CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

免疫細胞は病原体に対する防御に不可欠です。感染者のクリアランスと組織恒常性^{の維持のために}は、自然免疫と適応免疫の両方が必要です^1,2.細胞株モデルは、哺乳類の免疫系の分子基礎を理解するための不可欠なツールです。それらは、ヒトT細胞活性化をモデル化するもののようなインビトロ機能アッセイにおいて用いられ、免疫応答を活性化または減衰させる遺伝的要因の機能を決定する^{際に3、4。}哺乳類の免疫系は非常に異質であり、同様に重要な、膨大な数の分子が、所定の細胞型^5、6の分化、移動、および機能を制御することに注意することが重要である。

クラスター化された定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9ゲノム編集ツールは、特定の細胞タイプの遺伝子操作を可能にし、遺伝子の機能的注釈を正確な方法^7,8に容易にする。いくつかの公表されたプロトコルは、HEK293細胞におけるリボヌクレオタンパク質(RnPs)として知られているCas9ガイドRNA複合体の形態でCRISPR/Cas9の送達を説明している、ジュルカット細胞株、原発性T細胞^9、10、マクロファージ11、12、13、幹細胞^14、および他の^15、16。これらのプロトコルにおいて、遺伝子タグ付けは、通常、内因性タンパク質^17,18に蛍光タグを融合させることによって達成^される。しかし、単一細胞選別に対応する二重蛍光レポーターを用いて、特に免疫細胞におけるノックイン実験^19,20を容易にする試みがなされている。

免疫細胞における新しい遺伝的因子の機能を理解することを目的とした詳細な機械分析は、一般的に遺伝子の細胞型特異的な欠失、遺伝子救助実験、および理想的には、そのインターアクターの同定を必要とする。免疫細胞の遺伝子の遺伝的欠失の最適化方法は^9、15、21に公表されているが^、免疫応答を理解するために多目的な機能を持つノックイン対立遺伝子を導入する方法ははるかに少ない報告を受けている。したがって、このプロトコルでは、ヒトおよびマウスの両方の免疫細胞株において、目的のタンパク質(POI)を安全な港のLocus Rosa26で発現させる効率的で再現性の高いプロトコルを詳細に記述することを目指しています。CRISPR/Cas9(DsRed2)を発現するプラスミドを導入した細胞に対して、細胞選別で分離できる組換えDNAテンプレート(EBFP2)を用いて濃縮する2色レポーターシステムを設計しました。このプロトコルに従って、我々は、研究が不十分なタンパク質の機能解析のためにヒトT細胞株JurkatとマウスマクロファージRAW264.7の複数のノックインラインを得た。

一例として、このプロトコルでは、ヒトACE2(SARS-Cov-2の^{受容体)を}安定的に発現するマクロファージRAW264.7マクロファージを安定的に得る方法を本プロトコルで示す。自然免疫細胞は、Covid-19^{23、24および}ヒトACE2の病因に関与しているため、複製前に細胞へのウイルス侵入に必要な主要な受容体とみなされるため、ヒトACE2のノックインを伴うマクロファージは、マクロファージ内のウイルス増殖の機械化研究に有用なツールとして役立つ。また、ヒトROSA26遺伝子のノックイン例を、アミノ末でアフィニティツインストレップタグ(OST)と融合したRASGRP1タンパク質を発現させる例も紹介しています。T細胞は免疫療法における主要な標的細胞であり、癌^25,26に対する応答性の操作に焦点を当てた研究が増えている。Rasgrp1はT細胞受容体の下流にある重要なシグナル伝達分子であることが知られており、そのインターアクターは²⁷を十分に解明されていないので、OST-RASGRP1ノックインモデルは、T細胞の腫瘍および感染に対する応答を調節する界発体を同定するための基盤を提供する。これらのツールを組み合わせることで、Covid-19の研究やRasgrp1と相互作用する新しい分子の発見に使用できます。