Toepassing van DNA-vingerafdrukken met behulp van de D1S80 Locus in labklassen

OPMERKING: Dit protocol mag alleen worden gebruikt als studenten of respectieve wettelijke voogden akkoord zijn gegaan met de geleiding van dit protocol, omdat genotypische profielen inzicht geven in genetische relaties. DNA-vingerafdrukken zijn een veelgebruikte moleculaire biologiemethode die voornamelijk wordt toegepast op bevolkingsonderzoek en forensische zaken. Daarom moet aandacht worden besteed aan het zo laag mogelijk houden van besmettingsrisico’s. Om besmetting van het monster met DNA van een externe bron of DNases te voorkomen, moeten handschoenen worden gedragen, moeten instrumenten grondig worden gereinigd of gesteriliseerd en moeten oplossingen vóór gebruik worden gefilterd of geautoclaveerd. 1. Oogsten van buccale slijmvliesepitheelcellen LET OP: Werken met speeksel en epitheelcellen kan leiden tot een overdracht van infectieziekten. Daarom moeten standaard- en transmissiegebaseerde voorzorgsmaatregelen worden toegepast (bijv. het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen). OPMERKING: Neem een positieve controle op, die wordt geleverd door de instructeur (bijv. DNA geëxtraheerd door de instructeur) en is opgenomen in de downstreamverwerkingsstappen. Wacht ten minste 1 uur na het eten of tandenpoetsen voordat u de monsters opeet. Etiket een lege en steriele microcentrifugebuis van 2,0 ml. Verwijder een steriel buccaal wattenstaafje uit de verpakking en wrijf krachtig op de binnenkant van de wang gedurende 30-40 keer of 30-40 seconden om buccale slijmvliesepitheelcellen te oogsten. Plaats de punt van het opvangdoekje in de eerder gelabelde steriele microcentrifugebuis en breek de lengte van het plastic af dat zich uitstrekt tot voorbij de rand, met de hand of met een steriele schaar. Plaats de dop stevig op de buis en sluit het opvangdoekje af. 2. Extractie van genomisch DNA uit menselijke cellen Stel vóór de extractie een thermische mixer of een verwarmingsblok in op 65 °C voor monsterlyse.LET OP: Sommige gebruikte chemicaliën zijn geclassificeerd als gevaarlijk. Lees het veiligheidsinformatieblad zorgvuldig door en neem passende veiligheidsmaatregelen voordat u het behandelt. Bereid en steriliseer door alle benodigde buffers en oplossingen te filteren of te autoclaafen (lysisoplossing, 8 M kaliumacetaat, 2-propanol, 70% ethanol en elutiebuffer).OPMERKING: Alle centrifugeerstappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-30 °C), tenzij anders aangegeven. Voeg 500 μL lysisoplossing (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA); 2% natriumdodecylsulfaat (SDS)) toe aan het buccale wattenstaafje en zorg ervoor dat het monster volledig in de lysisoplossing is ondergedompeld. Vortex krachtig gedurende ten minste 5 s. Incubeer monsters bij 65 °C in een thermische mixer gedurende 10 minuten. Meng het monster 3-4 keer door pulskolken gedurende 5 s tijdens incubatie. Verwijder het wattenstaafje uit de lysisbuffer, druk het wattenstaafje tegen de binnenkant van de buis om een maximaal monstervolume te verkrijgen. Voeg 100 μL 8 M kaliumacetaat toe aan de cellen. Meng grondig door de buis om te keren tot er een wit neerslag is. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 18.000 x g. Breng 450 μL van het supernatant over in een schone en steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 450 μL 2-propanol toe en meng grondig door de buis om te keren (neerslag van het DNA). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g. Gooi het supernatant weg en keer de buis om op een schone papieren handdoek om de pellet te drogen en kruisbesmetting te voorkomen. Incubeer het DNA gedurende 5 minuten bij 65 °C in een verwarmingsblok om de pellet volledig te drogen. Voeg 500 μL 70% ethanol toe om het DNA te wassen. Centrifugeer gedurende 1 min op 18.000 x g. Gooi het supernatant weg en keer de tube om op een schone papieren handdoek om de pellet te drogen. Voeg 30 μL resuspensiebuffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) toe aan de pellet. Incubeer het DNA gedurende 10 minuten bij 65 °C in een verwarmingsblok om DNases te inactiveren. 3. Versterking van de D1S80 VNTR locus met behulp van PCR OPMERKING: Noteer het aantal monsters dat zal worden gebruikt en bereid een werkblad voor met de vereiste reagentia en hun volumes voordat u de benodigde kunststoffen en andere materialen verzamelt. Etiketteer de steriele buizen/strips/platen die voor de PCR moeten worden gebruikt met monsternummers. Vergeet niet om een negatieve controle op te nemen met H2O in plaats van DNA en een positieve controle (bijvoorbeeld met behulp van het DNA dat door de instructeur wordt verstrekt) om de PCR te valideren. Bereid de 1x PCR mastermix voor die 10 μL 5x PCR-reactiebuffer bevat (met 15 mM MgCl2),1 μL deoxyribonucleotidetrifosfaat (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) van elke primer pMCT118-f en pMCT118-r (voorwaarts – 5′-GAAC reverse – 5′-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3′) volgens Kasai et al.2, 23,8 μL ultrapure H2O en 0,2 μL Taq DNA-polymerase (5 U/μL).OPMERKING: De primers pMCT118-f/pMCT118-r zijn ontworpen op de flankerende gebieden van de D1S80 VNTR-regio die de hele locus versterken. Etiketteer de PCR-buizen/strips/plaat met de te gebruiken monsternummers. Aliquot 45 μL van de hoofdmix aan elke gelabelde PCR-monsterbuis of put. Voeg 5 μL van de DNA-sjabloon toe aan de mastermix in elke PCR-buis/-plaatput om een totaal volume van 50 μL te verkrijgen. Verander de pipettip voor elk DNA-monster om kruisbesmetting te voorkomen. Voeg een NTC (No Template Control) toe met ultrapure H2O in plaats van DNA. Sluit PCR buizen/strips of afdichtingsplaat en meng. Centrifugeer de PCR-buizen/strips/platen gedurende 20 s met behulp van een tafelcentrifuge.OPMERKING: De PCR-omstandigheden in dit protocol zijn geoptimaliseerd met behulp van het GEBRUIKTE DNA-polymerase en de PCR-thermische cycler. Over het algemeen moeten pcr-omstandigheden worden aangepast aan het DNA-polymerase. De standaard verlengingstijd voor een Taq DNA polymerase is 1 min/kb. Plaats de monsterbuizen/strips/plaat in de thermocycler en incubeer de reacties onder de volgende omstandigheden (verlengingstijd van DNA-polymerase): 1 cyclus van 95 °C gedurende 2 minuten; 25 cycli van 94 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C voor 30 s; 1 cyclus van 72 °C gedurende 10 min. Wanneer het programma is voltooid, verwijdert u de producten uit de thermocycler en bewaart u ze ‘s nachts bij 4 °C of -20 °C tot elektroforese. 4. Agarose gel elektroforese van PCR producten Bereid een 1,5% agarose gel. Gebruik 1,5 g agarosepoeder en meng het met 100 ml 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) bufferoplossing in een kolf. Verwarm het mengsel ongeveer 1,5-2 min in een magnetron (600 W). Wervel de inhoud en verwarm opnieuw, indien nodig, om de agarose volledig op te lossen. Koel iets af en voeg 2 μL PeqGreen toe aan de agarose. Giet de gel in een vorm met behulp van een kam met voldoende putten voor alle monsters en voeg ten minste één moleculaire gewichtsmarker toe.LET OP: Kookvertraging kan optreden. Schud de kolf voorzichtig bij het opnieuw insuspenden van de agarose die nog niet is opgelost.OPMERKING: PeqGreen is een niet-toxische kleurstof voor de detectie van nucleïnezuren. Het is van toepassing op het kleuren van dubbelstrengs DNA (dsDNA) en enkelstrengs DNA (ssDNA) en RNA. De gevoeligheid is vergelijkbaar met ethidiumbromide. Verwijder de PCR-producten van 4 °C en centrifugeer gedurende ongeveer 10 s. Beleed de putten van de gel met een monster van 10 μL. Overbelast de gel niet.OPMERKING: De DNA-polymerasebuffer bevat ook verbindingen die de monsterdichtheid verhogen, zodat monsters rechtstreeks op gels kunnen worden geladen zonder dat een ladingskleurstof nodig is. Hierdoor kan het monster in de put zinken en helpen kleurstoffen om bij te houden hoe ver het DNA-monster is gemigreerd. Voeg een moleculaire gewichtsnorm toe aan de flankerende putten (bij voorkeur een 50 bp moleculaire gewichtsnorm).OPMERKING: Bewaar de resterende PCR-monsters bij -20 °C voor het geval de elektroforese van de agarosegel moet worden herhaald. Laat de gel in 1x TAE lopende buffer op 150 V (constant) gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de onderste gele kleurstof voorkant die reist op ongeveer 50 bp bereikt het onderste uiteinde van de gel. Beeld de gel terwijl blauw licht of ultraviolet (UV) licht wordt toegepast en neem een afbeelding op voor fragmentlengteanalyse.LET OP: UV-licht kan uw ogen en huid beschadigen. Draag altijd beschermende kleding en een UV-veiligheidsbril bij gebruik van een UV-lichtbak. Gooi de gel weg in overeenstemming met het institutionele beleid inzake gevaarlijke stoffen. 5. Analyse van fragmentlengteresultaten OPMERKING: Gebruik lineaire regressieanalyse om de lengtes van de fragmenten te schatten. Voor het dimensioneren van de D1S80 PCR-fragmenten plaatst u een liniaal op de gelfoto over de standaardbaan van 50 bp moleculair gewicht, zodat de bovenkant van de liniaal in lijn ligt met de onderkant van de put waarin het monster is geladen (figuur 1).OPMERKING: Om de lineaire regressievergelijking voor de moleculaire gewichtsnorm (50 bp moleculaire gewichtsnorm) te berekenen, werd een spreadsheetprogramma gebruikt. Noteer de afstand tot de put (bijv. in cm) voor elke band van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm in een tabel met behulp van een spreadsheetprogramma (Figuur 2). Bepaal het logboek (bijv. basis 10) van elke fragmentgrootte van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm en voer de logwaarden in de tabel in (figuur 2). Plot elk gegevenspunt naar een grafiek met het logboek van de bandgrootten op de verticale as (y-as) en de gemeten runafstand van de bovenkant van de gel tot elke band van de moleculaire gewichtsnorm op de horizontale as (x-as) met behulp van een scatterplot (Figuur 3). Plaats een trendlijn (lineaire regressielijn) en toon de regressievergelijking (y = ax + b) en de R2-waarde in de grafiek (figuur 4). Meet de gemigreerde afstand (bijv. in cm) voor elke D1S80-amplicon (figuur 5). Schat de grootte van elke D1S80 amplicon met behulp van de regressievergelijking: y = ax + bwaarbij y = het logboek van de fragmentgroottea = de helling van de lijn (berekend in punt 5)x = de afstand tot de put (in cm)b = het punt waar de regressielijn de y-as onderschept (berekend in punt 5)OPMERKING: Aangezien de y-waarde het logboek van de fragmentgrootte vertegenwoordigt, moet de antilog (10y) worden berekend om de fragmentgrootte in bp van de D1S80-amplicons te verkrijgen. 6. Schatting van het aantal herhalingseenheden in de allelen van de geteste personen OPMERKING: De D1S80 repeat unit is 16 bp lang. Het kleinste bekende allel voor D1S80 heeft 14 herhalingen. Het hier beschreven ampliconschema produceert amplicons met flankerende regio’s die een extra 145 bp toevoegen aan de uiteindelijke grootte. Gebruik tabel 1 om te schatten hoeveel herhalingseenheden zich in elk PCR-fragment bevinden. De grootte die wordt geëxtrapoleerd met behulp van de lineaire regressie moet binnen 8 bp van een bepaald allel liggen. Registreer het genotype van elk getest individu als een combinatie van allele repeat size numbers.