Elementel Görüntüleme için Sulak Alan Köklerini ve Rizosferleri Koruma Yöntemi
Summary
Örnek bir tür olarak pirinç(Oryza sativa L.) kullanarak sulak alanlardan bozulmamış kökleri ve çevresindeki rizosfer toprağını örnekleme, koruma ve bölümleme protokolünü açıklıyoruz. Numune korunduktan sonra senkrotron X-ışını floresan (XRF) kimyasal spektrasyon görüntüleme gibi elementel görüntüleme teknikleri kullanılarak analiz edilebilir.
Abstract
Kökler toprak ortamlarıyla yoğun bir şekilde etkileşime girer, ancak kökler ve çevresindeki rizosfer arasındaki bu tür etkileşimleri görselleştirmek zordur. Sulak alan bitkilerinin rizosfer kimyasının, köklerden dökme toprağa dik oksijen gradyanları nedeniyle yakalanması özellikle zordur. Burada, sulak alan bitkilerinin kök yapısını ve rizosfer kimyasını çarpma ve dondurarak kurutma yoluyla etkili bir şekilde koruyan bir protokol açıklanmaktadır. Numunenin sıvı azotla önceden soğutulan bakır bloklar arasında dondurulduğu slam-freeze, kimyasal belirtim değişikliklerini en aza indirirken flaş dondurma ile oluşabilecek kök hasarını ve numune bozulmasını en aza indirir. Numune bozulması hala mümkün olsa da, birden fazla numuneyi hızlı ve minimum maliyetle elde etme yeteneği, tatmin edici örnekler elde etme potansiyelini artırır ve görüntüleme süresini optimize eder. Veriler, bu yöntemin pirinç köklerinde ve demir plaklarla ilişkili rizosferlerde azaltılmış arsenik türlerini korumada başarılı olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, iz elementli bisiklet sürmeden fitokilatasyon uygulamalarına kadar konsantrasyon aralıklarını kapsayan çok çeşitli sulak alan ortamlarında bitki-toprak ilişkilerinin çalışmaları için benimsenebilir.
Introduction
Kökler ve rizosferleri dinamik, heterojen ve bitkilerin mineral besin maddelerini ve kirleticileri nasıl elde ettiğini anlamak için kritik öneme sahiptir1,2,3. Kökler, besin maddelerinin (örneğin fosfor) ve kirleticilerin (örneğin arsenik) topraktan bitkilere taşındığı ve böylece bu sürecin anlaşılmasının gıda miktarı ve kalitesi, ekosistemin işleyişi ve fitoremediasyon üzerinde etkileri olduğu birincil yoldur. Bununla birlikte, kökler besin edinme ihtiyaçlarına yanıt olarak büyüyen uzay ve zamanda dinamiktir ve genellikle işlev, çap ve yapı bakımından değişirler (örneğin, yanal kökler, maceracı kökler, kök kılları)2. Kök sistemlerinin heterojenliği hücreselden ekosistem seviyesine kadar mekansal ölçeklerde ve saatlikten dekadale kadar zamansal ölçeklerde incelenebilir. Bu nedenle, köklerin ve çevresindeki toprakların dinamik ve heterojen doğası veya rizosfer, zaman içinde rizosfer kimyasını yakalamak için zorluklar oluşturur. Bu zorluğa rağmen, bu kritik bitki-toprak ilişkisini karakterize etmek için toprak ortamlarındaki kökleri incelemek zorunludur.
Sulak alan bitkilerinin rizosfer kimyası, kütle toprağından köklere kadar uzay ve zamanda değişen dik oksijen gradyanları nedeniyle araştırılması özellikle zordur. Köklerin solunum için oksijene ihtiyacı olduğundan, sulak alan bitkileri aerenchyma4,5oluşturarak sulak alan topraklarının düşük oksijen koşullarınaadapteolmuşlardır. Aerenchyma, sürgünlerden köklere uzanan, bitkiden köklere havanın yayılmasına izin veren içi boş kortikal dokulardır. Bununla birlikte, bu havanın bir kısmı, köklerin daha az bastırılmış kısımlarında, özellikle yanal kök kavşaklarının yakınında, daha az olgun kök uçlarında ve uzama bölgelerinde rizosfere sızar6,7,8,9. Bu radyal oksijen kaybı, sulak alan bitkilerinin rizosferinde rizosfer (biyo-jeo)kimyasını etkileyen ve azaltılmış dökme toprak10 , 11,12’denfarklı bir oksitlenmiş bölge oluşturur. Sulak alan rizosferleri ve köklerindeki besin maddelerinin ve kirleticilerin kaderini ve taşınmasını anlamak için, kimyasal olarak azaltılmış dökme toprağın, oksitlenmiş rizosferin ve sulak alan bitkilerinin köklerinin analiz için korunması önemlidir. Bununla birlikte, dökme toprak oksijene duyarlı azaltılmış toprak bileşenleri içerdiğinden, kök ve toprak koruma yöntemleri kök yapılarını korumalı ve oksijene duyarlı reaksiyonları en aza indirmelidir.
Bitki dokularını düzeltmek ve görüntüleme için ultrayapıyı korumak için yöntemler vardır, ancak bu yöntemler sulak alanda yetişen kökleri kimyasal olarak korumak için uygulanamaz. Sadece bitki hücreleri içindeki element dağılımının istendiği incelemeler için, bitkiler tipik olarak hidroponik olarak yetiştirilir ve kökler çözeltiden kolayca çıkarılabilir, yüksek basınçlı dondurma ve donma ikamesi altında sabitlenebilir ve yüksek çözünürlüklü ikincil iyon kütle spektrometresi (nanoSIMS), elektron mikroskopisi ve senkrotron X-ışını floresan (S-XRF) analizi13dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme uygulamaları içinbölümlenebilir. 14,15. Sulak alan köklerinin dışındaki Fe plaklarını araştırmak için, bu topraksız çalışmalar yapay olarak Fe plak oluşumunu teşvik etmelidir Çözelti16Fe plak oluşumunun dağılımının ve mineral bileşiminin heterojenliğini doğru bir şekilde temsil etmeyen17 , 18,19,20. Sulak alan toprağını ve buna bağlı mikroorganizmaları dondurarak korumak için yöntemler vardır21, ancak bu teknikle kök elde etmek zordur. Toprakta yetişen kökleri ve rizosferik kimyalarını görselleştirmek için mevcut yöntemler iki birincil ölçüm türünden oluşur: elemental akılar ve toplam element konsantrasyonu (ve speciation). Birincisi tipik olarak ince filmlerdeki (DGT)22 , 23,24’tekidifüzif gradyanlar kullanılarak ölçülür, burada toprak bir laboratuvar ortamında bitki büyümesini desteklemek için rhizobox’lara yerleştirilir ve topraktaki labile elemanları bir jel yoluyla bağlayıcı bir katmana yayılır. Bu bağlama katmanı daha sonra ilgi çekici labile öğelerini ölçmek için görüntülenebilir. Bu teknik, kökler ve rizosfer24 , 25,26,27arasındaki ilişkileri başarıyla gösterebilir, ancak kök sınırlayıcı eserler rhizobox’larda bitki yetiştirerek bulunabilir ve kök iç kısmı hakkındaki bilgiler DGT ile yakalanmaz. İkincisi, köklerin ve rizosferin örneklemini, numunenin korunmasını ve örnek bir bölümdeki elementel dağılımın doğrudan analizini içerir. Sulak alan bitki köklerinin ve çevresindeki rizosferin bu çevresel örneklemesi için, numune hazırlamadan elde edilen eserleri önlemek için dikkatli numune işleme gereklidir.
Burada, sulak alan bitkilerinin kök yapılarını ve rizosfer kimyasını çarpma ve dondurarak kurutma yoluyla etkili bir şekilde koruyan bir protokol açıklanmaktadır. Flaş dondurma, oksijene duyarlı solutların dönüşümlerini büyük ölçüde yavaşlatabilir, ancak köklere zarar verebilir ve numuneler kurudığında harekete geçirilmesine neden olabilir. Bununla birlikte, numunenin sıvı nitrojen ile önceden soğutulan bakır bloklar arasında dondurulduğu slam dondurma, kök hasarını ve numune bozulmasını en aza indirir28. Korunmuş numuneler daha sonra speciation20 , 29olarak koruyan verizosfer topraklarındaki köklerin görüntülenmesi için kesilip parlatılabilen bir epoksi reçineye gömülür. Bu rapordaki örnekler ince kesitleme sonrası S-XRF kimyasal spektrasyon görüntülemesi ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, lazer ablasyon-endüktif olarak birbirine bağlı plazma kütle spektrometresi (LA-ICP-MS), parçacık kaynaklı x-ışını emisyonu (PIXE), ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS) ve lazer kaynaklı çöküntü spektroskopisi (LIBS) görüntüleme dahil olmak üzere diğer görüntüleme teknikleri de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, elementel görüntüleme ve/veya kimyasal spektasyon haritalaması için kullanılabilecek bir çarpma dondurma tekniği kullanarak sulak alan bitki köklerinin korunmuş dökme toprağı + rizosferlerini elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır.
Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre çeşitli yararları vardır. İlk olarak, bu yöntem köklerin ve çevresindeki rizosferlerin eşzamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Şu anda, toprağı yıkayarak ve kökleri 31<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Delaware Üniversitesi ve Brookhaven Ulusal Laboratuvarı arasındaki işbirliğini desteklemek için Seyfferth ve Tappero’ya ortak tohum hibesi verildiğini kabul ediyorlar. Bu araştırmanın bazı bölümlerinde, Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından Brookhaven Ulusal Laboratuvarı tarafından DOE Bilim Ofisi için işletilen ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi Olan Ulusal Senkrotron Işık Kaynağı II’nin XFM (4-BM) Beamline’ı kullanılmıştır. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere – roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -. A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
