クリオEMとシピオンによる単粒子分析

1. Scipionでプロジェクトを作成し、データをインポートする Scipionを開き、[ プロジェクトの作成] をクリックし、プロジェクトの名前と保存場所を指定します (図 1 を補足)。Scipionは、キャンバスを示すプロジェクトウィンドウを開き、左側に使用可能なメソッドのリストを持つパネルが表示され、それぞれがデータの管理に使用できる1つの画像処理ツールを表します。注: Ctrl+F を使用すると、リストに表示されないメソッドを検索できます。 顕微鏡で撮影したムービーをインポートするには、左側のパネルで 映画をインポート する (または Ctrl+F を押すと、それを入力) を選択します。 新しいウィンドウが開きます (補足図 2)。そこに、データへのパスと取得パラメータを含めます。この例では、 マイクロスコープ電圧 300kV、 球面収差 2.0mm、 振幅コントラスト 0.1、 倍 率50000、 サンプリングレートモード から From画像、 ピクセルサイズ 1.34Åの設定を使用します。フォーム内のすべてのパラメータが入力されたら、[ 実行 ]ボタンをクリックします。注: メソッドが開始されると、キャンバスに黄色の黄色で「 実行中」と表示されたボックスが表示されます。メソッドが終了すると、ボックスが緑に変わり、ラベルが [完了] に変わります。メソッドの実行中にエラーが発生した場合、ボックスは赤で表示され、 失敗と表示されます。その場合は、キャンバスの下部を確認し、[ 出力ログ ]タブにエラーの説明が表示されます。 メソッドが終了したら、[ 概要] タブでキャンバスの下部で結果を確認します。ここでは、メソッドによって生成された出力が表示され、この場合は、一連のムービーが表示されます。[ 結果の分析 ] ボタンをクリックすると、ムービーのリストが新しいウィンドウに表示されます。 2.映画のアライメント:映画から顕微鏡写真へ オプティカルフロー19を実装する方法xmipp3 – 光学アライメントを使用してください。次のパラメータを使用してフォームに入力します(補足図3):入力ムービーはステップ1で取得したものですが、ALIGNまでのフレームの範囲は2~13で、その他のオプションはデフォルト値にとどまります。プログラムを実行します。注記: フォーム内の太字のパラメータは、常に入力する必要があります。他のユーザーはデフォルト値を持つか、義務的に要求されません。フォーム ウィンドウの上部には、計算リソースが分散されているフィールドが、スレッド、MPI、または GPU として表示されます。 [ 結果を分析 ]をクリックして、取得した顕微鏡写真と推定シフトの軌跡を確認します(図1)。見られるすべての顕微鏡写真について:パワースペクトル密度(PSD)、デカルト座標と極座標でムービーを整列させるために得られた軌道(フレームごとに1ポイント)、および得られた顕微鏡写真のファイル名(クリックすると、顕微鏡写真を検査することができる)。標本の粒子は、ムービーの単一のフレームに比べて、顕微鏡写真ではるかに見えることに注意してください。 3. CTF推定:顕微鏡の収差を計算する まず、グリゴリエフラブ – ctffind15の方法を使用します。設定は、入力顕微鏡写真はステップ2の出力であり、手動CTFダウンサンプリング係数は1.5に設定され、解像度の範囲は0.06から0.42に設定されます。さらに、詳細オプション (フォームのエキスパート レベルでこの選択を選択すると表示されます) で、ウィンドウ サイズを 256 に設定します。残りのパラメーターはデフォルト値のままです (補足図 4)。注: Scipion のほとんどのメソッドでは 、詳細設定 オプションにより多くの設定パラメータが表示されます。起動するプログラムが完全にわかっている場合、パラメーターの意味が理解されている場合は、これらのオプションを慎重に使用します。一部のパラメーターは、データを見ずに入力するのが難しい場合があります。その場合、Scipion は右側に魔法の杖を表示し、ウィザード ウィンドウを表示します (補足図 5)。たとえば、このフォームの [解像度] フィールドでは、PSDの最初のゼロから最後の目立つリングまでの領域をカバーするように選択する必要があります。 メソッドが終了したら、[ 実行 ] をクリックし、[ 結果の分析 ] (図 2) をクリックします。推定CTFが実験用のCTFと一致することを確認します。そのために、PSDを見て、コーナーの推定リングとデータから来るリングを比較します。また、取得したデフォーカス値をチェックして、予期しない値を見つけ、それぞれの顕微鏡写真を破棄または再計算することができます。この例では、マイクログラフのセット全体を使用できます。注: ウィンドウの下部にあるボタンを使用して、マイクログラフのサブセット( マイクログラフ の赤いボタン付き)を作成し、必要に応じてCTFを再計算します( CTFを再計算 する赤いボタンを使用)。 以前の推定値を調整するには、xmipp3 – ctf 推定20を使用します。ステップ2の出力を入力顕微鏡で選択し、以前のCTF推定でグリゴリエフラボ- ctffindの出力を選択し、アドバンスレベルでウィンドウサイズを256に変更する(補足図6)として、以前のCTF推定からdefociを使用するオプションを選択します。それを実行します。 [結果の分析] をクリックして、取得した CTF を確認します。この方法では、さらに多くのデータが推定され、いくつかの余分な列で表されます。いずれも間違った推定値を示すため、すべての顕微鏡写真は次の手順で使用されます。 4. 粒子ピッキング:顕微鏡写真で粒子を見つける ピッキングを開始する前に、顕微鏡写真の前処理を行ってください。オープンxmipp3 – プリプロセス顕微鏡写真は、ステップ2で得られた入力顕微鏡写真として設定され、オプションを選択して、Stddevの倍数を5に、ダウンサンプルマイクログラフは2(補足図7)。。[実行] をクリックし、作成されるマイクログラフのサイズが縮小されていることを確認します。 ピッキング用 xmipp3 – 手動ピッキング (ステップ 1) および xmipp3 – 自動ピッキング (ステップ 2)21.手動ピッキングでは、自動ピッキングステップが学習し、パーティクルの完全なセットを生成する一連のパーティクルを手動で準備することができます。まず、前の前処理で得られた顕微鏡写真として入力顕微鏡写真を使用して、xmipp3 – 手動ピッキング(ステップ1)を実行します。[実行] をクリックすると、新しい対話型ウィンドウが表示されます (図 3)。 このウィンドウでは、マイクログラフのリスト (図 3a) とその他のオプションが表示されます。 サイズ(px)を 150に変更すると、各パーティクルを含むボックスのサイズになります。選択した顕微鏡写真が大きなウィンドウに表示されます。領域を選択し、その中のすべての可視パーティクルを選択します(図 3b)。次に、[ トレーニングの有効化 ] をクリックして学習を開始します。顕微鏡写真の残りの領域は自動的に選択されます(図3c)。選択したパーティクルをチェックし、クリックして追加を追加するか、必要に応じて Shift+クリックで誤ったものを削除します。 最初のウィンドウで次の顕微鏡写真を選択します。顕微鏡写真は自動的に選択されます。必要に応じて、パーティクルを含めたり削除したりするには、もう一度チェックします。この手順を約 5 つの顕微鏡写真で繰り返して、代表的なトレーニング セットを作成します。 これが完了したら、メインウィンドウの 座標 をクリックして、選択したすべてのパーティクルの座標を保存します。パーティクルのトレーニングセットは、自動ピッキングに進み、すべての顕微鏡写真のプロセスを完了する準備が整いました。 開いたxmipp3 – Xmippパーティクルピッキングで示す自動ピッキング(ステップ2)は、前の手動ピッキングを実行し、監督と同じとして選択する顕微鏡写真。実行をクリックします。このメソッドは、約 100000 座標のセットを出力として生成します。 コンセンサスアプローチを適用するので、2番目のピッキング方法を実行して、両方の方法が一致する粒子を選択します。オープンスファイア – cryoloピッキング14と入力顕微鏡として前処理された顕微鏡写真を選択し、一般モデルを使用しますか?はい、信頼度しきい値0.3、ボックスサイズ150(補足図8)。それを実行します。このメソッドは、約 100000 座標も生成する必要があります。 実行xmipp3 – 深いコンセンサスピッキング22。入力座標には、スファイア – クライオロピッキング(ステップ4.7)とxmipp3 – 自動ピッキング(ステップ4.6)の出力が含まれるように、モデルタイプを事前トレーニング済みに設定し、トレーニングをスキップして事前トレーニングモデルで直接スコアを付けますか?[はい](補足図9)。それを実行します。 [結果の分析] をクリックし、新しいウィンドウで[zScoreDeepLearning1] の値が高いパーティクル/座標を選択する横の目のアイコンをクリックします。新しいウィンドウが開き、すべてのパーティクルのリストが表示されます(図4)。列の zScore 値は、パーティクルの品質に関する洞察を与え、低い値は品質が悪いということを意味します。 ラベルをクリック_xmipp_zScoreDeepLearning パーティクルを最高から最低 の zScore に並べ替えます。 zScore が 0.75 より大きいパーティクルを選択し、[ 座標 ]をクリックして新しいサブセットを作成します。これにより、約 50000 座標のサブセットが作成されます。 オープンxmipp3 – ディープマイクログラフクリーナー。[入力座標] を選択すると、前の手順で取得したサブセット、マイクログラフのソースは座標と同じになり、しきい値は 0.75 に保ちます。それを実行します。[サマリー] タブで座標の数が減っていることを確認します。注: この手順では、さらに座標のセットをクリーンアップすることができ、カーボンゾーンや大きな不純物として、より多くのムービーアーティファクトを持つ他のデータセットをクリーニングするのに非常に役立つ可能性があります。 xmipp3 – 粒子を抽出します(補足図10)。入力座標として、前のステップの後に取得した座標、マイクログラフソース他、ステップ2の出力としての入力マイクログラフ、xmipp3-ctf推定の出力としてのCTF推定、3までのダウンサンプリング係数、および100の粒子ボックスサイズを示す。フォームの [前処理] タブで 、[すべて] に [はい] を選択します。それを実行します。 出力に、100 x 100 ピクセルの縮小サイズと 4.02Å/px のピクセル サイズのパーティクルが含まれていることを確認します。 もう一度 実行 xmipp3 – 次のパラメータを変更するパーティクルを抽出します: ダウンサンプリング係数 を 1 に、 パーティクル ボックスのサイズ を 300 にします。出力が同じパーティクル セットですが、現在はフル解像度であることを確認します。 5. 2D分類:類似する粒子をグループ化 ステップ 4.11 で取得した入力パーティクルを使用して方法 cryosparc2 – 2d classification11 を開き、[2D 分類] タブの [クラス数] を 128 にして、他のすべてのパラメータをデフォルト値のままにします。それを実行します。 [ 結果を分析 ]をクリックし、[ Scipion でパーティクル クラスを表示 ]の横にある目のアイコンをクリックします(図 5)。この分類は、複数のクラスが騒がしい、またはアーティファクトを伴うように見えるように、パーティクルのセットをクリーンアップするのに役立ちます。良いビューを含むクラスを選択します。 パーティクル (ウィンドウの下部にある赤いボタン)をクリックして、クリーナサブセットを作成します。 さて、xmipp3 – cl2d23を開き、入力画像として前のステップで取得した画像と128クラスの数として設定します。実行をクリックします。注: この 2 番目の分類は、パーティクルセットの追加のクリーニング ステップとして使用されます。通常、可能な限り多くの騒がしい粒子を除去するのに役立ちます。ただし、より単純なワークフローが必要な場合は、2D 分類方法を 1 つだけ使用できます。 メソッドが終了したら、[ 結果の分析 ] と [ 表示するもの: クラス] をクリックして、生成された 128 のクラスを確認します。生成されたクラスのほとんどは、ある程度の詳細を持つ高分子の投影を示しています。ただし、一部のクラスは騒がしいようです(この例では約 10 クラス)。すべての良いクラスを選択し、[ クラス ]ボタンをクリックして、良いクラスだけを含む新しいサブセットを生成します。このサブセットは、初期ボリュームを生成する方法の 1 つへの入力として使用されます。同じ選択したクラスで、悪いクラスに属するものを削除した後、よりクリーンなサブセットを作成するために パーティクル をクリックします。 開く pwem – 4.13 の出力としてアイテムのフル セットを持つサブセット (フル サイズのすべてのパーティクル)、ランダムサブセットを No にする、前のステップで作成したパーティクルのサブセットとして設定するその他、および[交差として操作を設定]。これにより、パーティクルから前のサブセットが完全な解像度で抽出されます。 6. 初期容積推定: 3D ボリュームの最初の推定値を構築する このステップでは、異なる方法で2つの初期ボリュームを推定し、コンセンサスツールを使用して最終的な推定3Dボリュームを生成します。開く xmipp3 – ステップ 5 の後に取得した入力クラス、対称グループを c1 として、有意な 24 メソッドを再構築し、残りのパラメーターをデフォルト値に保ちます (補足図 11)。それを実行します。 [ 結果の分析] をクリックします。サイズが 100 x 100×100 ピクセルの低解像度ボリュームと 4.02Å/px のピクセル サイズが得られていることを確認します。 xmipp3 を開く – 前のステップで取得したものを入力ボリュームとして使用するボリュームのトリミング/サイズ変更ボリューム (補足図 12)、ボリュームのサイズ変更、サンプリング レートへのサイズ変更オプション、[サンプリング レート] のサイズ変更オプション、サンプリング レートを 1.34 Å/px に変更します。それを実行します。[概要] タブで、出力ボリュームのサイズが正しいことを確認します。 次に、2 番目の初期ボリュームを作成します。オープン relion – 3D 初期 model10 は、入力パーティクルがフル解像度で良好なパーティクル(出力 5.5 の出力)を使用し、パーティクル マスクの直径を 402Å に設定するので、残りのパラメータをデフォルト値のままにします。それを実行します。 [結果の分析] をクリックし、[ボリュームを表示する: スライス] をクリックします。低解像度の容積が、構造の主な形状を有していることを確認します(補足図13)。 さて、オープンpwem – 結合セットは、コンセンサスメソッドへの入力を作成するために、生成された2つの初期ボリュームを結合します。入力タイプとしてボリュームを指定し、入力セットで2つの初期ボリュームを選択するだけです。それを実行します。出力は、両方のボリュームを持つ 2 つの項目を含むセットである必要があります。 コンセンサスツールは、 xmipp3 – 群れのコンセンサス25に含まれるものです。開けて下さい。 フルサイズ画像 として使用するフル解像度(出力5.5)で、初期ボリュームは前のステップで生成された2つのアイテムを含むセットを ボリューム し、 Symmetryグループ がc1であることを確認します。実行をクリック します。 [ 結果の分析] をクリックします。より詳細な出力ボリュームが得られたことを確認します(図6)。構造を取り巻くノイズは多くなりますが、構造マップに詳細を表示すると、ローカルミニマを回避するための次の細分化手順に役立ちます。注: UCSF Chimera26 が使用可能な場合は、ウィンドウ上部の最後のアイコンを使用して、取得したボリュームを 3D で視覚化します。 開いて、リリオンを実行 – 3D自動 refine10パーティクルの最初の 3D 角度の割り当てを行います。入力粒子として出力5.5を選択し、粒子マスクの直径を402Åに設定します。[参照 3D マップ] タブで、前の手順で取得した入力ボリューム、c1 として[シンメトリ]、初期ローパス フィルタを 30Å に選択します(補足図 14)。 [結果の分析] をクリックします。新しいウィンドウで、最終ボリュームを選択して[ボリュームを表示]をクリックし、取得したボリュームを表示します。 また、結果ウィンドウの解像度プロットの表示と、角度分布の表示:2Dプロット(図7)で表示解像度プロットをクリックして、フーリエシェル相関(FSC)をチェックします。再構築されたボリュームには、より詳細な部分(おそらく構造の外側の部分にぼやけた領域がある)が含まれ、FSCは4.5Åの周りに0.143のしきい値を超えます。角度カバレッジは、3D 球全体をカバーします。 7.3D分類:立体構造状態の発見 コンセンサスアプローチを使用すると、異なる立体構造状態がデータ内にある場合に、探索することができます。開いた リリオン – 3D分類10 (補足図15)。 入力粒子 としては6.10で得たものを使用し、 粒子マスク径 を402Åに設定します。[ 参照 3D マップ ] タブで、ステップ 6.10 以降に取得した 入力ボリューム として、 対称を c1 に設定し、 初期ローパス フィルタ を 15Å に設定します。最後に、[ 最適化] タブで[ クラス数] を 3 に設定します。それを実行します。 結果を分析] をクリックして 結果を確認し、[ Scipion で分類を表示] を選択します。生成された 3 つのクラスといくつかの興味深いメジャーが示されています。最初の 2 つのクラスは、割り当てられた画像の数が似ており (サイズ 列) が非常に似ている必要があり、3 番目のクラスはイメージが少なく、外観がぼやけています。また、最初の 2 つのクラスでは 、rlnAccuracy 回転 と rlnAccuracy トランスレーション が明確に優れているはずです。最適な 2 つのクラスを選択し、[ クラス ] ボタンをクリックして、クラスを含むサブセットを生成します。 手順 7.1 と 7.2 を繰り返して、2 番目の良いクラスのグループを生成します。どちらもコンセンサスツールの入力になります。 開いて実行 xmipp3 – コンセンサスクラス 3D 前の手順で生成された 2 つのサブセットを 入力クラス として選択します。 [ 結果の分析] をクリックします。クラス間の一致するパーティクルの数が表示されます:最初の値は、サブセット 1 の最初のクラスとサブセット 2 の最初のクラスの一致するパーティクルの数、2 番目の値はサブセット 1 の最初のクラスとサブセット 2 の 2 番目のクラスの一致するパーティクルの数です。パーティクルがクラス 1 または 2 にランダムに割り当てられていることを確認します。この結果を考えると、パーティクルのセット全体が処理を続行するために使用されます。 8.3D洗練:均質な集団の角度割り当てを精製する この手順では、コンセンサス アプローチを適用します。まず、pwem を開いて実行する – 6.9 の出力として項目の完全なセットを持つサブセット、ランダムなサブセットを Yes に、要素の数を 5000 にします。これにより、次の手順で使用される方法をトレーニングするための前の配置を持つイメージのサブセットが作成されます。 開いた xmipp3 – 深い位置合わせ、5.5で得られた良い粒子の出力として 入力画像 を設定し、6.10の後に得られたものとして ボリューム 、前のステップで作成されたものとして 入力トレーニングセット 、 目標解像度 を10Åに設定し、残りのパラメータをデフォルト値に保ちます(補足図16)。実行をクリック します。 [結果の解析] をクリックして、取得した角度分布をチェックします(6.10 の角度と比較して、角度カバレッジがわずかに改善されます)。 開いて実行 xmipp3 – 角度を比較 し 、入力パーティクル 1 として 6.9 の出力と 8.2 の出力 を入力パーティクル 2 として選択し、 シンメトリグループ が c1 であることを確認します。この方法は、 xmipp3 – 深い位置合わせ と リリオン – 3D 自動リファインの間のアグリーメントを計算します。 [ 結果を解析]をクリックすると、取得したシフトと角度の違いを含むパーティクルのリストが表示されます。ウィンドウの上部にあるバーアイコンをクリックすると、計算変数のプロットを作成できる別のウィンドウが開きます。 _xmipp_angleDiff 選択し、[ プロット ]をクリックして、パーティクルごとの角度差の表現を表示します。 _xmipp_shiftDiffと同じことを行います。これらの図では、およそ半数の粒子の方法が一致する(図9)。角度の差が 10º 未満のパーティクルを選択し、新しいサブセットを作成します。 今、xmipp3を開く – highres27は、割り当てられた角度のローカルの洗練を行います。最初に、前の手順で取得した画像を [フルサイズイメージ] として選択し、[初期ボリューム] で [6.9]の出力、[パーティクルの半径] を 150 ピクセルに設定し、[シンメトリ] グループを c1 として設定します。[角度]割り当てタブで、[イメージの配置]を[ローカル]、[反復回数]、および[最大]に設定します。目標解像度を 5Å/px (補足図 17)それを実行します。 [ 概要] タブで、出力ボリュームが300x300x300ピクセルより小さく、ピクセルサイズがわずかに大きいかどうかを確認します。 [結果の分析] をクリックして、取得した結果を確認します。[解像度プロットを表示]をクリックしてFSCを表示し、[表示ボリューム: 再構築]で取得したボリュームを確認します(補足図18)。4-3.5Åに近い解像度のボリュームが得られます。 [出力パーティクルを表示]をクリックし、パーティクルのリストを表示するウィンドウでバーアイコンをクリックします。新しいウィンドウで、[100 ビンで、ヒストグラムとして入力] を選択し、ラベル_xmipp_cost選択し、最後に [プロット] を押します (補足図 19)。これにより、コスト ラベルのヒストグラムが提示され、パーティクルと選択された投影方向との相関関係が含まれます。この場合、一連の粒子に異なる集団を持たない兆候であるユニモーダル密度関数が得られる。したがって、それらのすべては、洗練を継続するために使用されます注: マルチモーダル密度関数を表示する場合は、より高い最大値に属するパーティクルのセットを選択して、その一方でのみワークフローを続行する必要があります。 開いて、再び 実行 xmipp3 – 前の 実行から続行してハイレス?は い、8.5以降に取得した フルサイズの画像 に設定し、 Xmipp Highresの前回の実行で以前の 実行 を選択します。 [角度]割り当て タブで、[ イメージの配置 ]を[ ローカル]に設定し、1 回の反復で、2.6Å/px をターゲット解像度(フル解像度)に設定します。 出力には、フル解像度のボリューム (サイズ 300x300x300 ピクセル) が含まれるはずです。[結果の分析] をクリックして、取得したボリュームと FSC をもう一度確認します。 9. 評価・後処理 オープンxmipp3 – ローカルMonoRes28。このメソッドは、解像度をローカルで計算します。入力ボリュームとして 8.10 以降に取得したものを設定し、半分のボリュームを使用しますか?はい、解像度の範囲を 1 ~ 10Å に設定します。それを実行します。 [ 結果の分析 ] をクリックし、[ 解像度ヒストグラムを表示] と [ 色付きスライスを表示] を選択します (図 11)。ボリュームの異なる部分の解像度が表示されます。構造の中央部のボクセルのほとんどは、外側の部分で最悪の解像度が達成されている間、3Åの周りの解像度を提示する必要があります。また、ボクセルあたりの解像度のヒストグラムは、3Åの周りのピーク(下でも)で示されています。 開いて実行 xmipp3 – シャープニングを適用する29をローカルデブラーシャープン29。入力マップとして 8.10 で取得したものを選択し、MonoRes で前のステップで取得したものを解像度マップとして選択します。 [結果の分析] をクリックして、取得したボリュームを確認します。アルゴリズムの最後の反復に対応する最後の 1 つを開きます。3D でボリュームの機能を確認するには、UCSF Chimera26 などの他のツールでボリュームを開くことをお勧めします(図 12)。 最後に、xmipp3に含まれる検証ツールを開き、パーティクルの数によって解像度がどのように変化するかを示すオーバーフィット30を検証します。ステップ 8.5 で取得したパーティクルを[入力パーティクル]として開き、[解像度に対するノイズのバインドを計算する]を[はい]に設定し、初期 3D 参照ボリュームを出力 8.10 にします。[詳細オプション]で、[500 1000 1500 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000」にパーティクルの数を設定します(補足図20)。それを実行します。 [ 結果の分析] をクリックします。再構成に使用されるパーティクルの数が増えるにつれて、解像度の進化とともに 2 つのプロット (図 13) が緑色の線で表示されます。赤い線は、整列したガウスノイズの再構成によって達成される解像度を表します。解像度は粒子の数とノイズからの粒子と比較した再構成の大きな違いが観察され、良好な構造情報を持つ粒子を有する指標である。 前の結果から、後処理された容積のモデルのフィッティングを行うことができ、これは高分子の生物学的構造を発見することを可能にする。