Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

Fondo
Los recientes desarrollos en crio-microscopía electrónica (cryo-EM) han permitido estudios estructurales de sistemas cada vez más complejos a alta resolución. Con pocas excepciones, tales estudios se han limitado a macromoléculas biológicas en equilibrio¹ o reacciones relativamente lentas². Muchos procesos in vivo ocurren en una escala de tiempo más rápida (milisegundos) y existe un creciente interés en la crio-EM resuelta en el tiempo (TrEM) en estas escalas de tiempo³. Sin embargo, la preparación convencional de muestras crio-EM por el método de borrado es demasiado lenta para TrEM de milisegundos.

El método de borrado tiene otras limitaciones además de la mala resolución del tiempo. Las proteínas y los complejos proteicos pueden sufrir desnaturalización u orientación preferida en las cuadrículas⁴. Se ha demostrado que la reducción del tiempo de exposición a la interfaz aire-agua durante la preparación de la muestra mitiga la orientación preferida y la desnaturalización de^{proteínas 5,6}. Por lo tanto, la rápida preparación de la rejilla no solo permite trEM de milisegundos, sino que también puede mejorar la calidad de la red.

Actualmente, hay tres enfoques diferentes para la preparación automatizada de la red. El primer enfoque utiliza un alfiler o capilar que contiene una pequeña cantidad de muestra. Después de establecer el contacto entre el líquido y la superficie de la rejilla, la muestra se “escribe” en la rejilla^7,8. El proceso de aplicación de muestra es relativamente lento y tarda unos segundos. Un enfoque alternativo utiliza la generación controlada de gotas mediante un dispensador piezoeléctrico y rejillas auto-absorbentes⁹. Esto permite una dispensación más rápida para congelar los tiempos, pero todavía está limitado por la caída y la velocidad de absorción (que actualmente alcanza los 54 ms). El enfoque más rápido hasta ahora es el enfoque de pulverización directa, en el que la muestra se atomiza en una boquilla de pulverización y las gotas pequeñas (~ 10 – 20 μm) y rápidas (> 5 m / s) se extienden al contacto con la rejilla crio-EM. La muestra pulverizada se puede generar a través de diferentes vías como atomizadores airblast, ondas acústicas superficiales o humidificadores ultrasónicos^{10,11, 12,13.} En nuestra experiencia, el espesor del hielo con el enfoque de pulverización directa es mayor, pero la pulverización directa permite que la dispensación congele los tiempos de congelación < 10 ms.

Este protocolo describe paso a paso cómo se puede utilizar un dispositivo EM (TED) con respuesta al tiempo equipado con una boquilla de pulverización microfluídica para preparar rejillas en una escala de tiempo rápida^14,15. El dispositivo se ha utilizado para preparar rejillas con un tiempo de retardo mínimo de 6 ms entre la aplicación de la muestra y la congelación y para mezclar y congelar rápidamente dos muestras. El diseño del TED se basa en una versión anterior¹⁶ y es similar a otros dispositivos crio-EM resueltos en el tiempo basados en pulverización¹⁷.

En primer lugar, se describen las cuatro partes principales de la configuración de TED. El núcleo del TED es la unidad de manejo de líquidos, que es responsable de la aspiración y dispensación de muestras. Un émbolo neumático mueve la rejilla a través del aerosol hacia el etano líquido. La generación del spray se logra con boquillas de pulverización microfluídica y la congelación se realiza en un recipiente de etano líquido, que se describen brevemente. Por último, se destacan las características adicionales para controlar el entorno de la red, especialmente la humedad. Esto es seguido por protocolos detallados para el funcionamiento del dispositivo y para la realización de experimentos TrEM. Se dan resultados representativos para una rápida preparación de la cuadrícula y un simple experimento TrEM.

Configuración experimental

La unidad de manipulación de líquidos
El sistema de manipulación de líquidos del TED está formado por tres bombas de accionamiento de jeringas («bombas 1 – 3»), cada una equipada con una válvula rotativa (Figura 1). Una fuente de alimentación proporciona bombas 1 – 3 con 24 V DC. La comunicación con el software de control (escrito en Visual Basic y C++) es a través de una interfaz RS232 para bombear 1. Los comandos se distribuyen a través de los puertos de expansión de E/S serie desde la bomba 1 hasta las bombas 2-3. Las bombas 1-3 están equipadas con jeringas de vidrio (‘jeringas 1-3’, aquí usamos jeringas de volumen muerto de 250 μL/cero). Cada válvula tiene dos posiciones, ‘cargar’ y ‘dispensar’. La posición de “carga” se utiliza para aspirar la muestra en la jeringa. Una pieza corta (~ 3 – 4 cm) de tubo sin bridas ETFE/ETFE de 1/16″ O.D., 0.01′′ I.D. se conecta a través de accesorios sin bridas ETFE/ETFE a la posición de “carga” de las válvulas 1-3. Esta pieza corta de tubo llega al depósito de muestra (generalmente un tubo de plástico de 1.5 ml o 0.5 ml). La posición de “dispensación” conduce a la boquilla de pulverización. La conexión entre la salida de “dispensación” y la boquilla de pulverización se realiza mediante tubos de PE (~ 20-30 cm de longitud, 0.043 “O.D., 0.015” I.D.), con una pieza corta de tubo de manga (~ 0.5 cm) y accesorios sin brida ETFE / ETFE.

El émbolo neumático
El TED utiliza un émbolo neumático para acelerar la rejilla y moverla a través del aerosol de muestra hacia el recipiente de etano líquido. Las pinzas de presión negativa sujetan la rejilla, atornilladas en un soporte casero que está montado en un cilindro neumático de doble varilla(Figura 2A).

La presión se suministra desde un gran cilindro de gas nitrógeno (tamaño W), equipado con un regulador multietapa (0 – 10 bar, ‘presión principal’). Los tubos flexibles de PVC reforzado (12 mm O.D.) conectan el regulador a un colector de 12 puertos donde se entrega nitrógeno presurizado a la boquilla y al émbolo neumático. El flujo de gas a través de la boquilla es constante, regulado directamente en el cilindro de nitrógeno (presión principal). La conexión a la boquilla se realiza con tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.), una pieza corta de tubo de PE (~ 8 cm de longitud, 0.043″ O.D., 0.015″ I.D.) y conectores apropiados. La presión sobre el émbolo neumático se controla a través de una válvula solenoide. Los tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.) conectan la válvula solenoide con un regulador y el émbolo neumático, para permitir una presión de inmersión reducida (≤ presión principal). La válvula solenoide está controlada por computadora. En la figura 2Bse ofrece una descripción general esquemática de la configuración.

Tenga en cuenta que con esta configuración la presión de inmersión es siempre igual o menor que la presión del gas de pulverización (presión principal). Sin embargo, la configuración se puede cambiar fácilmente incorporando un segundo regulador aguas arriba de la boquilla de pulverización para permitir velocidades de inmersión más altas a baja presión de gas de pulverización. Las altas presiones (>> 2 bar) pueden dañar la boquilla de pulverización PDMS.

PRECAUCIÓN: Este es un sistema presurizado y la “presión principal” siempre debe ser de < 7 bar.

Las presiones entre 0,5 y 2 bar se utilizan típicamente para el émbolo neumático y muestran una relación aproximadamente lineal entre la presión y la velocidad (en la posición vertical de la pulverización). Las velocidades de inmersión se miden con un osciloscopio, conectado en línea con un potenciómetro deslizante (10 kΩ) y en paralelo con una resistencia de 2 kΩ(Figura 2C). Una fuente de alimentación proporciona al potenciómetro 9 V DC. Mientras que la velocidad de inmersión aproximada se establece antes del experimento estableciendo la presión de inmersión, el potenciómetro proporciona una lectura precisa de la velocidad después del experimento.

Boquillas de pulverización y recipiente de etano líquido
La fabricación y el funcionamiento de boquillas virtuales dinámicas de gas para la entrega de muestras a base de pulverización se ha descrito en otra parte en detalle¹⁵. Como se describió anteriormente, las salidas de “dispensación” de las válvulas 1-3 están conectadas a las entradas de líquido de la boquilla(Figura 3A). El gas de pulverización presurizado está conectado a la entrada de gas de la boquilla. Las entradas en las boquillas de pulverización PDMS son tales que los tubos de PE O.D. de 0.043 “se pueden usar directamente sin la necesidad de accesorios. Nuestro diseño de boquilla contiene una geometría ‘jet-in-jet’ para la mezcla de dos muestras, similar al dispositivo descrito en la ref.^18. Un esquema del diseño se muestra en la Figura 3B,una imagen microscópica de una boquilla se muestra en la Figura 3C. El diseño del dispositivo microfluídico requiere el uso de tres jeringas para mezclar dos muestras. La boquilla de pulverización se coloca típicamente a una distancia de 1-1.5 cm de la rejilla (durante la aplicación de la muestra).

Utilizamos etano líquido como criógeno, en un recipiente líquido de etano / nitrógeno como se utiliza para el método de borrado estándar. El posicionamiento vertical de la copa de etano líquido se logra con una plataforma elevadora de laboratorio.

Control del entorno de pulverización y rejilla
El émbolo y la boquilla de pulverización están contenidos dentro de una caja de PMMA (vidrio acrílico) hecha a medida con una puerta doble(Figura 4A). La alta humedad relativa dentro de la caja se logra mediante un sistema de humidificación de aire en la parte posterior del TED(Figura 4B). El aire es suministrado por una bomba y alimentado a un primer recipiente de 10″(normalmente utilizado para la purificación de agua debajo del fregadero). El recipiente está lleno de un nivel bajo (~ 5-10 cm) de agua y también alberga una unidad humidificadora. La alimentación de red del humidificador está controlada por un controlador digital de humedad / temperatura y un sensor de humedad / temperatura ubicado dentro de la caja de vidrio acrílico. El controlador está configurado para apagar la bomba cuando la humedad relativa alcanza ≥ 90 %. El aire humidificado del primer recipiente se bombea a través de un difusor, se sumerge en agua en un segundo recipiente de 10″y luego entra en la caja de vidrio acrílico.

PRECAUCIÓN: Debido a que la muestra está aerosolizada en la boquilla de pulverización, las muestras biológicas o químicas peligrosas no son adecuadas como muestras.

La secuencia de ejecución
El botón Ejecutar script del software de control inicia la secuencia de ejecución. Esta secuencia de comandos puede ser predefinido en un archivo de script y alterado a través del software. Las variables más importantes se explican aquí:

Velocidad de pulverización: La velocidad de pulverización determina el caudal de líquido utilizado por la bomba de jeringa. El caudal se puede calcular de la siguiente manera: Los motores de la bomba de jeringa utilizados aquí tienen un tamaño de paso fijo. El rango completo de la bomba se divide en 48,000 pasos. El segundo factor importante es el volumen de la jeringa. Normalmente utilizamos jeringas de 250 μL. La velocidad de pulverización en el software de control se establece como número de pasos/segundo. Una velocidad de pulverización de 1000 pasos/segundo corresponde a:

Volumen de pulverización: El volumen de pulverización determina el volumen total a rociar. Por lo tanto, también determina la duración del aerosol. El volumen de pulverización en el software de control se establece como una serie de pasos. Un volumen de pulverización de 2000 pasos, a una velocidad de pulverización de 1000 pasos / segundo, conduce a una duración de pulverización de 2 s y un volumen total de 10,4 μL.

Tiempo de pre-pulverización: Esta variable define el tiempo entre el inicio de la pulverización y la inmersión. Es importante elegir el tiempo de retardo de modo que el spray tenga tiempo suficiente para estabilizarse antes de sumergir la rejilla. Por lo general, el aerosol se administra de 1.5 a 4 s para estabilizarse antes de que la rejilla se hunda. El spray se mantiene hasta que la rejilla se ha movido. Por lo general, el flujo de líquido (y por lo tanto el aerosol) se detiene de 0,5 a 1 s después de que la rejilla se ha hundido. Usando una velocidad de pulverización de 1000 pasos / s y un volumen de pulverización de 2000 pasos, un tiempo típico de pre-pulverización es de 1.5 s, por ejemplo.

Una secuencia ejemplar de comandos se muestra en la Figura 5A,la posición de la cuadrícula a lo largo del tiempo se ilustra en la Figura 5B.