Применение ДНК-дактилоскопии с использованием локуса D1S80 в лабораторных классах

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен использоваться только в том случае, если студенты или соответствующие законные опекуны согласились на проведение этого протокола, поскольку генотипические профили дают представление о генетических отношениях. ДНК-дактилоскопия является распространенным методом молекулярной биологии, в основном применяемым к популяционные исследованиям и судебно-медицинским вопросам. Поэтому следует уделять внимание тому, чтобы риски загрязнения были как можно ниже. Чтобы избежать загрязнения образца ДНК из внешнего источника или ДНКаз, следует надеть перчатки, инструменты должны быть тщательно очищены или стерилизованы, а растворы должны быть стерилизованы фильтром или автоклавированы перед использованием. 1. Сбор эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки ВНИМАНИЕ: Работа со слюной и эпителиальными клетками может привести к передаче инфекционных заболеваний. Поэтому следует применять стандартные и основанные на передаче меры предосторожности (например, использование соответствующих средств индивидуальной защиты). ПРИМЕЧАНИЕ: Включите положительный контроль, который обеспечивается инструктором (например, ДНК, извлеченная инструктором) и включается в последующие этапы обработки. Подождите не менее 1 ч после еды или чистки зубов перед сбором образцов. Наклейте этикетку на пустую и стерильную микроцентрифужную трубку 2,0 мл. Извлеките один стерильный щечный тампон из упаковки и энергично втирайте внутрь щеки в течение 30-40 раз или 30-40 секунд для сбора эпителиальных клеток слизистой оболочки щеки. Поместите наконечник тампона для сбора в ранее маркированную стерильную микроцентрифужную трубку и отломите длину пластика, которая выходит за пределы края, либо вручную, либо с помощью стерильных ножниц. Надежно поместите колпачок на трубку, запечатав тампон для сбора. 2. Извлечение геномной ДНК из клеток человека Перед экстракцией установите термомикшер или нагревательный блок на 65 °C для лизиса образца.ВНИМАНИЕ: Некоторые используемые химические вещества классифицируются как опасные. Внимательно прочитайте паспорт безопасности и примите соответствующие меры безопасности перед обработкой. Готовят и стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования все необходимые буферы и растворы (раствор лизиса, 8 М ацетата калия, 2-пропанол, 70% этанол и буфер элюирования).ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования должны выполняться при комнатной температуре (20-30 °C), если это не указано иное. Добавьте 500 мкл раствора лизиса (50 мМ Tris/HCl, рН 8,0; 10 мМ этилендиамина тетрааусной кислоты (ЭДТА); 2% додецилсульфата натрия (SDS)) в буккальный тампон, убедившись, что образец полностью погружен в раствор лизиса. Вихрь энергично в течение не менее 5 с. Инкубировать образцы при 65 °C в термомешале в течение 10 мин. Перемешайте образец 3-4 раза импульсно-вихрево в течение 5 с во время инкубации. Извлеките тампон из буфера лизиса, прижмите тампон к внутренней части пробирки, чтобы получить максимальный объем образца. Добавьте 100 мкл 8 М ацетата калия в лизированные клетки. Тщательно перемешайте, перевертив трубку, пока не появится белый осадок. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифугировать образец в течение 5 мин при 18 000 х г. Перенесите 450 мкл супернатанта в чистую и стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл. Добавьте 450 мкл 2-пропанола и тщательно перемешайте, инвертив трубку (осаждение ДНК). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга в течение 5 мин при 18 000 х г. Выбросьте супернатант и перевертите трубку на чистом бумажном полотенце, чтобы высушить гранулу и избежать перекрестного загрязнения. Инкубируйте ДНК в течение 5 мин при 65 °C в нагревательном блоке, чтобы полностью высушить гранулу. Чтобы промыть ДНК, добавьте 500 мкл 70% этанола. Центрифуга в течение 1 мин при 18 000 х г. Выбросьте супернатант и перевертите трубку на чистом бумажном полотенце, чтобы высушить гранулу. Добавьте к грануле 30 мкл буфера ресуспенсии (10 мМ Tris/HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА). Инкубируют ДНК в течение 10 мин при 65 °C в нагревательном блоке для инактивации ДНКаз. 3. Амплификовка локуса VNTR D1S80 с помощью ПЦР ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите количество образцов, которые будут использоваться, и подготовьте рабочий лист с необходимыми реагентами и их объемами перед сбором необходимых пластмасс и других материалов. Маркировка стерильных пробирок/полосок/пластин, которые будут использоваться для ПЦР, номерами образцов. Не забудьте включить отрицательный контроль с использованиемH2O вместо ДНК и положительный контроль (например, с использованием ДНК, предоставленной инструктором) для проверки ПЦР. Готовят 1x ПЦР мастер-микс, содержащий 10 мкл 5x реакционного буфера ПЦР (содержащего 15 мМMgCl2),1 мкл дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTPs) (10 мМ), 5 мкл (10 пмоль) каждого праймера pMCT118-f и pMCT118-r (вперед – 5′-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCCG-3′, реверс – 5′-GTCTTGGGGGGGGATGCACGTGCCCCCCGC-3′) согласно Kasai et al.2,23,8 мкл сверхчистогоH2O и 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq (5 U/μL).ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки pMCT118-f/pMCT118-r были спроектированы на фланговых областях области D1S80 VNTR, усиливая весь локус. Маркировка пробирок/полосок/пластин ПЦР с номерами образцов, которые будут использоваться. Aliquot 45 мкл мастер-микса на каждую маркированную ПЦР пробои или колодец. Добавьте 5 мкл шаблона ДНК в мастер-микс в каждой ПЦР-трубке/пластинчатой скважине, чтобы получить общий объем 50 мкл. Измените наконечник пипетки для каждого образца ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Включите элемент управления без шаблона (NTC), используя сверхчистый H2O вместо ДНК. Закройте ПЦР-трубки/полоски или уплотнителивую пластину и перемешайте. Центрифугировать ПЦР-трубки/полоски/пластины в течение 20 с помощью настольной центрифуги.ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ПЦР, приведенные в этом протоколе, были оптимизированы с использованием ДНК-полимеразы и термического циклизатора ПЦР. В целом, условия ПЦР должны быть адаптированы к ДНК-полимеразе. Стандартное время расширения для ДНК-полимеразы Taq составляет 1 мин/кб. Поместите пробирки/полоски/пластины в термоциклер и инкубируют реакции с использованием следующих условий (время растяжения ДНК-полимеразы): 1 цикл 95 °C в течение 2 мин; 25 циклов при 94 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 30 с; 1 цикл 72 °C в течение 10 мин. Когда программа будет завершена, извлеките продукты из термоциклера и храните при 4 °C в течение ночи или -20 °C до электрофореза. 4. Агарозовый гель электрофорез продуктов ПЦР Приготовьте 1,5% агарозный гель. Используйте 1,5 г порошка агарозы и смешайте его со 100 мл 1x буферного раствора Tris-acetate-EDTA (TAE) в колбе. Нагревайте смесь около 1,5-2 мин в микроволновой печи (600 Вт). Закрутите содержимое и снова нагрейте, при необходимости, чтобы полностью растворить агарозу. Слегка остудить и добавить 2 мкл ПекГрина к агарозе. Налейте гель в форму с помощью гребня с достаточным количеством колодцев для всех образцов и добавьте хотя бы один маркер молекулярной массы.ВНИМАНИЕ: Может возникнуть задержка кипения. Тщательно встряхните колбу при повторном сусении агарозы, которая еще не растворена.ПРИМЕЧАНИЕ: PeqGreen является нетоксичным красителем для обнаружения нуклеиновых кислот. Он применим для окрашивания двухцепочечной ДНК (dsDNA) и одноцепочечной ДНК (ssDNA), а также РНК. Чувствительность сравнима с бромидом этидия. Удалите продукты ПЦР с 4 °C и центрифугу в течение примерно 10 с. Загрузите в колодцы геля пробу 10 мкл. Не перегружайте гель.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ДНК-полимеразы также включает соединения, которые увеличивают плотность образца, так что образцы могут быть загружены непосредственно на гели без необходимости в нагрузочном красителе. Это позволяет образцу погружаться в колодец, а красители помогают отслеживать, как далеко мигрировал образец ДНК. Добавьте стандарт молекулярной массы к фланковым скважинам (предпочтительно стандарт молекулярной массы 50 bp).ПРИМЕЧАНИЕ: Храните остаточные образцы ПЦР при -20 °C в случае, если электрофорез агарозного геля необходимо повторить. Запускайте гель в 1x TAE, работающем буфере при 150 В (постоянное) в течение примерно 40 минут или до тех пор, пока нижняя желтая передняя часть красителя, которая движется со скоростью около 50 bp, не достигнет нижнего конца геля. Визульсируйте гель при нанесении синего или ультрафиолетового (УФ) света и запишите изображение для анализа длины фрагмента.ВНИМАНИЕ: ультрафиолетовый свет может повредить ваши глаза и кожу. Всегда носите защитную одежду и защитные очки УФ-излучения при использовании УФ-светового короба. Утилизируйте гель в соответствии с институциональной политикой в отношении опасных материалов. 5. Анализ результатов длины фрагмента ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте линейный регрессионный анализ для оценки длины фрагментов. Для оцифровки фрагментов ПЦР D1S80 поместите линейку на фотографию геля над стандартной полосой молекулярной массы 50 bp таким образом, чтобы верхняя часть линейки выровнялась с нижней частью скважины, в которую был загружен образец(рисунок 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета уравнения линейной регрессии для стандарта молекулярной массы (стандарт молекулярной массы 50 бп) использовалась программа электронных таблиц. Запишите расстояние от скважины (например, в см) для каждой полосы стандарта молекулярной массы 50 бп в таблице с помощью программы электронных таблиц(рисунок 2). Определите логарифм (например, основание 10) каждого размера фрагмента стандарта молекулярной массы 50 bp и введите значения журнала в таблицу(рисунок 2). Наведите каждую точку данных на график с логарифмом размеров полосы по вертикальной оси (оси Y) и измеренным расстоянием пробега от верхней части геля до каждой полосы стандарта молекулярной массы по горизонтальной оси (оси X) с помощью диаграммы рассеяния(рисунок 3). Подогнать линию тренда (линию линейной регрессии) и показать уравнение регрессии (y = ax + b) и значение R2 на графике(рисунок 4). Измерьте расстояние миграции (например, в см) для каждого ампликона D1S80 (рисунок 5). Оцените размер каждого ампликона D1S80 с помощью уравнения регрессии: y = ax + bгде y = журнал размера фрагментаa = наклон линии (вычисляется в точке 5)x = расстояние от скважины (в см)b = точка, в которой линия регрессии перехватывает ось Y (вычисляется в точке 5)ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку значение y представляет собой логарифм размера фрагмента, антилог (10y)должен быть рассчитан для получения размера фрагмента в bp ампликонов D1S80. 6. Оценка количества повторяющихся единиц в аллелях имитируемых лиц ПРИМЕЧАНИЕ: Длина блока повтора D1S80 составляет 16 бит/с. Самый маленький известный аллель для D1S80 имеет 14 повторов. Описанная здесь схема ампликона производит ампликоны с фланговыми областями, складывающими дополнительные 145 bp к конечному размеру. Используйте таблицу 1, чтобы оценить, сколько повторяющихся единиц содержится в каждом фрагменте ПЦР. Размер, экстраполированный с помощью линейной регрессии, должен быть в пределах 8 bp от любого конкретного аллеля. Запишите генотип каждой иституемой особи в виде комбинации чисел размера аллеля.