Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T
Summary
Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.
Abstract
Los estudios de genómica funcional del sistema inmune requieren manipulaciones genéticas que impliquen tanto la eliminación de genes diana como la adición de elementos a proteínas de interés. La identificación de las funciones génicas en modelos de líneas celulares es importante para el descubrimiento de genes y la exploración de los mecanismos intrínsecos de las células. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de células inmunes como las células T y las líneas celulares de macrófagos utilizando knock-in mediado por CRISPR / Cas9 son difíciles debido a la baja eficiencia de transfección de estas células, especialmente en un estado de reposo. Para modificar los genes en las células inmunes, la selección de resistencia a los medicamentos y los vectores virales se utilizan típicamente para enriquecer a las células que expresan el sistema CRIPSR / Cas9, lo que inevitablemente resulta en una intervención indeseable de las células. En un estudio anterior, diseñamos reporteros fluorescentes duales acoplados a CRISPR / Cas9 que se expresaron transitoriamente después de la electroporación. Esta solución técnica conduce a la rápida deleción de genes en las células inmunes; sin embargo, la eliminación de genes en células inmunes como las células T y los macrófagos sin el uso de la selección de resistencia a los medicamentos o vectores virales es aún más desafiante. En este artículo, mostramos que mediante el uso de la clasificación celular para ayudar a la selección de células que expresan transitoriamente construcciones CRISPR / Cas9 dirigidas al locus Rosa26 en combinación con un plásmido donante, se puede lograr un knock-in de genes tanto en células T como en macrófagos sin enriquecimiento de resistencia a los medicamentos. Como ejemplo, mostramos cómo expresar ACE2 humano, un receptor del SARS-Cov-2, que es responsable de la actual pandemia de Covid-19, en macrófagos RAW264.7 mediante la realización de experimentos en cadena. Tales células de knock-in de genes pueden ser ampliamente utilizadas para estudios mecanicistas.
Introduction
Las células inmunes son críticas para la defensa contra los patógenos. Tanto la inmunidad innata como la adaptativa son necesarias para el aclaramiento de los infecciosos y el mantenimiento de la homeostasis tisular1,2. Los modelos de líneas celulares son herramientas esenciales para comprender los fundamentos moleculares del sistema inmune de los mamíferos; se utilizan en ensayos funcionales in vitro, como los que modelan la activación de células T humanas, y en la determinación de la función de los factores genéticos en la activación o amortiguación de las respuestas inmunes3,4. Es importante tener en cuenta que el sistema inmune de los mamíferos es enormemente heterogéneo y, lo que es igualmente importante, un gran número de moléculas controlan la diferenciación, la migración y la función de una célula determinada de tipo5,6.
Las herramientas de edición del genoma Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 permiten la manipulación genética de tipos celulares específicos, lo que facilita la anotación funcional de genes de manera precisa7,8. Varios protocolos publicados han descrito la entrega de CRISPR/Cas9 en forma de complejos de ARN guía Cas9 conocidos como ribonucleoproteínas (RNPs) en células HEK293, líneas celulares Jurkat, células T primarias9,10,macrófagos11,12,13,células madre14,y otras15,16. En estos protocolos, el etiquetado genético se suele conseguir fusionando una etiqueta fluorescente con proteínas endógenas17,18. Sin embargo, se han hecho pocos intentos de utilizar reporteros fluorescentes duales, que son compatibles con la clasificación de una sola célula, para facilitar los experimentos de knock-in19,20, particularmente en células inmunes.
Los análisis mecanicistas en profundidad destinados a comprender las funciones de un nuevo factor genético en las células inmunes generalmente requieren la eliminación específica del tipo celular de un gen, experimentos de rescate genético e idealmente la identificación de sus interactores. A pesar de que se han publicado métodos para la optimización de la deleción genética de genes en células inmunes9,15,21,se han reportado muchos menos métodos para introducir alelos en cadena con funciones versátiles para comprender la respuesta inmune. Por lo tanto, en este protocolo pretendemos describir en detalle un protocolo eficiente y altamente reproducible para expresar una proteína de interés (POI) en el locus de puerto seguro Rosa26 en líneas celulares inmunes humanas y murinas. Diseñamos un sistema reportero de dos colores para enriquecer las células transfectadas con plásmidos que expresan CRISPR/Cas9 (DsRed2) y una plantilla de ADN recombinante (EBFP2), que se puede aislar mediante clasificación celular. Siguiendo este protocolo, obtuvimos múltiples líneas knock-in de la línea de células T humanas Jurkat y el macrófago murino RAW264.7 para análisis funcionales de proteínas poco estudiadas.
A modo de ejemplo, mostramos en este protocolo cómo obtener macrófagos RAW264.7 que expresan de forma estable ace2 humana (un receptor del SARS-Cov-2)22. Debido a que las células inmunes innatas están involucradas en la patogénesis deCovid-19 23,24 y la ACE2 humana se considera un receptor importante requerido para la entrada viral en las células antes de la replicación, los macrófagos con knock-in de ACE2 humano pueden servir como una herramienta útil para estudios mecanicistas de multiplicación viral dentro de los macrófagos. Paralelamente, también presentamos un ejemplo de knock-in de un gen en el locus humano ROSA26 para expresar la proteína RASGRP1, que se fusionó en su extremo amino con una afinidad Twin-Strep-tag (OST). Las células T son células diana clave en las terapias inmunitarias, y un número creciente de estudios se han centrado en la manipulación de su capacidad de respuesta al cáncer25,26. Como se sabe que Rasgrp1 es una molécula de señalización clave aguas abajo del receptor de células T y sus interactores no están bien dilucidados27, el modelo de knock-in OST-RASGRP1 proporciona la base para identificar interactores que regulan la respuesta de las células T a los tumores y la infección. En conjunto, estas herramientas se pueden utilizar para estudios de Covid-19 y el descubrimiento de nuevas moléculas que interactúan con Rasgrp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestros experimentos, demostramos cómo realizar la edición en cadena en células inmunes desde el diseño de la construcción hasta la detección y validación de células en cadena utilizando células T Jurkat humanas y macrófagos murinos RAW264.7 como ejemplos. Tanto las líneas celulares de células T como las de macrófagos son resistentes a la transfección36,37; sin embargo, el problema de la baja eficiencia de la entrega de CRISPR / Cas9 se puede su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la instalación central de citometría de flujo de la Universidad Médica de Xinxiang. El desarrollo de dicha tecnología ha sido apoyado por las subvenciones de NSFC 81601360 a LZ, 81471595 y 32070898 a YL. El trabajo también cuenta con el apoyo del Comité Educativo de la Fundación de Henan No. 21IRTSTHN030.
Materials
| Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
| Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
| Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
| BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
| Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
| E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
| FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
| GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
| Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
| Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
| LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
| Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
| Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
| Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
| Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
| Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
| RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
| Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
| RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
| Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
| 1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
| 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
| 96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |
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