Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.
Kriyo-elektron mikroskopisi, makromoleküllerin yapısal bilgilerini atoma yakın çözünürlükte ortaya çıkarmak için biyolojik araştırmalarda en önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Tek parçacıklı analizde, vitrifiye numune bir elektron ışını tarafından görüntülenir ve mikroskop sütununun sonundaki dedektörler bu örneğin filmlerini üretir. Bu filmler rastgele yönelimlerde aynı parçacıkların binlerce görüntüsü içerir. Verilerin, son 3D yeniden yapılandırılmış birimi elde etmek için birden çok adıma sahip bir görüntü işleme iş akışından geçmesi gerekir. Görüntü işleme iş akışının amacı, incelenmek üzere numuneyi yeniden oluşturabilmek için edinme parametrelerini tanımlamaktır. Scipion, tümleştirici bir çerçevede çeşitli görüntü işleme paketleri kullanarak bu iş akışını oluşturmak için tüm araçları sağlar ve ayrıca sonuçların izlenebilirliğine izin verir. Bu makalede, Scipion’daki tüm görüntü işleme iş akışı, mikroskop tarafından elde edilen filmlerden yüksek çözünürlüklü bir son 3D rekonstrüksiyonuna gitmek için gerekli tüm ayrıntıları vererek gerçek bir test durumundan gelen verilerle sunulmakta ve tartışılmaktadır. Ayrıca, yöntemlerin birleştirilmesine izin veren konsensüs araçlarını kullanmanın ve iş akışının her adımı boyunca sonuçları onaylamanın, elde edilen sonuçların doğruluğunu artırmanın gücü tartışılmaktadır.
Kriyo-elektron mikroskopisinde (kriyo-EM), vitrifiye dondurulmuş nemlendirilmiş örneklerin tek parçacık analizi (SPA), moleküler etkileşimleri ve biyolojik toplulukların işlevini anlamaya izin verdiği için biyolojik makromoleküller için görüntülemenin en yaygın kullanılan ve başarılı varyantlarından biridir1. Bu, “çözünürlük devrimi”2’ye yol açan ve atoma yakın çözünürlükle biyolojik 3D yapıların başarılı bir şekilde belirlenmesine izin veren bu görüntüleme tekniğindeki son gelişmeler sayesindedir. Şu anda SPA cryo-EM’de elde edilen en yüksek çözünürlük apoferritin3 için 1,15 şidi (EMDB girişi: 11668). Bu teknolojik gelişmeler, örnek hazırlama4, görüntü alma5 ve görüntü işleme yöntemlerinde iyileştirmeler içerir6. Bu makale bu son noktaya odaklanmıştır.
Kısaca, görüntü işleme yöntemlerinin amacı, mikroskopun görüntüleme sürecini tersine çevirmek ve incelenmekte olan biyolojik örneğin 3D yapısını kurtarmak için tüm edinme parametrelerini tanımlamaktır. Bu parametreler, kameranın kazancı, ışın kaynaklı hareket, mikroskop sapmaları (özellikle defokus), her parçacığın 3D açısal yönelimi ve çevirisi ve konformasyonel değişikliklere sahip bir numuneye sahip olması durumunda konformasyonel durumdur. Bununla birlikte, parametre sayısı çok yüksektir ve cryo-EM radyasyon hasarını önlemek için düşük dozlu görüntüler kullanmayı gerektirir, bu da elde edilen görüntülerin Sinyal-Gürültü Oranını (SNR) önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, sorun kesin olarak çözülemez ve hesaplanacak tüm parametreler yalnızca tahminler olabilir. Görüntü işleme iş akışı boyunca, sonunda yüksek çözünürlüklü bir 3D yeniden yapılandırma elde etmek için kalanları atarak doğru parametreler tanımlanmalıdır.
Mikroskop tarafından oluşturulan veriler çerçeveler halinde toplanır. Basitleştirici olan çerçeve, elektron sayma dedektörleri kullanıldığında görüntüde belirli bir konuma (piksel) ulaşan elektron sayısını içerir. Belirli bir görüş alanında, birkaç kare toplanır ve buna film denir. Numuneyi yok edebilecek radyasyon hasarını önlemek için düşük elektron dozları kullanıldığından, SNR çok düşüktür ve örnek hakkında yapısal bilgileri ortaya çıkaran bir görüntü elde etmek için aynı filme karşılık gelen karelerin ortalamasının alınması gerekir. Bununla birlikte, sadece basit bir ortalama uygulanmaz, numune, denge edilmesi gereken ışın kaynaklı hareket nedeniyle görüntüleme süresi boyunca kaymalara ve diğer hareket türlerine maruz kalabilmemektedir. Kaydırma telafisi ve ortalama çerçeveler bir mikrografiden kaynaklanır.
Mikrograflar elde edildikten sonra, mikroskop tarafından her biri için tanıtılan sapmaları tahmin etmemiz gerekir, kontrast aktarım fonksiyonu (CTF), bu da mikro grafiğin kontrastındaki değişiklikleri frekansın bir işlevi olarak temsil eder. Daha sonra, parçacık toplama adı verilen parçacıklar seçilebilir ve çıkarılabilir. Her parçacık, incelenmekte olan numunenin sadece bir kopyasını içeren küçük bir görüntü olmalıdır. Parçacık toplama için üç algoritma ailesi vardır: 1) parçacığın görünümünün sadece bazı temel parametrelendirmesini kullanarak tüm mikrografi kümesinde (örneğin, parçacık boyutu), 2) parçacıkların nasıl göründüğünü kullanıcıdan veya önceden eğitilmiş bir kümeden öğrenenler ve 3) görüntü şablonlarını kullananlar. Her ailenin daha sonra gösterilecek farklı özellikleri vardır.
Mikrograflarda bulunan çıkarılan parçacık kümesi, iki hedefi olan bir 2B sınıflandırma işleminde kullanılacaktır: 1) saf gürültü görüntüleri, çakışan parçacıklar veya diğer eserler içeren alt kümeyi atarak parçacık kümesinin temizlenmesi ve 2) her sınıfı temsil eden ortalama parçacıklar, 3B başlangıç hacmini hesaplamak için ilk bilgi olarak kullanılabilir.
3D başlangıç hacmi hesaplaması bir sonraki önemli adımdır. 3B yapıyı elde etme sorunu, küresel minimumun orijinal yapıyı temsil eden en iyi 3B birim olduğu, ancak yetersiz çözümleri temsil eden birkaç yerel minimanın bulunabildiği ve tuzağa düşmenin çok kolay olduğu çok boyutlu bir çözüm ortamında optimizasyon sorunu olarak görülebilir. başlangıç hacmi, arama işleminin başlangıç noktasını temsil eder, bu nedenle kötü başlangıç hacmi tahmini, genel minimum noktayı bulmamızı engelleyebilir. İlk hacimden itibaren, 3D sınıflandırma adımı farklı konformasyon durumlarını keşfetmeye ve parçacık kümesini tekrar temizlemeye yardımcı olacaktır; amaç yapısal olarak homojen bir parçacık popülasyonu elde etmektir. Bundan sonra, mümkün olan en iyi 3D hacmi elde etmek için her parçacık için açısal ve çeviri parametrelerini rafine etmekten bir 3D iyileştirme adımı sorumlu olacaktır.
Son olarak, son adımlarda, elde edilen 3D rekonstrüksiyon keskinleştirilebilir ve parlatılabilir. Keskinleştirme, yeniden inşa edilen hacmin yüksek frekanslarını artırma işlemidir ve parlatma, CTF veya ışın kaynaklı hareket telafisi olarak bazı parametreleri parçacıklar düzeyinde daha da iyileştirmek için bir adımdır. Ayrıca, iş akışının sonunda elde edilen çözünürlüğü daha iyi anlamak için bazı doğrulama yordamları kullanılabilir.
Tüm bu adımlardan sonra, izleme ve yerleştirme işlemleri7 , atomik modeller de novo inşa ederek veya mevcut modelleri sığdırarak elde edilen 3D rekonstrüksiyona biyolojik bir anlam kazandırmaya yardımcı olacaktır. Yüksek çözünürlük elde edilirse, bu süreçler bize biyolojik yapıların, hatta farklı atomların yapımızdaki konumlarını söyleyecektir.
Scipion8, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına olanak tanır. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 ve daha birçok paket Scipion’a dahil edilebilir. Ayrıca, tüm görüntü işleme iş akışının tam bir izlemesini yapmak için entegrasyon, birlikte çalışabilirlik, izlenebilirlik ve tekrarlanabilirlik için gerekli tüm araçları içerir8.
Scipion’un kullanmamıza izin verdiği en güçlü araçlardan biri, işlemin bir adımında elde edilen sonuçları birkaç yöntemle karşılaştırmak ve daha doğru bir çıktı oluşturmak için farklı yöntemlerle aktarılan bilgilerin bir kombinasyonunu yapmak anlamına gelen fikir birliğidir. Bu, tahmini parametrelerde performansı artırmaya ve elde edilen kaliteyi artırmaya yardımcı olabilir. Konsensüs yöntemleri kullanılmadan daha basit bir iş akışının oluşturabileceğini unutmayın; ancak, bu aracın gücünü gördük22,25 ve bu yazıda sunulan iş akışı birkaç adımda kullanacaktır.
Önceki paragraflarda özetlenen tüm adımlar aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanacak ve Scipion kullanılarak eksiksiz bir iş akışında birleştirilecektir. Ayrıca, oluşturulan çıktılarda daha yüksek bir anlaşma elde etmek için konsensüs araçlarının nasıl kullanılacağı gösterilecektir. Bu amaçla, Plasmodium falciparum 80S Ribozom’un örnek veri kümesi seçilmiştir (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Veri kümesi, 4096×4096 piksel boyutunda 16 karelik 600 filmden oluşur ve FEI FALCON II kameralı bir FEI POLARA 300’de çekilen 1.34şpiksel boyutunda, EMDB’de bildirilen çözünürlük 3.2Å18 ‘dir.
Şu anda, kriyo-EM biyolojik örneklerin 3D yapısını ortaya çıkarmak için önemli bir araçtır. Mikroskopla iyi veriler toplandığında, mevcut işleme araçları, incelenmekte olan makromolekülün 3D yeniden yapılandırılmasını elde etmemizi sağlayacaktır. Cryo-EM veri işleme, bir makromolekülün işlevsel davranışını anlamanın anahtarı olan ve ilaç keşfinde de çok önemli olan atoma yakın çözünürlük elde edebilir.
Scipion, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına izin veren ve tüm görüntü işleme iş akışının izlenebilirliğine ve tekrarlanabilirliğine yardımcı olan bir yazılımdır. Scipion, işlemi gerçekleştirmek için çok eksiksiz bir araç seti sağlar; ancak, yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlar elde etmek tamamen elde edilen verilerin kalitesine ve bu verilerin nasıl işlendiğini bağlıdır.
Yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için ilk gereksinim, yapısal bilgileri yüksek çözünürlüğe koruyan mikroskoptan iyi filmler elde etmektir. Bu durumda, iş akışı verilerden yüksek tanımlı bilgileri ayıklayamaz. Daha sonra, başarılı bir işleme iş akışı, yapıya gerçekten karşılık gelen parçacıkları çıkarabilmeli ve bu parçacıkların 3D alandaki yönelimlerini bulmalıdır. İş akışındaki adımlardan herhangi biri başarısız olursa, yeniden yapılanan birimin kalitesi düşer. Scipion, işleme adımlarından herhangi birinde farklı paketler kullanılmasına izin verir, bu da verileri işlemek için en yeterli yaklaşımı bulmaya yardımcı olur. Ayrıca, birçok paketin mevcut olması sayesinde, farklı yöntemlerin tahmini çıktılarında bir anlaşma bularak doğruluğu artıran konsensüs araçları kullanılabilir. Ayrıca, Temsili Sonuçlar bölümünde çeşitli doğrulama araçları ve iş akışının her adımında doğru ve yanlış sonuçların nasıl belirlenacağı, olası sorunların nasıl tespit edilerek nasıl çözülmeye çalışılacağı ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Protokol boyunca, protokolün düzgün çalıştırılıp çalışmadığını anlamaya yardımcı olabilecek birkaç denetim noktası vardır. En alakalı olanlardan bazıları şunlardır: malzeme çekme, 2D sınıflandırma, ilk hacim tahmini ve 3D hizalama. Girişleri denetlemek, adımı farklı bir yöntemle yinelemek veya fikir birliğini kullanmak, Scipion’da kullanıcının sorunlar göründüğünde çözüm bulmak için kullanabileceği seçeneklerdir.
Cryo-EM alanındaki paket entegrasyonuna yönelik önceki yaklaşımlarla ilgili olarak Appion31 , farklı yazılım paketlerinin gerçek entegrasyonuna izin veren tek yaklaşımdır. Bununla birlikte, Appion, elektron mikroskoplarından otomatik görüntü toplama sistemi olan Leginon32 ile sıkı bir şekilde bağlantılıdır. Scipion ile temel fark, veri modeli ve depolamanın daha az birleştirilmiş olmasıdır. Bu şekilde, Scipion’da yeni bir protokol oluşturmak için yalnızca bir Python komut dosyası geliştirilmesi gerekir. Ancak, Appion’da geliştiricinin komut dosyasını yazması ve temel veritabanını değiştirmesi gerekir. Özetle, Scipion bakım ve genişletilebilirliği basitleştirmek için geliştirilmiştir.
Bu yazıda , Plasmodium falciparum 80S Ribozom’un gerçek durum veri kümesini kullanarak Cryo-EM işleme için eksiksiz bir iş akışı sunduk (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Burada ele alınan ve tartışılan adımlar film hizalaması, CTF tahmini, parçacık toplama, 2D sınıflandırma, ilk harita tahmini, 3D sınıflandırma, 3D iyileştirme, değerlendirme ve işlem sonrası olarak özetlenebilir. Bu adımların birkaçında farklı paketler kullanılmış ve konsensüs araçları uygulanmıştır. Son 3D yeniden inşa edilen hacim 3 şçözünürlüğe ulaştı ve işlendikten sonra, atomların uzayda nasıl düzenlendiğini açıklamaya yardımcı olan alfa-helikler gibi bazı ikincil yapılar ayırt edilebilir.
Bu yazıda sunulan iş akışı, Scipion’un farklı Cryo-EM paketlerini basitleştirmek ve aynı zamanda daha güvenilir bir sonuç elde etmek için basit ve bütünleştirici bir şekilde birleştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Gelecekte, yeni yöntem ve paketlerin geliştirilmesi büyümeye devam edecek ve Scipion gibi yazılımların hepsini kolayca entegre etmesi araştırmacılar için daha da önemli olacaktır. Konsensüs yaklaşımları, farklı temellere sahip birçok yöntemin mevcut olacağı ve Cryo-EM’deki yeniden yapılanma sürecinde yer alan tüm parametrelerin daha doğru tahminlerinin elde edilmesine yardımcı olacaktır. Takip ve tekrarlanabilirlik, araştırma sürecinde anahtardır ve eksiksiz iş akışlarının yürütülmesi için ortak bir çerçeveye sahip olması sayesinde Scipion ile elde etmek daha kolaydır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı’nın Hibe yoluyla ekonomik desteğini kabul etmek istiyor: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, Hibe yoluyla “Comunidad Autónoma de Madrid”: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), Avrupa Birliği (AB) ve Horizon 2020 hibe yoluyla: INSTRUCT – ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Teklif: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Teklif: 824087), iNEXT – Discovery (Teklif: 871037) ve HighResCells (ERC – 2018 – SyG, Teklif: 810057). Bu sonuçlara yol açan proje ,”la Caixa” Vakfı’ndan (ID 100010434) burs desteği aldı. Burs kodu LCF/BQ/DI18/11660021’dir. Bu proje, 713673 Numaralı Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. Yazarlar, bir Landmark ESFRI projesi olan Instruct’ın desteklerini ve kaynaklarının kullanımını kabul ediyorlar.