تطبيق بصمات الحمض النووي باستخدام الموضع D1S80 في فصول المختبر
Summary
هنا نصف بروتوكول بسيط لتوليد ملامح بصمات الحمض النووي عن طريق تضخيم موقع VNTR D1S80 من الحمض النووي للخلية الظهارية.
Abstract
في العلوم البيولوجية، تم استخدام بصمات الحمض النووي على نطاق واسع لاختبار الأبوة، وتطبيقات الطب الشرعي والدراسات النباتية. هنا، ونحن نصف طريقة موثوقة وقوية للأفراد genotyping حسب العدد المتغير من تكرار الترادف (VNTR) تحليل في سياق الفصول المختبرية الجامعية. يستخدم الموضع D1S80 VNTR البشري في هذا البروتوكول كعلامة متعددة الأشكال للغاية استنادا إلى الاختلاف في عدد التسلسلات المتكررة.
ينقل هذا البروتوكول البسيط معلومات مفيدة للمعلمين وتنفيذ بصمات الحمض النووي في الفصول المختبرية العملية. في التمرين المختبري المقدم ، يتم استخدام استخراج الحمض النووي يليه تضخيم PCR لتحديد الاختلاف الجيني في مكان D1S80 VNTR. الاختلافات في حجم جزء من منتجات PCR تصورها أجاروز هلام الكهربائي. يتم حساب أحجام الأجزاء والأرقام المتكررة استنادا إلى انحدار خطي لحجم ومسافة الترحيل لمعيار حجم الحمض النووي.
باتباع هذا الدليل، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:
• حصاد واستخراج الحمض النووي من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي
• إجراء تجربة PCR وفهم وظيفة مكونات رد الفعل المختلفة
• تحليل amplicons بواسطة أجاروز هلام الكهربائي وتفسير النتائج
• فهم استخدام VNTRs في أخذ بصمات الحمض النووي وتطبيقه في العلوم البيولوجية
Introduction
تم تقديم بصمات الأصابع الجزيئية ، التي يشار إليها أيضا باسم بصمات الحمض النووي ، من قبل السير أليك جيفريز أثناء عمله في قسم علم الوراثة في جامعة ليستر في عام 19841. وهو يستند إلى 0.1٪ من الجينوم البشري الذي يختلف بين الأفراد ويتكون من حوالي ثلاثة ملايين متغير. هذه الاختلافات الفريدة في النمط الجيني تسمح بالتمايز بين الأفراد وبالتالي يمكن أن تعمل كبصمات وراثية باستثناء التوائم أحادية الزيجوت. وبالتالي، يستخدم أخذ بصمات الحمض النووي لتقدير صلة مختلف الأفراد التي تطبق على سبيل المثال في اختبار الأبوة أو في دراسات التنوع السكاني. في فصول المختبر لدينا كنا نهدف إلى نقل مفهوم بصمات الحمض النووي وترددات أليل. الطريقة الموصوفة هنا توضح طريقة موثوقة وقوية لأخذ البصمات الجينية من خلال تحليل العدد المتغير للتكرارات الترادفية (VNTR) في موقع D1S80. تتضمن الطريقة استخراج الحمض النووي من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي والبوليميراز اللاحقة سلسلة التفاعل (PCR) لتضخيم الموضع D1S80 ، تليها تصور الاختلافات طول جزء على هلام agarose.
إن موضع الساتل الصغير D1S80 VNTR متغير للغاية ويقع في منطقة التيلومريك من الكروموسوم 1 (1p36-p35). تم تحديده ووصفه من قبل Karsai وزملاء العمل في عام 1990 كمقع مع وحدة تكرار أساسية من 16 نقطة أساس ، مما يسمح بفصل الأليل تختلف بوحدة واحدة فقط2. وعلاوة على ذلك، D1S80 يظهر درجة عالية من الاختلاف مع معدل طفرة من حوالي 7.77 × 10-5 3. D1S80 لديه درجة عالية من heterozygosity4،5 (على سبيل المثال ، 80.8 ٪ heterozygosity للقوقازيين6 وحتى 87 ٪ heterozygosity للأميركيين الأفارقة7). بالإضافة إلى ذلك، فإن الموضع D1S80 متعدد الأشكال في معظم السكان، وعادة ما يكون أكثر من 15 أليل مختلف يحمل 14 إلى 41 يكرر كل منهما. يختلف تردد أليلات D1S80 بين السكان. أليل مع 24 وحدة مكررة (أليل 24) هو الأكثر شيوعا في السكان الأوروبيين والآسيويين، في حين أليل 21 هو الأكثر شيوعا في السكان الأفارقة4،7،8،9،10. وبالتالي، فإن توزيعات تردد الأليل تشخيصية لمختلف المجموعات البشرية ويجب أن تؤخذ في الاعتبار لتقدير الصلة (على سبيل المثال، في اختبارات الأبوة).
PCR التضخيم القائم على D1S80 VNTR كان مكانا طريقة مفيدة جدا في علم الطب الشرعي، واختبارات الأبوة، وتحليل الأمراض ودراسات التنوع السكاني11،12،13،14. بينما في الطب الشرعي اليوم تم استبدال استخدام VNTRs بتكرارات قصيرة جنبا إلى جنب ، يستخدم على نطاق واسع مكان D1S80 VNTR في تحديد الأصول والعلاقات الجينية بين السكان4و8و9و11. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما يستخدم لتعليم بصمات الحمض النووي في فصول مختبر عملي15،16. تمثل الطريقة الموصوفة هنا طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام مع معدل نجاح مرتفع جدا في الفصول المختبرية الجامعية. الغرض من هذه المقالة هو تقديم لمحة عامة عن سير العمل للتحليل الجزيئي للجراد القمر الصناعي الصغير D1S80 الإنسان من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي. وهو يتضمن عرض توضيحي للتقنيات والبروتوكولات المبسطة والاقتراحات العملية الموصوفة في الأعمال المنشورة سابقا2،17.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتنفيذ بصمات الجزيئية في الفصول العملية الجامعية.
للكشف عن الاختلاف الجيني في موقع D1S80 ، مطلوب جمع عينات بيولوجية بشرية إلى جانب استخراج الحمض النووي وتحليله. ومن الضروري ضمان الاستخدام الأخلاقي للعينات البيولوجية البشرية طوال العملية برمتها. ويتم التحكم في إدارة العينات ضمن إطار تنظيمي شامل يضمن الاستخدام الصحيح للعينات والبيانات المرتبطة بها18 (مثل الموافقة على استخدام المواد البيولوجية البشرية). ويجب أن يكون المشاركون على علم مناسب باستخدام عيناتهم، وخطر اكتشاف حالات شاذة في العلاقات الجينية (على سبيل المثال، بالنسبة للأفراد ذوي الصلة)، وحماية الخصوصية، والنوايا لتخزين العينات والبيانات البيولوجية في المستقبل. يجب على جميع المتبرعين (الطلاب أو الزملاء) إعطاء الموافقة بحرية وفهم الحق في الانسحاب دون إبداء سبب. بشكل عام ، لا غنى عن جعل نفسه على دراية بالمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة بإدارة العينات البشرية قبل إجراء هذا الصف المختبري.
لجمع الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي في الدورات المختبرية الجامعية، يجب توخي الحذر لتجنب تلوث عينات الحمض النووي مع الحمض النووي من المشغل أو مع DNases. من المستحسن أن تستخدم دائما المعاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية وكذلك مسحات معقمة وأنابيب الطرد الدقيق. ويعتبر حصاد الخلايا القائمة على المسحة البخل طريقة مريحة وفعالة من حيث التكلفة لجمع المواد الوراثية المناسبة لتحليل VNTR القائم على PCR ، لأنها غير مكلفة نسبيا وغير قابلة للانفسار. بجانب مسحات البوكال ، اللعاب هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ العينات عن طريق الفم للأبحاث الطبية. وقد تبين أن مسحات buccal تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا الظهارية من اللعاب، مما يجعلها أكثر موثوقية في توفير كمية كافية ونوعية الحمض النووي لتحليل D1S80 VNTR المستندة إلى PCR19،20. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرسال مسحات buccal بالبريد بعد الجمع الذاتي للتغلب على العوائق الجغرافية عند استخدامها ، على سبيل المثال ، في دراسات التنوع السكاني21.
أصبح استخراج الحمض النووي من السهل نسبيا بسبب تطوير مجموعات استخراج من شركات مختلفة. ومع ذلك، قد لا يكون استخدام هذه الأطقم مناسبا في الفصول المختبرية بسبب محدودية الموارد المالية. هنا، قدمنا طريقة سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من العينات البشرية دون الحاجة إلى مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا. لا تستخدم طريقة استخراج الحمض النووي الموصوفة المذيبات العضوية ، وبدلا من ذلك تتم إزالة البروتينات الخلوية عن طريق زيادة تركيز الملح باستخدام محلول خلات البوتاسيوم 8 M. كما تسمح هذه الطريقة بالتعامل مع عدة عينات في وقت واحد وتسفر عن حمض نووي كاف لعدة تحليلات للنمط الجيني لكل عينة.
PCR هو تقنية شائعة في العديد من المختبرات الجزيئية. في حين عموما خالية من المتاعب، وهناك المزالق التي قد تعقد رد الفعل مما أدى إلى نتائج زائفة، والتي نوقشت في أماكن أخرى22. وقد بدت ظروف PCR المعروضة هنا قوية جدا في مواجهة ضعف جودة الحمض النووي القالب، ولكن لوحظ مع ذلك عدم تضخيم PCR في بعض الأحيان عند استخدام قوالب مع تركيزات الحمض النووي منخفضة للغاية بسبب ضعف حصاد الخلايا الظهارية buccal. يمكن طلب مستلزمات الحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة من شركات مختلفة، مثل تلك المذكورة في جدول المواد في نهاية هذه الورقة. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند العمل مع مبرزات الحمض النووي من أجل تجنب التلوث بالناس أو الحمض النووي من المشغل. وينبغي أيضا أن تبقى منتجات PCR الباردة عندما لا تكون قيد الاستخدام.
خطوة حاسمة أخرى هي إلكتروفورسيس هلام الآغاروز. قد لا يتم فصل الشظايا التي تختلف بوحدة تكرار واحدة فقط من 16 نقطة أساس في الكهروفورسيس الهلامي وبالتالي تظهر كفرقة واحدة. في هذه الحالة، لا يمكن التأكد من تحديد عدد الوحدات المتكررة من أليلات D1S80 التي تم اختبارها بشكل صحيح. لذلك ، يجب زيادة وقت تشغيل الجل في حين يجب تقليل الجهد ويمكن زيادة تركيز الجل لتوفير دقة أفضل وفصل العصابات الفردية.
ومن الجدير بالذكر أن ليس كل الأليل لVNTR الموضع تحتوي على وحدات تكرار كاملة. الأليل غير التوافقي (المتغيرات الدقيقة) التي تحتوي على وحدات تكرار غير مكتملة شائعة في معظم VNTR loci وأحجامها تقع بين أحجام الأليل مع وحدات تكرار كاملة. هذه المتغيرات الدقيقة بالكاد يمكن اكتشافها عن طريق إلكتروفورسيس هلام الآغوروز. في المقابل، تقنيات مثل المواد الهلامية البولي أكريلاميد أو الكهربائي الشعري يمكن حل الأليل التي تختلف من واحد إلى عدد قليل من تكرار وحدات أو المتغيرات الدقيقة12،23،24،25،26. ومع ذلك ، فإن التقنيات الأخيرة هي أقل ملاءمة لفصول المختبرات الجامعية لأنها تحتوي على العديد من العيوب بما في ذلك استخدام المركبات الخطرة والإعداد المعقد ونقص المعدات. لتحديد حجم الشظايا، يجب توخي الحذر عند قياس المسافة بين شظايا الحمض النووي المهاجرة. إذا كانت النطاقات منتشرة جدا بحيث لا يمكن قياسها بدقة، فإن حساب حجم جزء أليل D1S80 بالتراجع الخطي قد يكون غير صحيح مما يؤدي إلى التقدير الخاطئ لأرقام الوحدات المتكررة. في هذه الحالة إعادة تشغيل إلكتروفورسيس هلام agarose بعد تحسين الظروف هلام من المستحسن كما وصفها سابقا من قبل لورينز وزملاء العمل22.
يمكن الانتهاء من إجراء تحليل D1S80 VNTR بأكمله المعروض هنا ، من حصاد الخلايا الظهارية الظهارية إلى تقييم طول الشظايا ، في يوم عمل واحد. هذا البروتوكول هو وسيلة قوية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام ومناسبة لفصول المختبرات العملية الجامعية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا كيفن غراهام على صوته وجميع المشاركين الذين تبرعوا بعينات لهذا العمل.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable ‘minisatellite’ regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference – An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. &. #. 2. 1. 4. ;. Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D– phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a “DNA Fingerprint.”. The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3’hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3’end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -. H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 ‘-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
