Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming
Summary
We beschrijven een protocol om intacte wortels en de omliggende rhizosfeergrond uit wetlandomgevingen te bemonsteren, te behouden en te doorsnijden met rijst(Oryza sativa L.) als modelsoort. Eenmaal bewaard, kan het monster worden geanalyseerd met behulp van elementaire beeldvormingstechnieken, zoals synchrotron x-ray fluorescentie (XRF) chemische speciatie beeldvorming.
Abstract
Wortels werken veel samen met hun bodemomgeving, maar het visualiseren van dergelijke interacties tussen wortels en de omringende rhizosfeer is een uitdaging. De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om vast te leggen vanwege steile zuurstofgradiënten van de wortels naar de bulkgrond. Hier wordt een protocol beschreven dat de wortelstructuur en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Slam-freezing, waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken voorgekoeld met vloeibare stikstof, minimaliseert wortelschade en monstervervorming die kan optreden bij flitsvriezen terwijl chemische speciatieveranderingen nog steeds worden geminimaliseerd. Hoewel monstervervorming nog steeds mogelijk is, verhoogt de mogelijkheid om snel en met minimale kosten meerdere monsters te verkrijgen het potentieel om bevredigende monsters te verkrijgen en optimaliseert het de beeldvormingstijd. De gegevens tonen aan dat deze methode succesvol is in het behoud van gereduceerde arseensoorten in rijstwortels en rhizobolletjes geassocieerd met ijzerplaques. Deze methode kan worden toegepast voor studies van plant-bodemrelaties in een breed scala aan wetlandomgevingen die de concentratie omvatten, variërend van sporen-element fietsen tot fytoremediatietoepassingen.
Introduction
Wortels en hun rhizosfeer zijn dynamisch, heterogeen en van cruciaal belang om te begrijpen hoe planten minerale voedingsstoffen en verontreinigingen verkrijgen1,2,3. Wortels zijn de primaire route waarmee nutriënten (bijv. fosfor) en verontreinigingen (bijv. arseen) van de bodem naar planten gaan en dus heeft het begrijpen van dit proces implicaties voor de voedselhoeveelheid en -kwaliteit, de werking van het ecosysteem en fytoremediatie. Wortels zijn echter dynamisch in ruimte en tijd die groeien als reactie op behoeften om voedingsstoffen te verkrijgen en ze variëren vaak in functie, diameter en structuur (bijv. zijwortels, onvoorziene wortels, wortelharen)2. Heterogeniteit van wortelsystemen kan worden bestudeerd op ruimtelijke schalen van cellulair tot ecosysteemniveau en op temporele schalen van elk uur tot decadal. De dynamische en heterogene aard van wortels en hun omringende bodem, of rhizosfeer, vormt dus uitdagingen voor het vastleggen van rhizosfeerchemie in de loop van de tijd. Ondanks deze uitdaging is het noodzakelijk om wortels in hun bodemomgeving te bestuderen om deze kritische plant-bodemrelatie te karakteriseren.
De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om te onderzoeken vanwege steile zuurstofgradiënten die bestaan van bulkgrond naar de wortels, die veranderen in ruimte en tijd. Omdat wortels zuurstof nodig hebben om te respire, hebben wetlandplanten zich aangepast aan de zuurstofarme omstandigheden van wetlandgronden door aerenchym4,5te creëren. Aerenchym zijn uitgeholde corticale weefsels die zich uitstrekken van scheuten tot wortels, waardoor de verspreiding van lucht door de plant in de wortels mogelijk is. Een deel van deze lucht lekt echter in de rhizosfeer in minder gesuberiseerde delen van de wortels, met name in de buurt van laterale wortelverbindingen, minder volwassen wortelpunten en rekzones6,7,8,9. Dit radiale zuurstofverlies creëert een geoxideerde zone in de rhizosfeer van wetlandplanten die de rhizosfeer (bio-geo)chemie beïnvloedt en verschilt van de gereduceerde bulkgrond10,11,12. Om het lot en transport van voedingsstoffen en verontreinigingen in wetland rhizospheres en wortels te begrijpen, is het van cruciaal belang om de chemisch gereduceerde bulkgrond, de geoxideerde rhizosfeer en wortels van wetlandplanten te behouden voor analyse. Omdat de bulkgrond echter verminderde bodembestanddelen bevat die zuurstofgevoelig zijn, moeten wortel- en bodemconserveringsmethoden wortelstructuren behouden en zuurstofgevoelige reacties minimaliseren.
Er bestaan methoden om plantenweefsels te fixeren en de ultrastructuur te behouden voor beeldvorming, maar deze methoden kunnen niet worden toegepast om wortels die in wetlandgrond groeien chemisch te behouden. Voor onderzoeken waarbij alleen de elementaire verdeling binnen plantencellen gewenst is, worden planten doorgaans hydroponisch gekweekt en kunnen wortels gemakkelijk uit de oplossing worden verwijderd, worden bevestigd onder hogedrukbevriezing en vriessubstitutie en worden gesectied voor een verscheidenheid aan beeldvormingstoepassingen, waaronder secundaire ionenmassaspectrometrie met hoge resolutie (nanoSIMS), elektronenmicroscopie en synchrotron x-ray fluorescentie (S-XRF) analyse13, 14,15. Om Fe-plaque aan de buitenkant van wetlandwortels te onderzoeken, moeten deze hydrocultuurstudies kunstmatig fe plaquevorming induceren in oplossing16, die niet nauwkeurig de heterogeniteit van de distributie en minerale samenstelling van Fe-plaquevorming en bijbehorende elementen in situ17,18,19,20 weergeeft. Er bestaan methoden om wetlandgrond en bijbehorende micro-organismen te behouden met vriescoring21, maar het is moeilijk om wortels te verkrijgen met deze techniek. De huidige methoden om wortels in de bodem en hun rhizosferische chemie te visualiseren bestaan uit twee primaire meettypen: elementaire fluxen en totale elementaire concentratie (en speciatie). De eerste wordt meestal gemeten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT)22,23,24, waarbij grond in rhizoboxen wordt geplaatst om de plantengroei in een laboratoriumomgeving te ondersteunen en labiele elementen in de grond diffuus door een gel in een bindingslaag. Deze bindingslaag kan vervolgens worden afgebeeld om de labiele elementen van belang te kwantificeren. Deze techniek kan met succes relaties tussen wortels en de rhizosfeer24,25,26,27illustreren , maar artefacten van wortelgebonden kunnen bestaan door planten in rhizoboxen te kweken, en informatie over het wortelinterieur wordt niet vastgelegd met DGT. Dit laatste omvat het bemonsteren van de wortels en de rhizosfeer, het behoud van het monster en het direct analyseren van de elementaire verdeling op een monstersectie. Voor deze milieubemonstering van de wortels van wetlandplanten en hun omringende rhizosfeer is een zorgvuldige monsterbehandeling vereist om artefacten van monstervoorbereiding te voorkomen.
Hier wordt een protocol beschreven dat wortelstructuren en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Flash-freezing kan de transformaties van zuurstofgevoelige oplossingen drastisch vertragen, maar kan wortels beschadigen en mobilisatie veroorzaken wanneer monsters uitdrogen. Slam-freezing waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken die voorgekoeld zijn met vloeibare stikstof, minimaliseert echter wortelschade en monstervervorming28. De geconserveerde monsters worden vervolgens ingebed in een epoxyhars die As speciation20,29 behoudt en kan worden gesneden en gepolijst voor beeldvorming van wortels in hun rhizosfeergrond. De monsters in dit rapport werden geanalyseerd door S-XRF chemische speciatie beeldvorming na dunne doorsnede. Er kunnen echter ook andere beeldvormingstechnieken worden gebruikt, waaronder laserablatie-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS), deeltjesgeïnduceerde röntgenemissie (PIXE), secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) en laser geïnduceerde breakdown spectroscopie (LIBS) beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een protocol voor het verkrijgen van geconserveerde bulkgrond + rhizobolletjes van natlandplantwortels met behulp van een slam-freezing-techniek die kan worden gebruikt voor elementaire beeldvorming en / of chemische speciatiemapping.
Er zijn verschillende voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande methoden. Ten eerste maakt deze methode het gelijktijdige onderzoek van wortels en de omliggende rhizosfeer mogelijk. Momenteel bestaan er methoden om wortels uit h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen een gezamenlijke zaadbeurs aan Seyfferth en Tappero om de samenwerking tussen de Universiteit van Delaware en het Brookhaven National Laboratory te ondersteunen. Delen van dit onderzoek maakten gebruik van de XFM (4-BM) Beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse Office of Science User Facility van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) die in het kader van contractnr. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere – roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -. A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
