinen Zellclustern, um eine dickere Schutzschicht zu bilden. Als nächstes wird die Probe mit einer zusätzlichen Iridiumschicht (alternativ Platin oder Gold) gesputtert, um die GIS-Schicht auszuhärten, steifer zu machen und die Leitfähigkeit der Probenoberfläche zu erhöhen. FIBM von zusätzlichen Bereichen auf jeder Seite der Lamelle (~ 2-5 μm von der Lamellenkante) während des ersten Schritts des groben Lamellenfräsens wurde als vorteilhaft befunden, um die Anzahl der gebrochenen Lamellen höchstwahrscheinlich aufgrund der verringerten Spannung im endgültigen Querschnitt zu verringern23. Die endgültige Lamelle ist lang und enthält ~ 10 zelluläre Querschnitte, was die Anzahl der für Kryo-ET geeigneten Regionen erhöht. Die unsachgemäße Vitrifikation des Mediums oder Puffers zwischen den Zellen kann leicht durch die Zugabe des Kryoschutzmittels zur Pufferlösung (5% Glycerin, das in dieser Studie verwendet wurde) abgeschwächt werden. Da die meisten Quadrate für die Lamellenvorbereitung geeignet sind, eignet sich die Probe mit Zellen, die in einer kontinuierlichen Monoschicht organisiert sind, gut für die unbeaufsichtigte Lamellenvorbereitung.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Lamellenvorbereitung ist die Übertragung auf das Transmissionselektronenmikroskop und die korrekte Positionierung der Lamelle auf die Neigungsachse des Mikroskopetablierungs. Optimalerweise steht die Lamellenhauptachse senkrecht zur Neigungsachse des Mikroskops, was eine Verfolgung und Fokussierung auf Höhe des abgebildeten Bereichs ermöglicht und verhindert, dass die Lamellenkanten das Sichtfeld bei hohen Neigungswinkeln abschirmen. Bei der Erfassung der Kryo-ET-Daten nach dem dosissymmetrischen Schema18 sollte die Probe zunächst im Mikroskop gedreht werden, um die Neigung der Lamelle in Bezug auf die Gitterebene zu kompensieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037), finanziert durch das Horizon 2020-Programm der Europäischen Kommission, und die CIISB-Forschungsinfrastruktur, ein Instruct-ERIC-Zentrum (LM2018127). Wir danken für die Unterstützung von Thermo Fisher Scientific Brno.
Agar | Himedia | MB053 | |
Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
Glycerol | Merck | G5516-1L | |
ethane | Messer | 1007 | |
LN2 | Lineq | LN2-1L | |
Peptone | Merck | P5905-1KG | |
Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
Tweezers | Dumont | T539 | |
Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Disposable | |||
Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
Equipment | |||
Autoclave | Systec | 101291545 | |
balances | BEL | M124A | |
Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |