נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T
Summary
פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג’ ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.
Abstract
מחקרים גנומיים פונקציונליים של המערכת החיסונית דורשים מניפולציות גנטיות הכרוכות הן במחיקת גנים ממוקדים והן בתוספת אלמנטים לחלבונים בעלי עניין. זיהוי פונקציות גנים במודלים של קו התא חשוב לגילוי גנים וחקירה של מנגנונים מהותיים של תאים. עם זאת, מניפולציות גנטיות של תאים חיסוניים כגון תאי T וקווי תאי מקרופאגים באמצעות נוק-אין בתיווך CRISPR/Cas9 קשות בגלל יעילות ההדבקה הנמוכה של תאים אלה, במיוחד במצב של ירידה. כדי לשנות גנים בתאי מערכת החיסון, בחירת עמידות לתרופות וקטורים ויראליים משמשים בדרך כלל להעשרה עבור תאים המבטאים את מערכת CRIPSR/Cas9, אשר בהכרח גורמת להתערבות בלתי רצויה של התאים. במחקר קודם, עיצבנו כתבים פלואורסצנטיים כפולים בשילוב CRISPR / Cas9 שבאו לידי ביטוי ארעי לאחר אלקטרופורציה. פתרון טכני זה מוביל למחיקת גנים מהירה בתאי מערכת החיסון; עם זאת, נוק-אין גנים בתאי מערכת החיסון כגון תאי T ו macrophages ללא שימוש בבחירת התנגדות לסמים או וקטורים ויראליים הוא אפילו יותר מאתגר. במאמר זה, אנו מראים כי באמצעות מיון תאים כדי לסייע בבחירת תאים המבטאים באופן ארעי מבנים CRISPR/Cas9 המתמקדים בלוקוס Rosa26 בשילוב עם פלסמיד תורם, ניתן להשיג נוק-אין גנטי הן בתאי T והן במקרופג’ים ללא העשרה עמידות לסמים. כדוגמה, אנו מראים כיצד לבטא ACE2 אנושי, קולטן של SARS-Cov-2, האחראי על מגיפת Covid-19 הנוכחית, במקרופגים RAW264.7 על ידי ביצוע ניסויים נוק-אין. תאים כאלה נוק-אין גנים ניתן להשתמש נרחב עבור מחקרים מכניים.
Introduction
תאי מערכת החיסון הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים. חסינות מולדת ומסתגלת נדרשים לפינוי זיהומים ותחזוקה של הומאוסטזיסרקמות 1,2. מודלים של קו התאים הם כלים חיוניים להבנת היסודות המולקולריים של מערכת החיסון של היונקים; הם משמשים במבחנה תפקודית בדיקות, כגון אלה מודל הפעלת תאי T אנושי, בקביעת הפונקציה של גורמים גנטיים בהפעלת או שיכוך תגובות חיסוניות3,4. חשוב לציין כי מערכת החיסון של היונקים היא הטרוגנית מאוד, ולא פחות חשוב, מספר עצום של מולקולות לשלוט בידול, הגירה, ותפקוד של תא נתון סוג5,6.
מקובצים באופן קבוע בין-מרחבים קצר פלינדרומי חוזרים (CRISPR)/Cas9 כלי עריכת גנום המאפשרים מניפולציה גנטית של סוגי תאים ספציפיים, המאפשר ביאור תפקודי של גנים בצורה מדויקת7,8. מספר פרוטוקולים שפורסמו תיארו את המסירה של CRISPR/Cas9 בצורה של מתחמי RNA של Cas9-guide המכונים ריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) בתאי HEK293, קווי תאים של Jurkat, תאי T ראשיים9,10, מקרופאגים11,12,13, תאי גזע14, ואחרים15,16. בפרוטוקולים אלה, תיוג גנים מושגת בדרך כלל על ידי היתוך תג פלואורסצנטי לחלבונים אנדוגניים17,18. עם זאת, נעשו ניסיונות מעטים להשתמש בכתבים פלואורסצנטיים כפולים, התואמים למיון תאים בודדים, כדי להקל על ניסויי נוק-אין19,20, במיוחד בתאי מערכת החיסון.
ניתוחים מכניסטיים מעמיקים שמטרתם להבין את תפקודו של גורם גנטי חדשני בתאי החיסון דורשים בדרך כלל מחיקה ספציפית מסוג תאים של גן, ניסויי הצלה גנטיים וזיהוי אידיאלי של האינטראקטיבים שלו. למרות שיטות לאופטימיזציה של מחיקה גנטית של גנים בתאי מערכת החיסוןפורסמו 9,15,21, הרבה פחות שיטות דווחו עבור החדרת אללים knock-in עם פונקציות מגוונות כדי להבין את התגובה החיסונית. לכן, בפרוטוקול זה אנו שואפים לתאר בפירוט פרוטוקול יעיל מאוד לשחזור כדי להביע חלבון של עניין (POI) על locus הנמל הבטוח Rosa26 הן בקווי תאי החיסון האנושיים והן מורין. עיצבנו מערכת כתבים בשני צבעים כדי להעשיר עבור תאים שהודבקו בפלסמידים המבטאים CRISPR/Cas9 (DsRed2) ותבנית דנ”א רקומביננטית (EBFP2), שניתן לבודד על ידי מיון תאים. בעקבות פרוטוקול זה, השגנו שורות נוק-אין מרובות של קו תא T האנושי Jurkat ו מקרופאגים מורין RAW264.7 עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים שנחקרו בצורה גרועה.
כדוגמה, אנו מראים בפרוטוקול זה כיצד להשיג נוק-אין RAW264.7 מקרופאגים מבטאים ביציבות ACE2 אנושי (קולטן של SARS-Cov-2)22. מכיוון שתאי חיסון מולדים מעורבים בפתוגנזה של Covid-1923,24 ו- ACE2 האנושי נחשב לקולטן מרכזי הנדרש לכניסה ויראלית לתאים לפני השכפול, מקרופאגים עם נוק-אין של ACE2 האנושי יכולים לשמש ככלי שימושי למחקרים מכניים של כפל ויראלי בתוך מקרופאגים. במקביל, אנו מציגים גם דוגמה של נוק-אין של גן על locus ROSA26 האנושי להביע את חלבון RASGRP1, אשר הותך במינוח האמינו שלה עם זיקה טווין-סטרפטופט -תג (OST). תאי T הם תאי יעד מרכזיים לטיפולים במערכת החיסון, ומספר גדל והולך של מחקרים התמקדו במניפולציה של התגובה שלהם לסרטן25,26. כמו Rasgrp1 ידוע להיות מולקולת איתות מפתח במורד הזרם של קולטן תא T ואת interactors שלה אינם מנוכרים היטב27, מודל OST-RASGRP1 knock-in מספק את הבסיס לזיהוי אינטראקציות המסדיר את התגובה של תאי T לגידולים וזיהום. יחד, כלים אלה יכולים לשמש למחקרי Covid-19 וגילוי של מולקולות חדשניות אינטראקציה עם Rasgrp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניסויים שלנו, הדגמנו כיצד לבצע עריכה נוק-אין בתאי מערכת החיסון מעיצוב מבנים ועד הקרנת תאים ואימות באמצעות תאי Jurkat T אנושיים ו macrophages RAW264.7 murine כדוגמאות. הן קווי תא T והן קווי תא מקרופאג’ עמידים בפני טרנספקטיון36,37; עם זאת, הבעיה של יעילות נמוכה של משלוח CRISPR / Cas9 נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריית הזרימה של האוניברסיטה הרפואית שינש’יאנג. פיתוח של טכנולוגיה כזו נתמך על ידי מענקי NSFC 81601360 LZ, 81471595 32070898 ל- YL. העבודה נתמכת גם על ידי קרן ועדת החינוך של הנאן מס ‘ 21IRTSTHN030.
Materials
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
References
- Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538 (2018).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2016).
- Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
- Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
- Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
- Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
- Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
- Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69 (2019).
- Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
- Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
- Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
- Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327 (2020).
- Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
- Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539 (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
- Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207 (2021).
- Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
- Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
- Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
- Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
- Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4 (2016).
- Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
- Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102 (2019).
- Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
- Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
- Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
- Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
- Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
- Freen-van Heeren, J. J. -., Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
- Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
- He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196 (2021).
- Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
- Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
- Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
