Подготовка и крио-FIB микрообработка Saccharomyces cerevisiae для криоэлектронной томографии

1. Культивирование и подготовка клеток Saccharomyces cerevisiae для витрификации Приготовьте жидкую питательную среду для Saccharomyces cerevisiae. Автоклав стеклянной бутылки объемом 500 мл для приготовления питательной среды. Взвесьте 2,2 г дрожжевого экстракта (1,1%) и 4,4 г Пептона (2,2%) и смешайте в 200 мл воды. Стерилизуют автоклавами в течение 15 мин при 121 °C. Взвесите 10 г порошка глюкозы и смешайте в 50 мл воды, чтобы получить 20% раствор глюкозы. Пропустите раствор через фильтр 0,2 мкм и храните при 4 °C. Приготовьте твердую среду для Saccharomyces cerevisiae. Взвесите 4 г порошка агара и смешайте с 200 мл питательной среды. Стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при 121 °C. Охладить среду до 40-50 °C и добавить 20 мл 20% стерильной глюкозы (приготовленной на предыдущем этапе). Налейте ~20 мл полной среды в чашку Петри и дайте ей затвердеть при температуре окружающей среды. Оберните агаровые пластины в парапленку для защиты от высыхания и храните при 4 °C. Культура Saccharomyces cerevisiae в суспензииПРИМЕЧАНИЕ: Протокол оптимизирован для получения образца крио-FIBM из суспензии клеточной линии Saccharomyces cerevisiae штамма BY4741 [ATCC 4040002] или аналогичных штаммов. Автоклав 50 мл колбы Эрленмейера (или аналогичной). Работайте в вытяжке или ламинарной блоке. Пипетка 10 мл питательной среды в стерильную 50 мл колбу Эрленмейера. Дополнить среду 1 мл отфильтроированной 20% глюкозы. Выберите одну колонию дрожжей из агаровой пластины стерильной, одноразовой петлей прививки (1-10 мкл). Поместите колбу Эрленмайера в инкубатор и культивируем при 30 °C с перемешиванием (150-200 об/мин) до достижения экспоненциальной фазы (приблизительно 7 ч).ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заметили, что экспоненциальная фаза достигается через ~ 15 ч, когда колонии собираются из агаровых пластин, которые культивировались при температуре окружающей среды в течение 4 недель. См. также Примечание ниже. Культура Saccharomyces cerevisiae на агаровой тарелке из глицеринового бульона. Используйте новую агаровую пластину из хранилища при 4 °C. Возьмите запас S. cerevisiae из морозильной камеры с температурой -80 °C и поместите его в морозильную стойку, чтобы избежать полного оттаивания запаса. Соскоблить и перенести небольшую культуру стерильной петлей инокуляции (1-10 мкл) в 50 мкл питательной среды. Правильно перемешать. Переложить весь объем смешанной культуры S. cerevisiae и диспергировать стерильной палочкой по поверхности агаровой пластины. Инкубируют при 30 °C в течение приблизительно 48 часов до образования колоний диаметром 1,5-2 мм.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом рекомендуется культивировать колонии заново. Колониям старше 1 недели потребуется длительный период для выращивания в жидких средах, чтобы достичь фазы экспоненциального роста. Культура Saccharomyces cerevisiae на агаровидной тарелке. Используйте подготовленные агариные пластины с выращенными колониями S. cerevisiae. Пипетка 10 мл стерильной питательной среды и 1 мл отфильтрования 20% глюкозы в колбу Эрленмейера 50 мл. Выберите одну колонию культуры S. cerevisiae со стерильной петлей прививки и смешайте со питательной средой в колбе. Инкубировать 50 минут при 30 °C с перемешиванием (150-200 об/мин). Разбавить культуру суспензии в десять раз питательной средой и диспергировать 50 мкл суспензии на агаровой пластине стерильной палочкой для разбрасывания. Инкубируют при 30 °C в течение приблизительно 48 часов до 1,5-2 мм колоний. Оберните края чашки Петри парапленкой, чтобы она не высохела. Хранить при комнатной температуре и использовать максимум 4 недели. Подготовьте Saccharomyces cerevisiae для погружения в клеточные кластеры. Готовят культуру клеток S. cerevisiae согласно протоколу в разделе Культивирование Saccharomyces cerevisiae во суспензии (раздел 1.3) и инкубируют ~7 ч при 30 °C с перемешиванием (150-200 об/мин). Измерьте OD культуры суспензии клеток S. cerevisiae при 600 нм с помощью спектрофотометра UV/Vis. Сконцентрируйте клеточную суспензию до OD600 = 1. Подготовьте S. cerevisiae для погружной заморозки в клеточном монослое. Готовят культуру клеток S. cerevisiae по протоколу в разделе Культивирование культуры суспензии Saccharomyces cerevisiae и инкубируют ~7 ч при 30 °C с перемешиванием (150-200 об/мин). Измерьте OD культуры суспензии клеток S. cerevisiae при 600 нм с помощью спектрофотометра UV/Vis. Перенесите ячейки в среде в трубку центрифуги и осторожно вращайте в течение 2 минут с относительной центробежной силой (900 х г). Выбросьте среду из ячейки гранулы путем пипетки. Добавьте свежую среду в ячейку гранулы. Рассчитайте объем среды, чтобы получить ячейку суспензии OD600, равную 30 – 60. Добавляют глицерин (50% стоковый раствор) в клеточную суспензию до конечной концентрации 5% незадолго до витрификации.ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин работает как защитное средство, которое улучшает качество льда в областях между клетками. Глицерин добавляют в клетки только незадолго до витрификации, чтобы свести к минимуму его поглощение клеткой. 2. Витрификация образца Saccharomyces cerevisiae Сетки ТЭМ нагнетательного разряда со стороной углеродной пленки, обращенной вверх на 30-45 с (давление: 6-9 Па, ток: 7 мА). Установите для витрификации робота следующие параметры: температура: 18 °C, влажность: 100%, время промоктовки: 6 с, время ожидания: 5 с, цикл блоттинга: 1x, и сила пятна: 5.ПРИМЕЧАНИЕ: Сила пятна является специфичной для прибора величиной, и оптимальные значения силы пятна могут отличаться в разных машинах. Оптимальное значение для конкретного плунжера должно быть экспериментально подтверждено. Подготовьте жидкий этан для витрификации. Установите неабсорбировочную поверхностную подушку на прокладку для промоктирования, обращенную к образцу. Используйте фильтровальную бумагу для другой блокнота. Выберите сетку с разряженным свечением с пинцетом и установите пинцет на инструмент погружной заморозки. Нанесите 3,5 мкл суспензии S. cerevisiae на углеродную сторону сетки внутри плунжерной климатической камеры. Правильно перемешайте перед каждым нанесением на сетку. Погрузите сетку в жидкий этан. Перенесите сетку с жидкого этана на LN2. Храните сетки с остеклованными ячейками в условияхLN 2 или устанавливайте их в картридж сетки TEM для загрузки в микроскоп FIB-SEM. 3. Монтаж сеток TEM в картридж сетки ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь рабочем процессе используются сетки ТЕА, установленные в картридж сетки, для облегчения обработки образцов и передачи между микроскопами SEM и TEM. Картридж состоит из C-кольца, сетки TEM и кольца C-clip. Другие опции доступны при работе с приборами других производителей микроскопов. Рабочая станция сборки сетчатого картриджа заполнена LN2. Уровень LN2 покрывает сетку сетками TEM, но монтаж сеток TEM в картридж выполняется в парах LN2. Настоятельно рекомендуется носить защитную маску для лица или щиток во время процедуры витрификации, чтобы предотвратить загрязнение от дыхания образца. Не работайте с инструментами, которые накопили ледяное загрязнение. Соберите рабочую станцию для сборки картриджа сетки и подготовьте сухие инструменты для обрезки. Охладите сборочную рабочую станцию с помощью LN2. Охладите обтравочные инструменты до температурыLN 2. Поместите коробку сетки с остеклованным образцом на сборочную рабочую станцию. Поместите сетку ТЭМ с образцом с ячейками, обращенными вниз к С-кольцу, и закрепите С-зажимом. Поместите обрезанные картриджи в сетку и закройте их должным образом. Храните картриджи в LN2 Dewar или загружайте их в микроскоп FIB-SEM. 4. Загрузка и манипуляция образца в микроскоп FIB-SEM ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкция была написана для использования двухлучевого микроскопа Versa 3D, оснащенного системой подготовки крио-FIB/SEM PP3010. Альтернативные решения могут потребовать различных специфических параметров; однако общая концепция рабочего процесса должна по-прежнему быть актуальной. Охладите микроскоп до температуры жидкого азота. Накачайте камеру микроскопа и подготовительный блок (если они присутствуют) в высокий вакуум перед началом охлаждения (< 4 х 10-4 Па), чтобы предотвратить рост загрязнения. Установите расход газообразного азота на 5 л/мин для подготовительной камеры, ступени микроскопа и микроскопического антиконтаминатора. Подождите, пока все компоненты не достигнут температуры < -180 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Установка микроскопа FIB-SEM, используемая в этом исследовании, использует охлажденный газообразный азот для охлаждения своей стадии и антиконтаминатора. Другие системы могут использовать другой метод охлаждения ступеней. Давление в камере достигает ~3 х 10-5 Па, как только ступень и антиконтаминатор находятся при -190 °C на используемом здесь приборе. Скорость роста загрязняющего углеводороды слоя на поверхности ламели с экспериментальной установкой, используемой в этом исследовании, составляет ~ 15 нм / час. Загрузите сетчатый картридж вместе с образцом в микроскоп. Соберите и охладите погрузочную станцию до температурыLN 2. Поместите шаттл (держатель образца), сетчатый ящик с образцом, открывалку для коробки сетки и пинцет в охлаждаемую погрузочную станцию. Осторожно переложите сетчатый картридж с образцом лицом вверх в шаттл. Переверните шаттл внутри погрузочной станции в положение погрузки. Загрузите в микроскоп. Опционально покрыть образец металлическими защитными слоями.ПРИМЕЧАНИЕ: Сильный зарядный эффект можно наблюдать при визуализации замороженного гидратированного биологического материала SEM. Кроме того, визуализация биологических образцов с помощью FIB (даже при низких токах) вызывает быстрое повреждение образца. Поэтому дополнительное покрытие образца может быть выполнено внутри микроскопа FIB-SEM для защиты поверхности образца. Нанесите защитный слой металлоорганической платины с помощью системы впрыска газа (ГИС). Установите образец на эйцентрическую высоту (точка совпадения для визуализации с электронами и ионами). Наклоните сцену обратно на 45° (образец наклоняется на 90° относительно электронного пучка). Переместите сцену по оси z на4 мм ниже высоты эйцентрика. Установите иглу ГИС на 26–30 °C. Нанесение ~300-1000 нм металлоорганического платинового слоя на сетку с биологическим образцом (соответствует 30–120 с ГИС-осаждения).ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно применяем ГИС для 30 с для образцов с небольшими клеточными кластерами и 45 с для образцов с монослоем ячеек. Напыление покрывает поверхность образца проводящим металлическим слоем. Нанесите ~10 нм металлического слоя (Ir, Au, Pt) на сетку с биологическим образцом. Установка параметров микроскопа для приготовления ламели Для FIB используют следующие параметры: высокое напряжение = 30 кВ, ток = 10 пА (визуализация), 10 пА–3 нА (FIB-фрезерование) Для SEM используют следующие параметры: высокое напряжение = 2–5 кВ, размер пятна = 4,5, ток = 8–27 пА. Установите поворот сканирования на 180° для обоих лучей. Установка наклона сцены: угол фрезерования 6-11° (соответствует наклону ступени 13°–18° для челнока образца с предварительным наклоном 45° и микроскопа FIB/SEM с углом 52° между SEM и колонкой FIB). 5. Приготовление ламели Saccharomyces cerevisiae Проверьте качество сетки и выберите подходящий кластер Saccharomyces cerevisiae. Убедитесь, что сетка ТЭМ правильно промокта с обеих сторон без дополнительной воды вокруг кластера ячеек или на обратной стороне сетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить заднюю сторону сетки, поверните сцену на -10° и изобразите сетку с помощью FIB. Подбирайте оптимальные клеточные кластеры для приготовления ламели в соответствии со следующими рекомендациями. Расположите кластеры ячеек в центре сетки. Площадь фрезерования не должна выходить за пределы квадрата с размерами 1100 х 1100 мкм, расположенного в центре сетки (по 550 мкм в каждом направлении от центра сетки). Расположите кластеры ячеек в центральной части квадрата сетки без перекрытия на полосу сетки. Расположите кластеры ячеек в квадрате сетки с компактной дырявой углеродной фольгой без трещин. Убедитесь, что кластер не окружен ледяным загрязнением. Выберите оптимальное положение фрезерования в монослое Saccharomyces cerevisiae. Убедитесь, что полосы сетки, окружающие монослой ячейки на выбранном квадрате сетки, видны. Выберите оптимальное положение в сотовом монослое согласно следующим рекомендациям. Выбранные участки для фрезерования должны удовлетворять следующим критериям: Имить интересуяшую область в центре сетки. Площадь фрезерования не должна выходить за пределы квадрата размеров 1100 х 1100 мкм, расположенного в центре сетки (по 550 мкм в каждую сторону от центра сетки). Иметь интересующую область в центральной части квадрата сетки без перекрытия с полосой сетки. Не окружайте монослой ячейки ледяным загрязнением. Приготовить ламелю S. cerevisiae с крио-FIB.ПРИМЕЧАНИЕ: Схема фрезерования генерируется и центрируется относительно интересующей области. Крио-FIBM выполняется последовательно с несколькими этапами фрезерования, выполняемыми при различных настройках FIB. Ламелла толщиной около 2 мкм первоначально фрезеруется с использованием сильного тока (0,3–3 нА). Затем ламелла постепенно истончается до 500 нм. Этап тонкого фрезерования при малых токах (10-30 пА) используется для доработки ламели до толщины ~100–200 нм. Установите интересуемую область (ROI) на эйцентрическую высоту и сохраните эту позицию.ПРИМЕЧАНИЕ: Точка совпадения должна быть определена и сохранена для каждой позиции отдельно. Высота эйцентрика задается наклоном сцены до 0° и центрированием на ROI путем перемещения сцены в направлении x и y. Затем ступень наклоняется до 25°, а окупаемое окупаемое ося возвращается в центр сканируемой области путем изменения положения оси zступени. Наконец, ступень наклоняется назад до 13°–18° для фрезерования. Определите прямоугольный фрезерный рисунок над окупаемости инвестиций с направлением сканирования сверху вниз. Определите прямоугольный шаблон фрезерования ниже roi с направлением сканирования снизу вверх. Определите неактивный прямоугольный фрезерный рисунок, охватывающий интересующую область, для приблизительной оценки толщины ламели. Этот рисунок не фрезеруется во время приготовления ламели. Отметьте все узоры и установите ширину ламели(размер x). Ширина фрезерной схемы не должна превышать 2/3 ширины кластера. В большинстве случаев это соответствует 8–15 мкм. Установка параметров для грубых этапов фрезерования Ток FIB: 0,3–3,0 нА; конечная толщина ламели: 1,5–2 мкм; ширина площади FIBM: 8-12 um; наклон ступени: 13-17°; продолжительность: 8 минут; активные схемы фрезерования: верхний и нижний. Ток FIB: 0,3–1,0 нА; конечная толщина ламели: 1 мкм; ширина площади FIBM: 7,5-11,5 мкм; наклон ступени: 13-17°; продолжительность: 8 минут; активные схемы фрезерования: верхний и нижний. Ток FIB: 100–300 пА; конечная толщина ламели: 0,5 мкм; ширина площади FIBM: 7,5-11,5 мкм; наклон ступени: 13-17°; продолжительность: 8 минут; активные схемы фрезерования: верхний и нижний. Ток FIB: 30–100 пА; конечная толщина ламели: 0,3 мкм; ширина площади FIBM: 7,5-11,5 мкм; наклон ступени: 13-17°; продолжительность: 8 минут; активные схемы фрезерования: верхний и нижний. Задайте параметры для этапа тонкого фрезерования: Ток FIB: 10–30 пА; окончательная толщина ламели: <0,2 гм; ширина площади FIBM: 7-11 мкм; наклон ступени: 13-17° (+1°); продолжительность: 12 минут; активные фрезерные схемы: верхние.ПРИМЕЧАНИЕ: Грубые этапы фрезерования (5.3.6) проводятся последовательно для каждой ламели. Напротив, этап тонкого фрезерования (5.3.7) непосредственно не следует за грубым фрезерованием, но тонкие этапы фрезерования проводятся последовательно для всех ламелл в конце сеанса, чтобы свести к минимуму загрязнение углеводородами на поверхности ламели. Дополнительный наклон ступени +1° используется на стадии тонкого фрезерования для увеличения однородности толщины ламели по всей ее длине. 6. Перенос ламели Saccharomyces cerevisiae в крио-ТЭМ Приготовьте правильно высушенный Дьюар и наполните его LN2. Выгрузите образцы с ламеллами из микроскопа FIB/SEM в криокуме, перенесите их в сетчатую коробку и храните в хранилище LN2 Dewar для длительного хранения. В качестве альтернативы можно загрузить сетки непосредственно в крио-ТЭМ. Важна правильная ориентация ламели относительно оси наклона крио-ТЭМ (подробнее см. сопроводительное видео в 8:10). Убедитесь, что направление фрезерования подготовленных ламелл перпендикулярно оси наклона крио-ТЭМ. Предварительно наклоните крио-ТЭМ ступень для компенсации наклона ламели относительно плоскости сетки и соберите наклонный ряд с использованием дозосимметричной схемы19.ПРИМЕЧАНИЕ: Величина предварительного наклона (обычно 6–8°) определяется углом между плоскостью сетки ТЕА и направлением FIB во время микрообработки. Положение переднего края ламели на изображении в крио-ТЭМ может быть использовано для определения знака угла предварительного наклона. Для этого должен быть известен смысл вращения ступени микроскопа. В нашей экспериментальной установке положение переднего края ламели с правой стороны изображения, снятого в режиме nanoprobe SA, соответствует отрицательному предварительному наклону.