Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

1. Создание проекта в Scipion и импорт данных Откройте Scipion и нажмите Create Project, укажите имя проекта и место, где он будет сохранен (дополнительный рисунок 1). Scipion откроет окно проекта, показывая холст с левой стороны панелью со списком доступных методов, каждый из которых представляет собой один инструмент обработки изображений, который можно использовать для управления данными.ПРИМЕЧАНИЕ: Ctrl+F можно использовать для поиска метода, если он не отображается в списке. Для импорта фильмов, снятых микроскопом, выберите pwem – импорт фильмов на левой панели (или введите его при нажатии Ctrl+F). Откроется новое окно (дополнительный рисунок 2). Там включите путь к данным и параметры сбора. В этом примере используйте следующую настройку: напряжение микроскопа 300 кВ, сферическая аберрация 2,0 мм, амплитудная контрастность 0,1, скорость увеличения 50000, режим частоты дискретизации в от изображения и размер пикселя 1,34 Å. Когда все параметры в форме будут заполнены, нажмите на кнопку Выполнить .ПРИМЕЧАНИЕ: При запуске метода на холсте появляется поле желтого цвета с пометкой «выполняется». Когда метод завершается, поле становится зеленым, а метка — готовой. В случае ошибки во время выполнения метода, поле появится красным цветом, помеченное как failed. В этом случае проверьте нижнюю часть холста, на вкладке Журнал вывода появится объяснение ошибки. Когда метод завершится, проверьте результаты в нижней части холста на вкладке Сводка . Здесь представлены выходы, сгенерированные методом, в данном случае набор фильмов. Нажмите на кнопку «Анализировать результаты », и появится новое окно со списком фильмов. 2. Выравнивание фильмов: от фильмов до микрофотографий Используйте метод xmipp3 – оптическое выравнивание , которое реализует Optical flow19. Используйте следующие параметры для заполнения формы (дополнительный рисунок 3): Input Movies — это те, которые получены на шаге 1, диапазон в Frames to ALIGN — от 2 до 13, остальные параметры остаются со значениями по умолчанию. Выполните программу.ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, выделенные жирным шрифтом в форме, должны быть всегда заполнены. Остальные будут иметь значение по умолчанию или не будут обязательными. В верхней части окна формы можно найти поля, в которых распределены вычислительные ресурсы, как потоки, MPI или графические процессоры. Нажмите на Analyze Results (Анализировать результаты ), чтобы проверить полученные микроснимки и траекторию предполагаемых сдвигов (рисунок 1). Для каждой увиденной микроснимки: посмотрите на спектральную плотность мощности (PSD), полученные траектории для выравнивания фильма (одна точка на кадр) в декартовых и полярных координатах, а также название файла полученной микрофотографии (нажав на нее, микрофотографию можно осмотреть). Обратите внимание, что частицы образца гораздо более заметны на микрофотографии, по сравнению с одним кадром фильма. 3. Оценка CTF: расчет аберраций микроскопа Для начала воспользуйтесь методом григорьеффлаба – ctffind15. Настройка такова: входные микроснимки являются выходом шага 2, коэффициент понижения разрешения CTF вручную установлен на 1,5, а диапазон разрешения варьируется от 0,06 до 0,42. Кроме того, в разделе Дополнительные параметры (которые можно найти, выбрав этот вариант в Экспертном уровне формы) установите размер окна равным 256. Остальные параметры остаются со значениями по умолчанию (дополнительный рисунок 4).ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве методов в Scipion опция Advanced показывает больше параметров конфигурации. Используйте эти опции осторожно, когда программа для запуска полностью известна и смысл параметров понятен. Некоторые параметры может быть трудно заполнить, не взглянув на данные; в этом случае Scipion показывает волшебную палочку с правой стороны, которая покажет окно мастера (дополнительный рисунок 5). Например, в поле Разрешение такая форма особенно полезна, так как эти значения следует выбирать, чтобы приблизительно охватить область от первого нуля до последнего заметного кольца PSD. Нажмите На Execute и на Analyze Results (Рисунок 2), когда метод закончится. Убедитесь, что расчетный CTF совпадает с экспериментальным. С этой целью посмотрите на PSD и сравните оценочные кольца в углу с теми, которые исходят из данных. Также проверьте полученные значения расфокусировки, чтобы найти какие-либо неожиданные значения, и соответствующие микроснимки могут быть отброшены или пересчитаны. В этом примере может быть использован весь набор микроснимков.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кнопки в нижней части окна, чтобы сделать подмножество микрофотографий (с красной кнопкой Micrographs ) и пересчитать CTF (с красной кнопкой Пересчитать CTF ), в случае необходимости. Для уточнения предыдущей оценки используйте xmipp3 – ctf estimation20. Выберите в качестве входных микроснимков вывод шага 2, выберите опцию Использовать defoci из предыдущей оценки CTF, так как предыдущая оценка CTF выберет выход grigoriefflab – ctffind, и, в расширенном уровне, измените размер окна на 256 (дополнительный рисунок 6). Запустите его. Нажмите « Анализировать результаты», чтобы проверить полученные CTF. С помощью этого метода больше данных оценивается и представляется в некоторых дополнительных столбцах. Поскольку ни один из них не показывает неправильных оценочных значений, все микроснимки будут использоваться на следующих этапах. 4. Отбор частиц: поиск частиц на микроснимках Перед началом сбора проведите предварительную обработку микрофотографий. Откройте xmipp3 – препроцессируйте микрофотографии, установите в качестве входных микроснимков те, которые получены на шаге 2 и выберите опции Удалить плохие пиксели? с кратным Stddev до 5 и Downsample микрофотографий? с коэффициентом даунсамплинга 2 (Дополнительный рисунок 7). Нажмите «Выполнить» и проверьте, что размер полученных микроснимков был уменьшен. Для комплектации используйте xmipp3 – ручной подбор (шаг 1) и xmipp3 – автоподбор (шаг 2)21. Ручная комплектация позволяет вручную подготовить набор частиц, с помощью которых на этапе автоподбора будет изучен и сгенерирован полный набор частиц. Во-первых, запустите xmipp3 – ручной отбор (шаг 1) с input Micrographs в качестве микроснимков, полученных в предыдущем препроцессе. Нажмите на Execute , и появится новое интерактивное окно (рисунок 3). В этом окне представлен список микроснимков (рисунок 3a) и другие опции. Измените размер (px) на 150, это будет размер коробки, содержащей каждую частицу. Выбранная микрофотография появится в большом окне. Выберите область и все видимые частицы в ней (рисунок 3b). Затем нажмите Активировать обучение , чтобы начать обучение. Остальные области микрофотографии выбираются автоматически (рисунок 3c). Проверьте выбранные частицы и включите больше, нажав на него, или удалите неправильные с помощью shift + clicking, если это необходимо. Выберите следующую микрофотографию в первом окне. Микрофотография будет выбрана автоматически. Проверьте еще раз, чтобы включить или удалить некоторые частицы, если это необходимо. Повторите этот шаг примерно с 5 микроснимками, чтобы создать репрезентативный тренировочный набор. Как только это будет сделано, нажмите на Координаты в главном окне, чтобы сохранить координаты всех выбранных частиц. Обучающий набор частиц готов к автоподбору, чтобы завершить процесс для всех микроснимков. Открыть xmipp3 – автоподбор (шаг 2), указывающий в Xmipp на подбор частиц запустить предыдущую ручную комплектацию, а микрофотографии выбрать как То же самое, что контролируется. Нажмите кнопку Выполнить. Этот метод сгенерирует в качестве выходных данных набор из около 100000 координат. Применяйте консенсусный подход, поэтому проведите второй метод отбора, чтобы выбрать частицы, в которых согласны оба метода. Откройте sphire – cryolo picking14 и выберите предварительно обработанные микроснимки в качестве входных микрофотографий, используйте общую модель? до Да, с порогом достоверности 0,3 и размером коробки 150 (дополнительный рисунок 8). Запустите его. Этот метод должен генерировать также около 100000 координат. Запуск xmipp3 – глубокий консенсусный выбор22. В качестве входных координат включают вывод sphire – криоло комплектация (шаг 4.7) и xmipp3 – автоподбор (шаг 4.6), установите для параметра Выбрать тип модели значение Pretrained, а также Пропустить обучение и забить непосредственно с предварительно обученной моделью? Да (дополнительный рисунок 9). Запустите его. Нажмите «Анализировать результаты» и в новом окне на значке глаза рядом с пунктом «Выбрать частицы/координаты с высокими значениями «zScoreDeepLearning1». Откроется новое окно со списком всех частиц (рисунок 4). Значения zScore в столбце дают представление о качестве частицы, низкие значения означают плохое качество. Нажмите на метку_xmipp_zScoreDeepLearning чтобы упорядочить частицы от самого высокого к самому низкому zScore. Выберите частицы с zScore выше 0,75 и нажмите « Координаты», чтобы создать новое подмножество. Это должно создать подмножество с приблизительно 50000 координат. Open xmipp3 – очиститель глубокой микрофотографии. Выберите в качестве Входные координаты подмножество, полученное на предыдущем шаге, Источник микрофотографий такой же, как координаты, и сохраните Пороговое значение 0,75. Запустите его. Проверьте на вкладке Сводка , что количество координат было уменьшено, хотя в этом случае удаляется только несколько координат.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг способен дополнительно очистить набор координат и может быть очень полезен при очистке других наборов данных с большим количеством артефактов фильма в виде углеродных зон или больших примесей. Run xmipp3 – извлечение частиц (Дополнительный рисунок 10). Укажите в качестве входных координат координаты, полученные после предыдущего шага, Источник микрофотографий как другие, Входные микроснимки как выход шага 2, Оценку CTF как выход оценки xmipp3 – ctf, Коэффициент понижения дискретизации до 3 и Размер коробки частиц до 100. На вкладке Предварительная обработка формы выберите Да всем. Запустите его. Убедитесь, что выходные данные должны содержать частицы уменьшенного размера 100×100 пикселей и размера пикселя 4.02Å/px. Запустите снова xmipp3 – извлеките частицы , изменив следующие параметры: коэффициент понижения дискретизации до 1, а размер коробки частиц до 300. Убедитесь, что на выходе находится тот же набор частиц, но теперь в полном разрешении. 5. 2D классификация: группировка похожих частиц вместе Откройте метод cryosparc2 – 2d классификации11 с Input частицами, полученными на шаге 4.11 и, во вкладке 2D Классификация, Число классов до 128, сохраните все остальные параметры со значениями по умолчанию. Запустите его. Нажмите На Analyze Results (Анализировать результаты ), а затем на значке глаза рядом с пунктом Display class particle with Scipion (рисунок 5). Такая классификация поможет очистить множество частиц, так как несколько классов будут казаться шумными или с артефактами. Выберите классы, содержащие хорошие представления. Нажмите на Частицы (красная кнопка в нижней части окна), чтобы создать подмножество очистителей. Теперь откройте xmipp3 – cl2d23 и установите в качестве Входные изображения изображения, полученные на предыдущем шаге и Количество классов как 128. Нажмите кнопку Выполнить.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вторая классификация используется в качестве дополнительной стадии очистки набора частиц. Обычно полезно удалить как можно больше шумных частиц. Однако, если требуется более простой рабочий процесс, можно использовать только один метод 2D-классификации. Когда метод закончится, проверьте 128 сгенерированных классов, щелкнув Анализ результатов и Что показывать: классы. Большинство сгенерированных классов показывают проекцию макромолекулы с некоторым уровнем детализации. Однако некоторые из них выглядят шумными (в этом примере примерно 10 классов). Выберите все хорошие классы и нажмите кнопку Классы, чтобы создать новое подмножество только с хорошими. Это подмножество будет использоваться в качестве входных данных для одного из методов для создания начального тома. С теми же выбранными классами нажмите на Частицы, чтобы создать более чистое подмножество после удаления тех, которые принадлежат к плохим классам. Open pwem – подмножество с полным набором элементов в качестве выхода 4.13 (все частицы в полном размере), Make random subset to No, Other set как подмножество частиц, созданных на предыдущем шаге, и Set operation as intersection. Это позволит извлечь предыдущее подмножество из частиц с полным разрешением. 6. Первоначальная оценка объема: построение первого угадывания 3D-объема На этом этапе оцените два начальных тома с помощью различных методов, а затем используйте инструмент консенсуса для создания окончательного расчетного 3D-объема. Open xmipp3 – реконструируйте метод significant24 с классами Input, полученными после шага 5, группа Symmetry как c1, и сохраните оставшиеся параметры со значениями по умолчанию (дополнительный рисунок 11). Выполните его. Нажмите «Анализировать результаты». Убедитесь, что получен объем низкого разрешения размером 100x100x100 пикселей и размер пикселя 4.02Å/px. Open xmipp3 – обрезка/изменение размера томов (дополнительный рисунок 12), используя в качестве входных томов тот, который был получен на предыдущем шаге, Изменить размер томов? на Да, Изменить размер параметра на частоту дискретизации и Изменить частоту дискретизации до 1,34 Å/px. Запустите его. Проверьте на вкладке Сводка , что выходной том имеет правильный размер. Теперь создайте второй начальный том. Открытый релион – 3D начальная модель10, так как входные частицы используют хорошие частицы с полным разрешением (выход 5,5) и устанавливают диаметр маски частиц на 402Å, сохраняют остальные параметры со значениями по умолчанию. Запустите его. Нажмите «Анализировать результаты», а затем в разделе Отображаемый том с: фрагментами. Убедитесь, что получен объем с низким разрешением, но с основной формой структуры (Дополнительный рисунок 13). Теперь откройте pwem – объединить наборы , чтобы объединить два сгенерированных начальных тома для создания входных данных для метода консенсуса. Просто укажите Volumes в качестве типа Input и выберите два начальных тома в наборе Input. Запустите его. Выходные данные должны представлять собой набор, содержащий два элемента с обоими томами. Инструмент консенсуса включен в xmipp3 – swarm consensus25. Откройте. Используйте в качестве полноразмерных изображений хорошие частицы в полном разрешении (выход 5,5), так как начальные объемы множества с двумя элементами, сгенерированными на предыдущем шаге, и убедитесь, что группа симметрии равна c1. Нажмите кнопку Выполнить. Нажмите «Анализировать результаты». Убедитесь, что получен более подробный выходной объем (рисунок 6). Хотя вокруг структуры больше шума, наличие более подробной информации на карте структуры поможет следующим шагам уточнения, чтобы избежать локальных минимумов.ПРИМЕЧАНИЕ: Если UCSF Chimera26 доступен, используйте последнюю иконку в верхней части окна, чтобы сделать 3D визуализацию полученного объема. Откройте и выполните relion – 3D auto-refine10, чтобы сделать первое 3D угловое назначение частиц. Выберите в качестве входных частиц выход 5,5 и установите диаметр маски частиц равным 402Å. На вкладке Эталонная 3D-карта выберите в качестве Входного объема тот, который был получен на предыдущем шаге, Симметрия как c1 и Начальный фильтр нижних частот до 30Å (Дополнительный рисунок 14). Нажмите «Анализировать результаты». В новом окне выберите final как Volume для визуализации и нажмите на Display volume with: slices, чтобы увидеть полученный объем. Проверьте также корреляцию оболочки Фурье (FSC), щелкнув Графики разрешения дисплея в окне результатов и угловое покрытие в Display angular distribution: 2D plot (Рисунок 7). Реконструированный объем содержит гораздо больше деталей (вероятно, с некоторыми размытыми областями во внешней части структуры), а FSC пересекает порог 0,143 около 4,5Å. Угловое покрытие охватывает всю 3D-сферу. 7.3D классификация: обнаружение конформационных состояний Используя консенсусный подход, если в данных есть разные конформационные состояния, можно обнаружить. Открытый релион – 3D классификация10 (Дополнительный рисунок 15). В качестве входных частиц используют только что полученные в 6,10, и устанавливают диаметр маски частиц на 402Å. На вкладке Эталонная 3D-карта используйте в качестве входного объема тот, который получен после шага 6.10, установите для параметра Симметрия значение c1, а для начального фильтра нижних частот значение 15Å. Наконец, на вкладке Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 3. Запустите его. Проверьте результаты, нажав на Анализ результатов, выберите Показать классификацию в Scipion. Показаны три сгенерированных класса и некоторые интересные меры. Первые два класса должны иметь одинаковое количество назначенных изображений (столбец размера ) и выглядеть очень похожими, в то время как третий имеет меньше изображений и более размытый внешний вид. Кроме того, rlnAccuracyRotations и rlnAccuracyTranslations должны быть явно лучше для первых двух классов. Выберите два лучших класса и нажмите кнопку Классы, чтобы создать подмножество, содержащее их. Повторите шаги 7.1 и 7.2, чтобы создать вторую группу хороших классов. И то, и другое будет вкладом в инструмент консенсуса. Откройте и запустите xmipp3 – консенсусные классы 3D и выберите в качестве входных классов два подмножества, сгенерированные на предыдущих шагах. Нажмите «Анализировать результаты». Представлено число совпадающих частиц между классами: первое значение — это число совпадающих частиц в первом классе подмножества 1 и первом классе подмножества 2, второе значение — количество совпадающих частиц в первом классе подмножества 1 и втором классе подмножества 2 и т. д. Убедитесь, что частицы случайным образом распределены по классам один или два, что означает, что метод 3D-классификации не способен найти конформационные изменения. Учитывая этот результат, весь набор частиц будет использоваться для продолжения обработки. 8.3D уточнение: уточнение угловых назначений однородной популяции Опять же, примените консенсусный подход на этом этапе. Во-первых, откройте и запустите pwem – подмножество с полным набором элементов на выходе 6.9, Make random subset to Yes, и Number of elements to 5000. При этом создается подмножество изображений с предыдущим выравниванием для обучения методу, используемому на следующем шаге. Open xmipp3 – глубокое выравнивание, установите Входные изображения как выход хороших частиц, полученных в 5.5, Объем как полученный после 6.10, Входное обучение, как созданное на предыдущем шаге, Целевое разрешение на 10Å, и сохраните остальные параметры со значениями по умолчанию (Дополнительный рисунок 16). Нажмите кнопку Выполнить. Нажмите на Analyze Results (Анализировать результаты), чтобы проверить полученное угловое распределение, где нет пропущенных направлений, а угловое покрытие немного улучшается по сравнению с 6.10 (рисунок 8). Откройте и выполните xmipp3 – сравните углы и выберите в качестве Входные частицы 1 выход 6.9 и Входные частицы 2 выход 8.2, убедитесь, что группа Симметрия c1. Этот метод вычисляет соглашение между xmipp3 – глубокое выравнивание и relion – 3D автоочистка. Нажмите на Анализ результатов, отображается список частиц, с полученными различиями в сдвигах и углах. Нажмите на иконку панели в верхней части окна, откроется другое окно, позволяющее сделать графики вычисляемых переменных. Выберите _xmipp_angleDiff и нажмите «График», чтобы увидеть представление угловых различий на частицу. Проделайте то же самое с _xmipp_shiftDiff. На этих рисунках примерно в половине частиц оба метода сходятся (рисунок 9). Выберите частицы с угловыми разностями ниже 10º и создайте новое подмножество. Теперь откройте xmipp3 – highres27, чтобы произвести локальную доработку заданных углов. Во-первых, выберите в качестве Полноразмерные изображения изображения, полученные на предыдущем шаге, и в качестве Начальных объемов вывод 6,9, установите Радиус частицы на 150 пикселей и группу Симметрия как c1. На вкладке Угловое назначение задайте для параметров Выравнивание изображения значение Локальный, Для числа итераций значение 1 и Для параметров Макс. Целевое разрешение 5Å/px (дополнительный рисунок 17). Запустите его. На вкладке Сводка убедитесь, что выходной объем меньше 300x300x300 пикселей и имеет немного больший размер пикселя. Нажмите « Анализировать результаты», чтобы увидеть полученные результаты. Нажмите на Графики разрешения дисплея, чтобы увидеть FSC, и на Дисплей тома: Реконструировано , чтобы увидеть полученный том (Дополнительный рисунок 18). Получается хороший объем разрешения, близкий к 4-3,5А. Нажмите на Дисплей выходных частиц и в окне со списком частиц нажмите на значок панели. В новом окне выберите Ввести как гистограмму со 100 корзинами, выберите метку _xmipp_cost и, наконец, нажмите Plot (Дополнительный рисунок 19). Таким образом, представляется гистограмма метки затрат , которая содержит корреляцию частицы с выбранным для нее направлением проекции. В этом случае получается функция унимодальной плотности, которая является признаком отсутствия разных популяций в множестве частиц. Таким образом, все они будут использованы для продолжения доработки.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае просмотра мультимодальной функции плотности, следует выбрать набор частиц, принадлежащих к более высокому максимуму, чтобы продолжить рабочий процесс только с ними. Открыть и выполнить снова xmipp3 – высокие разрешения с Продолжить из предыдущего запуска? Значение Да, установите в качестве Полноразмерные изображения , полученные после версии 8.5, и выберите предыдущий запуск с предыдущим выполнением Xmipp Highres. На вкладке Угловое назначение установите для параметра Выравнивание изображения значение Локальное с 1 итерацией и 2,6Å/px в качестве целевого разрешения (полное разрешение). Теперь вывод должен содержать объем в полном разрешении (размер 300x300x300 пикселей). Нажмите « Анализировать результаты», чтобы еще раз проверить полученный объем и FSC, который теперь должен быть объемом с высоким разрешением около 3Å (рисунок 10). 9. Оценка и постобработка Открыть xmipp3 – локальный MonoRes28. Этот метод вычисляет разрешение локально. Установите в качестве Входного тома тот, который получен после 8.10, установите Вы хотите использовать половинные тома? на Да, и Диапазон разрешения от 1 до 10Å. Запустите его. Нажмите «Анализировать результаты» и выберите «Показать гистограмму разрешения» и «Показать цветные фрагменты» (рисунок 11). Показано разрешение в разных частях тома. Большинство вокселей центральной части структуры должны представлять разрешения около 3Å, в то время как худшие разрешения достигаются во внешних частях. Также показана гистограмма разрешений на воксель с пиком около (даже ниже) 3Å. Откройте и запустите xmipp3 – локальную заточку29 для применения заточки. Выберите в качестве Входной карты тот, который получен в 8.10, и в качестве Карты разрешения, полученный на предыдущем шаге с MonoRes. Нажмите на Анализ результатов , чтобы проверить полученные тома. Откройте последнюю, соответствующую последней итерации алгоритма. Рекомендуется открывать том с помощью других инструментов, таких как UCSF Chimera26, чтобы лучше увидеть особенности тома в 3D (рисунок 12). Наконец, откройте инструмент проверки, включенный в xmipp3 – validate overfitting30, который покажет, как меняется разрешение с количеством частиц. Откройте его и включите в качестве входных частиц частицы, полученные на шаге 8.5, установите Расчет шума, связанного с разрешением? Да, с начальным 3D эталонным объемом в качестве выхода 8.10. В дополнительных параметрах установите для параметра Число частиц значение “500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000” (Дополнительный рисунок 20). Запустите его. Нажмите на Анализ результатов. Два графика появятся (рисунок 13) с эволюцией разрешения, в зеленой линии, по мере роста количества частиц, используемых в реконструкции. Красная линия представляет разрешение, достигнутое с помощью реконструкции выровненного гауссовского шума. Разрешение улучшается с количеством частиц и наблюдается большая разница реконструкции из частиц по сравнению с таковой из шума, что является показателем наличия частиц с хорошей структурной информацией. Из предыдущих результатов можно было бы провести подгонку модели в переобработанном объеме, что позволило бы обнаружить биологические структуры макромолекулы.