クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

1. ガラス化のための サッカロミセス・セレビシエ細胞 の培養と調製 サッカロミセス・セレビシエ用の液体成長培地を準備する。 成長培地の調製のための500 mLガラス瓶をオートクレーブ。 2.2gの酵母エキス(1.1%)と4.4gのペプトン(2.2%)を秤量し、200mLの水で混ぜます。 121°Cで15分間オートクレーブで殺菌する。 10gのグルコース粉末を秤量し、50mLの水で混ぜて20%のグルコース溶液を得る。0.2 μmのフィルターを通して溶液を渡し、4 °Cで保存します。 サッカロミセスセレビシエのための固体培地を準備します。 寒天粉末の4gを量り、200mLの成長培地と混ぜます。 オートクレーブで121°Cで15分間殺菌します。 培地を40〜50°Cに冷却し、20%無菌グルコース(前のステップで調製)の20 mLを加えます。ペトリ皿に完全な媒体の約20 mLを注ぎ、周囲温度で固めます。 乾燥から保護するためにパラフィルムで寒天プレートを包み、4°Cで保存します。 懸濁液の文化サッカロミセスセレビシエ注:プロトコルは、細胞株 Sアカロマイセスセレビシエ 株BY4741[ATCC 4040002]または同様の株の懸濁液からのクライオFIBM用サンプルの調製のために最適化されています。 50 mL のエルレンマイヤー (または類似の) フラスコをオートクレーブします。 フードまたはラミナーフローボックスで作業します。ピペット10mLの増殖培地を無菌50mLのエルレンマイヤーフラスコにする。 20%のグルコースを濾過した1 mLで培地を補う。無菌、使い捨て接種ループ(1-10 μL)を有する寒天プレートから酵母のコロニーを1つ選びます。 インキュベーターにエルレンマイヤーフラスコを入れ、30°Cで培養し、指数相(約7時間)に達するまで攪拌(150〜200rpm)を行います。注:周囲温度で4週間培養された寒天プレートからコロニーを摘み取ると、指数相が〜15時間後に到達することが観察されました。以下の「注」も参照してください。 グリセロールストックから寒天プレート上の文化 サッカロミセスセレビシエ 。 4°Cのストレージから新しい寒天プレートを使用してください。 S.セレビシエのストックを-80°Cの深い冷凍庫から取り出し、ストックの完全な解凍を避けるために凍結スタンドに置きます。 滅菌接種ループ(1-10 μL)を用いた小さな培養物を50μLの成長培地に移します。適切に混ぜます。 混合 S.セレビシエ 培養の全容を移し、寒天板の表面に無菌の広がった棒で分散させる。 直径1.5~2mmのコロニーが形成されるまで約48時間、30°Cでインキュベートする。注:実験の前にコロニーを新たに培養することをお勧めします。1週間を経過したコロニーは、指数成長期に到達するために液体培地での培養に長期間を要する。 寒天プレート 上の文化サッカロミセスセレビシエ 。 成長した S.セレビシエ コロニーで準備された寒天プレートを使用してください。 ピペット10mLの無菌増殖培地と1mLの20%グルコースを50mLのエルレンマイヤーフラスコに濾過した。 無菌接種ループを有する S.セレビシエ 培養のコロニーを1つ選び、フラスコで成長培地と混合する。 30°Cで50分間、撹拌(150~200rpm)でインキュベートする。 懸濁液培養液を増殖培地で10回希釈し、無菌の広がった棒で寒天プレートに50μLの懸濁液を分散させます。 30°Cで約48時間、1.5〜2mmのコロニーが観察されるまでインキュベートする。 ペトリ皿の端をパラフィルムで包み、乾燥を防ぎます。室温で保存し、最大4週間使用してください。 細胞クラスターでの急落凍結のために サッカロミセスセレビシエ を準備します。 懸濁液中のサッカロミセス・セレビシエの栽培(セクション1.3)のセクションのプロトコルに従ってS.セレビシエ細胞培養を調製し、30°Cで〜7時間を攪拌(150〜200rpm)でインキュベートする。 UV/Vis分光光度計を用いて、600nmで のS.セレビシエ 細胞懸濁液培養液のODを測定する。 細胞懸濁液をOD600 = 1に濃縮する。 細胞単層で凍結する急落のために S.セレビシエ を準備します。 S.セレビシエ細胞培養のセクションでのプロトコルに従ってセレビシエ細胞培養を調製し、攪拌(150〜200rpm)で30°Cで〜7時間をインキュベートする。 UV/Vis分光光度計を用いて、600nmで のS.セレビシエ 細胞懸濁液培養液のODを測定する。 培地中の細胞を遠心管に移し、相対遠心力(900 x g)で2分間軽く回転させます。 ピペット処理により細胞ペレットから培地を廃棄します。 新鮮な培地を細胞ペレットに加えます。30〜60 に等しいOD 600の細胞懸濁液を得るために媒体の体積を計算する。 グリセロール(50%ストック溶液)を細胞懸濁液に加え、ガラス化の直前に5%の最終濃度にします。注:グリセロールは、細胞間の領域内の氷の品質を向上させる保護剤として動作します。グリセロールは、細胞への取り込みが最小限に抑えるために、ガラス化の直前に細胞に添加されます。 2. サッカロミセス・セレビシエ標本のガラス化 カーボンフィルム側を30-45 s(圧力:6-9 Pa、電流:7 mA)に向けてグロー放電TEMグリッド。 ガラス化ロボットを次のパラメータに設定します:温度:18°C、湿度:100%、ブロット時間:6 s、待ち時間:5 s、ブロッティングサイクル:1x、ブロット力:5。注: ブロットフォースは機器固有の値であり、最適なブロット力の値はマシンによって異なる場合があります。特定のプランジャの最適値は、実験的に確認する必要があります。 ガラス化のために液体エタンを準備する。 非吸収性表面パッドを、サンプルに面したブロッティングパッドに取り付けます。他のブロッティングパッドにはフィルター用紙を使用します。 ピンセットでグロー排出グリッドを選び、ピンセットをプランジ冷凍器具に取り付けます。 プランジャ気候室内のグリッドのカーボン側に、3.5 μLの S.cerevisiae 懸濁液を塗布します。グリッド上のすべてのアプリケーションの前に適切に混合します。 液体エタンにグリッドを凍結します。 液体エタンからLN2にグリッドを転送します。ガラス化セルをLN2 の条件で保管するか、TEMグリッドカートリッジに取り付けてFIB-SEM顕微鏡にローディングします。 3. TEM グリッドをグリッドカートリッジに取り付ける 注: ここで説明するワークフローでは、SEM と TEM の顕微鏡間でのサンプル処理と転送を容易にするために、グリッド カートリッジに取り付けられた TEM グリッドを使用します。カートリッジ・アセンブリーは、C リング、TEM グリッド、および C クリップ・リングから構成されます。他の顕微鏡メーカーの計測を行う場合は、他のオプションを使用できます。グリッド・カートリッジ・アセンブリー・ワークステーションは、LN2で満たされます。LN2 レベルは TEM グリッドを備えたグリッド ボックスをカバーしますが、カートリッジへの TEM グリッドの取り付けは LN2 蒸気で行われます。ガラス化手順では、試料への呼吸による汚染を防ぐために、保護フェイスマスクまたはシールドを着用することを強くお勧めします。氷の汚染を蓄積したツールでは動作しません。 グリッドカートリッジアセンブリワークステーションを一緒に入れ、クリッピング用のドライツールを準備します。 LN2でアセンブリ ワークステーションを冷却します。切り取りツールを LN2 の温度まで冷却します。 ガラス化サンプルを含むグリッドボックスをアセンブリワークステーションに配置します。 Cリングに向けて細胞を持つ標本とTEMグリッドを配置し、Cクリップで固定します。 切り取ったカートリッジをグリッドボックスに入れ、適切に閉じます。 LN2 デュワーにカートリッジを保管するか、FIB-SEM 顕微鏡にロードします。 4. FIB-SEM顕微鏡へのサンプルのロードと操作 注:指示はPP3010クライオFIB/SEM準備システムが装備されている二重ビーム顕微鏡Versa 3Dの使用のために書かれた。代替ソリューションでは、異なる特定のパラメータが必要な場合があります。ただし、ワークフローの一般的な概念は、まだ有効である必要があります。 顕微鏡を液体窒素温度まで冷やします。 マイクロスコープチャンバーと準備室(存在する場合)を冷却開始前に高真空(<4 x10-4 Pa)にポンプで送り、汚染の成長を防ぎます。 準備室、顕微鏡ステージ、および顕微鏡用の5 L/minに窒素ガスの流れを設定します。すべてのコンポーネントが-180 °Cの温度<するまで待ちます。注:この研究で使用されるFIB-SEM顕微鏡のセットアップは、その段階および除染剤を冷却するために冷却された窒素ガスを利用する。他のシステムは、ステージ冷却のために別の方法を使用することができます。チャンバー圧力は、ステージとアンチ汚染物質がここで使用される器具の-190°Cで一度〜3 x10-5 Paに達します。この研究で使用した実験設定を用いたラメラ表面上の炭化水素汚染層の成長率は、〜15nm/時間である。 グリッドカートリッジを試料と一緒に顕微鏡に積み込みます。 積載ステーションをLN2 温度まで組み立てて冷却します。 シャトル(サンプルホルダー)、試料付きのグリッドボックス、グリッドボックスオープナー、ピンセットを冷却されたローディングステーションに配置します。 試料を上に向けて慎重に送り込みます。 積み込みステーション内のシャトルをローディング位置に反転させます。 顕微鏡に負荷を入します。 必要に応じて、金属保護層で試料をコーティングします。注:凍結水和された生物材料SEMをイメージングする際に、強い充電効果を観察することができます。さらに、(低電流でも)FIBを用いた生物学的サンプルのイメージングは、速いサンプル損傷を誘発する。したがって、試料の追加コーティングは、試料表面を保護するために、FIB-SEM顕微鏡の内部で行われる可能性があります。 ガス注入システム(GIS)によって有機金属白金で保護層を付着する。 サンプルをユーセント高(電子とイオンでのイメージングの偶然点)に設定します。 ステージを 45°まで傾けます(サンプルは電子ビームに対して 90° 傾けます)。 z 軸のステージを、ユーセントリック高さより 4 mm 下に移動します。 GIS針を26~30°Cに設定します。 有機金属白金層の約300〜1000nmを生物学的標本と共にグリッドに堆積する(GIS堆積物の30〜120 sに相当)。注: 通常、セルの単層を持つサンプルには、小さなセルラー クラスターを持つサンプルに 30 s の GIS を適用します。 スパッタは、導電性金属層で試料表面をコーティングします。 金属層(Ir、Au、Pt)の10nmを生体試料でグリッドに付着させる。 ラメラ調製のための設定顕微鏡のパラメーター FIBの場合、高電圧= 30kV、電流= 10 pA(イメージング)、10 pA-3 nA(FIB-ミリング)のパラメータを使用します。 SEMの場合は、高電圧 = 2~5 kV、スポットサイズ = 4.5、電流 = 8~27 pAのパラメータを使用します。 両方のビームのスキャン回転を 180° に設定します。 ステージの傾きを設定:フライディング角度6-11°(45°のプレチルトとFIB /SEM顕微鏡でサンプルシャトルのステージチルトに対応し、SEMとFIBカラムの間に52°の角度を持つ)。 5. サッカロミセス・セレビシエ・ラメラの調製 グリッドの品質を確認し、 サッカロミセスセレビシエの適切なクラスターを選択します。 TEM グリッドが、セル クラスタの周りまたはグリッドの裏側に水を追加せずに、両側から適切にブロットされていることを確認します。注: グリッドの裏側を確認するには、ステージを -10 度回転させ、FIB でグリッドをイメージします。 次の推奨事項に従って、ラメラ調製に最適なセル クラスターを選択します。 セルのクラスターをグリッド中央に配置します。切削領域は、グリッドの中心に位置する寸法1100 x 1100 μm(グリッド中心から各方向に550 μm)の正方形の外側に広がるべきではありません。 グリッド バーに重なり合うグリッドの中央部にセル のクラスターを配置します。 セルクラスターをグリッドスクエアに配置し、亀裂のないコンパクトな穴のあいたカーボンホイルを使用します。 クラスターが氷の汚染に囲まれていないことを確認します。 サッカロミセス・セレビシエ単層で最適な粉砕位置を選択します。 選択したグリッド四角形のセルの単一レイヤーを囲むグリッド バーが表示されていることを確認します。 以下の推奨事項に従って、セルラー単層内の最適な位置を選択します。切削用に選択した領域は、次の基準を満たす必要があります。 グリッドの中心に関心のある地域を持ちます。切削領域は、グリッド中心に配置された寸法1100 x 1100 μm(グリッドの中心から各方向に550 μm)の正方形の外側に広がるべきではありません。 グリッド バーと重ならないグリッドの中央部分に関心のある領域を配置します。 細胞単層を氷の汚染で囲まないでください。 クライオFIBで S.セレビシエ ラメラを準備します。注: ミリング パターンは、対象領域を基準にして生成され、中央に配置されます。Cryo-FIBMは、異なるFIB設定で複数のミリングステップを実行して順次実行されます。厚さ約2μmのラメラは、最初は高電流(0.3~3 nA)を使用して粉砕されます。その後、ラメラは500nmに徐々に薄くなります。低電流(10-30 pA)での微細加工工程を使用して、ラメラを~100~200 nmの厚さに完成します。 関心領域(ROI)をユーセント高に設定し、この位置を保存します。注: 一致点は、各位置ごとに個別に決定および保存する必要があります。ユーセントリック高さは、ステージを 0°に傾け、ステージを x 方向と y 方向に移動して ROI を中心にして設定します。ステージは25°に傾き、ROIはステージ z軸位置を変更することによってスキャン領域の中心に戻されます。最後に、ステージは、粉砕のために13°-18°に傾いています。 ROI の上に矩形のミリング パターンを定義し、スキャン方向を上から下にします。 下部から上部までのスキャン方向を使用して、ROI の下にある長方形のミリング パターンを定義します。 薄板厚の大まかな推定のために、対象領域をカバーする非アクティブな矩形の粉砕パターンを定義します。このパターンは、ラメラ調製中に粉砕されません。 すべてのパターンをマークし、ラメラ幅(x 次元)を設定します。フライスパターンの幅は、クラスター幅の 2/3 を超えないようにしてください。これは、ほとんどの場合、8~15 μm に相当します。 粗いミリングステップのパラメータを設定する FIB電流: 0.3 –3.0 nA;最終ラメラ厚さ:1.5~2μm。FIBMエリアの幅:8-12 um;ステージチルト:13-17°;所要時間:8分;アクティブなミリングパターン:上下。 FIB電流:0.3-1.0 nA;最終的なラメラの厚さ:1 μm;FIBMエリアの幅:7.5-11.5 μm;ステージチルト:13-17°;所要時間:8分;アクティブなミリングパターン:上下。 FIB電流:100~300 pA;最終ラメラ厚さ:0.5 μm;FIBMエリアの幅:7.5-11.5 μm;ステージチルト:13-17°;所要時間:8分;アクティブなミリングパターン:上下。 FIB電流:30-100 pA;最終ラメラ厚さ:0.3 μm;FIBMエリアの幅:7.5-11.5 μm;ステージチルト:13-17°;所要時間:8分;アクティブなミリングパターン:上下。 細かいミリングステップのパラメータを設定します。 FIB電流:10-30 pA;最終的なラメラ厚さ:<0.2 um;FIBM領域の幅:7-11 μm;ステージチルト:13-17°(+1°);所要時間:12分。アクティブなミリングパターン:上部。注: 粗いミリングステップ(5.3.6)は、各ラメラに対して順番に実行されます。対照的に、微細な製粉工程(5.3.7)は、ラフミリングに直接従いませんが、ラメラ表面の炭化水素汚染を最小限に抑えるために、セッション終了時にすべてのラメラに対して細かい粉砕ステップが順次行われます。余分な +1° ステージの傾斜は、その長さ全体のラメラ厚さの均一性を高めるために、細かい製粉工程中に使用されます。 6. サッカロミセス・セレビシエ・ ラメラのクライオ-TEMへの移送 適切に乾燥したデュワーを準備し、LN2でそれを埋める. 凍結条件下でFIB/SEM顕微鏡からラメラでサンプルをアンロードし、グリッドボックスに移し、LN2 ストレージデュワーに保管して長期保存します。または、グリッドを直接 cryo-TEM にロードします。 クライオ-TEM ステージの傾き軸に対するラメラの正しい向きは重要です(詳細については、8:10 に付随するビデオを参照)。準備されたラメラのフライス方向がクライオ-TEMステージの傾き軸に垂直であることを確認します。 クライオTEMステージを事前に傾けて、グリッド平面に対するラメラチルトを補正し、線量対称方式19を用いてチルトシリーズを収集する。注: プリチルトの大きさ(通常は 6 ~8°)は、マイクロマシニング中の TEM グリッド平面と FIB 方向の間の角度によって決まります。クライオ-TEMのイメージのラメラの前縁の位置は、前傾きの角度の符号を決定するために使用することができる。そのためには、顕微鏡ステージ回転の感覚が知られなければならない。実験では、ナノプローブSAモードで撮影した画像の右側にあるラメラの前縁の位置が負の前傾に相当します。