Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle
Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation d’un dispositif de fabrication de grille rapide pour la fabrication rapide de grilles et pour le mélange et la congélation rapides afin de mener des expériences résolues dans le temps.
Abstract
Le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) se développe rapidement avec de nouveaux équipements et algorithmes de traitement, produisant des structures à plus haute résolution et des informations sur des systèmes plus difficiles. La préparation des échantillons pour le cryo-EM connaît une révolution similaire avec de nouvelles approches en cours de développement pour remplacer les systèmes de transfert traditionnels. Il s’agit notamment de l’utilisation de distributeurs piézo-électriques, de l’impression d’épingles et de la pulvérisation directe. À la suite de ces développements, la vitesse de préparation de la grille passe de quelques secondes à quelques millisecondes, offrant de nouvelles opportunités, en particulier dans le domaine de la cryo-EM à résolution temporelle où les protéines et les substrats peuvent être rapidement mélangés avant la congélation en plongée, piégeant les états intermédiaires de courte durée. Nous décrivons ici, en détail, un protocole standard pour la fabrication de grilles sur notre dispositif EM interne à résolution temporelle à la fois pour la préparation rapide standard de la grille et également pour les expériences résolues dans le temps. Le protocole exige un échantillon d’environ 50 μL à des concentrations de ≥ 2 mg/mL pour la préparation de 4 grilles. Le délai entre l’application de l’échantillon et la congélation peut être aussi bas que 10 ms. L’une des limites est l’augmentation de l’épaisseur de la glace à des vitesses plus rapides et par rapport à la méthode de buvardage. Nous espérons que ce protocole aidera d’autres personnes à concevoir leurs propres dispositifs de fabrication de grilles et ceux qui s’intéressent à la conception d’expériences résolues dans le temps.
Introduction
Arrière-plan
Les développements récents en cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont permis des études structurelles de systèmes de plus en plus complexes à haute résolution. À quelques exceptions près, ces études ont été limitées à des macromolécules biologiques à l’équilibre1 ou à des réactions relativement lentes2. De nombreux processus in vivo se produisent sur une échelle de temps plus rapide (millisecondes) et il y a un intérêt croissant pour la cryo-EM résolue dans le temps (TrEM) sur ces échelles de temps3. Cependant, la préparation conventionnelle des échantillons cryo-EM par la méthode de buvardage est trop lente pour la milliseconde TrEM.
La méthode de transfert a d’autres limitations que la mauvaise résolution du temps. Les protéines et les complexes protéiques peuvent souffrir de dénaturation ou d’orientation préférée sur les grilles4. Il a été démontré que la réduction du temps d’exposition à l’interface air-eau pendant la préparation de l’échantillon atténue l’orientation préférée et la dénaturation des protéines5,6. Ainsi, la préparation rapide du réseau permet non seulement une trEM milliseconde, mais peut également améliorer la qualité du réseau.
Actuellement, il existe trois approches différentes pour la préparation automatisée du réseau. La première approche utilise une épingle ou un capillaire qui contient une petite quantité d’échantillon. Après avoir établi le contact entre le liquide et la surface de la grille, l’échantillon est « écrit » sur la grille7,8. Le processus d’application de l’exemple est relativement lent et prend quelques secondes. Une approche alternative utilise la génération contrôlée de gouttelettes par un distributeur piézoélectrique et des grilles à mèche automatique9. Cela permet une distribution plus rapide pour geler les temps, mais est toujours limité par la vitesse des gouttelettes et de l’évacuation (atteignant actuellement 54 ms). L’approche la plus rapide jusqu’à présent est l’approche par pulvérisation directe, dans laquelle l’échantillon est atomisé dans une buse de pulvérisation et les petites gouttelettes (~ 10 – 20 μm) et rapides (> 5 m / s) se propagent au contact de la grille cryo-EM. La pulvérisation d’échantillon peut être générée par différentes méthodes telles que des atomiseurs de souffle d’air, des ondes acoustiques de surface ou des humidificateurs à ultrasons10,11,12,13. D’après notre expérience, l’épaisseur de la glace avec l’approche de pulvérisation directe est plus grande, mais la pulvérisation directe permet aux distributeurs de geler des temps < 10 ms.
Ce protocole décrit étape par étape comment un dispositif EM à résolution temporelle (TED) équipé d’une buse de pulvérisation microfluidique peut être utilisé pour préparer des grilles sur une échelle de temps rapide14,15. L’appareil a été utilisé pour préparer des grilles avec un délai minimum de 6 ms entre l’application de l’échantillon et la congélation et pour mélanger et congeler rapidement deux échantillons. La conception du TED est basée sur une version précédente16 et est similaire à d’autres dispositifs cryo-EM à résolution temporelle basés sur la pulvérisation17.
Tout d’abord, les quatre parties principales de la configuration TED sont décrites. Le cœur du TED est l’unité de manipulation des liquides, qui est responsable de l’aspiration et de la distribution des échantillons. Un piston pneumatique déplace la grille à travers la pulvérisation dans l’éthane liquide. La génération du spray est réalisée avec des buses de pulvérisation microfluidiques et la congélation est effectuée dans un récipient d’éthane liquide, qui sont décrits brièvement. Enfin, les fonctionnalités supplémentaires pour contrôler l’environnement du réseau, en particulier l’humidité, sont mises en évidence. Ceci est suivi de protocoles détaillés pour le fonctionnement de l’appareil et pour la réalisation d’expériences TrEM. Des résultats représentatifs sont donnés pour une préparation rapide de la grille et une expérience TrEM simple.
Configuration expérimentale
L’unité de manutention des liquides
Le système de traitement des liquides du TED est formé de trois pompes d’entraînement à seringue (« pompes 1 à 3 »), chacune équipée d’une vanne rotative(Figure 1). Une alimentation fournit des pompes 1 – 3 avec 24 V DC. La communication avec le logiciel de contrôle (écrit en Visual Basic et C++) se fait via une interface RS232 pour pomper 1. Les commandes sont distribuées via les ports d’extension d’E/S série de la pompe 1 à la pompe 2-3. Les pompes 1-3 sont équipées de seringues en verre (« seringues 1-3 », nous utilisons ici des seringues de 250 μL / zéro volume mort). Chaque vanne a deux positions, « charger » et « distribuer ». La position de « charge » est utilisée pour aspirer l’échantillon dans la seringue. Une pièce courte (~ 3 – 4 cm) de 1/16 » O.D., 0.01′′ I.D. FeP tube est connectée via des raccords sans bride ETFE / ETFE à la position de « charge » des vannes 1-3. Ce court morceau de tube atteint le réservoir d’échantillon (généralement un tube en plastique de 1,5 mL ou 0,5 mL). La position « distribuer » conduit à la buse de pulvérisation. La connexion entre la sortie de distribution et la buse de pulvérisation est réalisée par des tubes en PE (~ 20-30 cm de longueur, 0,043 « O.D., 0,015 » I.D.), avec un court morceau de tube à manchon (~ 0,5 cm) et des raccords sans bride ETFE / ETFE.
Le piston pneumatique
Le TED utilise un piston pneumatique pour accélérer la grille et la déplacer à travers le spray d’échantillon dans le récipient d’éthane liquide. Des pinces à pression négative maintiennent la grille, vissée dans un support construit à la maison qui est monté sur un cylindre pneumatique à double tige(Figure 2A).
La pression est fournie par une grande bouteille d’azote gazeux (taille W), équipée d’un régulateur à plusieurs étages (0 – 10 bar, « pression principale »). Un tube flexible en PVC renforcé (12 mm O.D.) relie le régulateur à un collecteur à 12 ports où l’azote sous pression est livré à la buse et au piston pneumatique. Le débit de gaz à travers la buse est constant, régulé directement au niveau de la bouteille d’azote (pression principale). La connexion à la buse est faite avec un tube en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un court morceau de tube PE (~ 8 cm de longueur, 0,043″O.D., 0,015 » I.D.) et des connecteurs appropriés. La pression sur le piston pneumatique est contrôlée par une électrovanne. Des tubes en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) relient l’électrovanne à un régulateur et au piston pneumatique, pour permettre une pression de plongée réduite (≤ pression principale). L’électrovanne est contrôlée par ordinateur. Une vue d’ensemble schématique de la configuration est donnée à la figure 2B.
Notez qu’avec cette configuration, la pression de plongée est toujours égale ou inférieure à la pression du gaz de pulvérisation (pression principale). Cependant, la configuration peut facilement être modifiée en incorporant un deuxième régulateur en amont de la buse de pulvérisation pour permettre des vitesses de plongée plus élevées à faible pression de gaz de pulvérisation. Des pressions élevées (>> 2 bar) peuvent endommager la buse de pulvérisation PDMS.
ATTENTION: Il s’agit d’un système pressurisé et la « pression principale » doit toujours être < 7 bars.
Des pressions comprises entre 0,5 et 2 bars sont généralement utilisées pour le piston pneumatique et montrent une relation approximativement linéaire entre la pression et la vitesse (à la position verticale de la pulvérisation). Les vitesses de plongée sont mesurées à l’avec un oscilloscope, connecté en ligne avec un potentiomètre à glissière (10 kΩ) et en parallèle avec une résistance de 2 kΩ(Figure 2C). Une alimentation fournit le potentiomètre avec 9 V DC. Alors que la vitesse de plongée approximative est réglée avant l’expérience en réglant la pression de plongée, le potentiomètre donne une lecture précise de la vitesse après l’expérience.
Buses de pulvérisation et récipient d’éthane liquide
La fabrication et le fonctionnement de buses virtuelles dynamiques au gaz pour la distribution d’échantillons par pulvérisation ont été décrits ailleurs en détail15. Comme décrit ci-dessus, les sorties de distribution des vannes 1 à 3 sont connectées aux entrées de liquide de la buse (Figure 3A). Le gaz de pulvérisation sous pression est connecté à l’entrée de gaz de la buse. Les entrées dans les buses de pulvérisation PDMS sont telles que les tubes en PE O.D. de 0,043 ” peuvent être utilisés directement sans avoir besoin de raccords. Notre conception de buse contient une géométrie « jet-in-jet » pour le mélange de deux échantillons, similaire au dispositif décrit à la réf.18. Un schéma de la conception est montré à la figure 3B, une image microscopique d’une buse est montrée à la figure 3C. La disposition du dispositif microfluidique nécessite l’utilisation de trois seringues pour mélanger deux échantillons. La buse de pulvérisation est généralement positionnée à une distance de 1 à 1,5 cm de la grille (pendant l’application de l’échantillon).
Nous utilisons de l’éthane liquide comme cryogène, dans un récipient liquide éthane/azote tel qu’utilisé pour la méthode de buvard standard. Le positionnement vertical de la tasse d’éthane liquide est réalisé avec une plate-forme élévatrice de laboratoire.
Contrôle de l’environnement de pulvérisation et de grille
Le piston et la buse de pulvérisation sont contenus dans une boîte en PMMA (verre acrylique) construite sur mesure avec une double porte(Figure 4A). Une humidité relative élevée à l’intérieur de la boîte est obtenue par un système d’humidification de l’air à l’arrière du TED(Figure 4B). L’air est fourni par une pompe et introduit dans un premier bidon de 10 pouces (généralement utilisé pour la purification de l’eau sous l’évier). Le bidon est rempli d’un niveau d’eau bas (~ 5-10 cm) et abrite également un humidificateur. L’alimentation secteur de l’humidificateur est contrôlée par un régulateur numérique d’humidité / température et un capteur d’humidité / température situé à l’intérieur de la boîte en verre acrylique. Le contrôleur est réglé pour éteindre la pompe lorsque l’humidité relative atteint ≥ 90 %. L’air humidifié du premier bidon est pompé à travers un diffuseur, immergé dans l’eau dans un deuxième bidon de 10 pouces, puis pénètre dans la boîte en verre acrylique.
ATTENTION : Étant donné que l’échantillon est aérosolisé dans la buse de pulvérisation, les échantillons biologiques ou chimiques dangereux ne conviennent pas comme échantillons.
La séquence d’exécution
Le bouton Exécuter le script du logiciel de contrôle lance la séquence d’exécution. Cette séquence de commandes peut être prédéfinie dans un fichier de script et modifiée via le logiciel. Les variables les plus importantes sont expliquées ici :
Vitesse de pulvérisation: La vitesse de pulvérisation détermine le débit de liquide utilisé par la pompe à seringue. Le débit peut être calculé comme suit: Les moteurs de pompe à seringue utilisés ici ont une taille de pas fixe. La gamme complète de la pompe est divisée en 48 000 marches. Le deuxième facteur important est le volume de la seringue. Nous utilisons généralement des seringues de 250 μL. La vitesse de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est définie comme nombre de pas/seconde. Une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde correspond à :
Volume de pulvérisation: Le volume de pulvérisation détermine le volume total à pulvériser. Ainsi, il détermine également la durée de la pulvérisation. Le volume de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est défini en plusieurs étapes. Un volume de pulvérisation de 2000 pas, à une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde, conduit à une durée de pulvérisation de 2 s et un volume total de 10,4 μL.
Temps de pré-pulvérisation : Cette variable définit le temps entre le début de la pulvérisation et la plongée. Il est important de choisir le temps de retard de manière à ce que le spray ait suffisamment de temps pour se stabiliser avant de plonger dans la grille. Habituellement, le spray est donné 1,5 – 4 s pour se stabiliser avant que la grille ne soit plongée. Le spray est maintenu jusqu’à ce que la grille se soit déplacée. Habituellement, l’écoulement du liquide (et donc la pulvérisation) est arrêté 0,5 à 1 s après la plongée de la grille. En utilisant une vitesse de pulvérisation de 1000 pas / s et un volume de pulvérisation de 2000 pas, un temps de pré-pulvérisation typique est de 1,5 s, par exemple.
Une séquence exemplaire de commandes est illustrée à la figure 5A,la position de la grille dans le temps est illustrée à la figure 5B.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles de ce travail peuvent être utilisés pour une préparation rapide de la grille par pulvérisation directe et expériences TrEM. La préparation rapide de la grille peut être utilisée pour réduire les interactions des particules avec l’interface air-eau5. Les principales limites sont la concentration d’échantillon disponible et l’épaisseur de glace sur la grille. Dans ces limites et à condition que la qualité de l’échantillon soit bonne, le protocole produit des gril…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Molly S.C. Gravett pour ses discussions utiles et le personnel de l’installation ABSL pour son aide à la collecte de données cryo-EM. David P. Klebl est doctorant dans le cadre du programme de doctorat de 4 ans du Wellcome Trust au Astbury Centre financé par l’Université de Leeds. Les microscopes FEI Titan Krios ont été financés par l’Université de Leeds (prix UoL ABSL) et Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Ce travail a été financé par une subvention du BBSRC à Stephen P. Muench (BB / P026397/1) et soutenu par des subventions de recherche à Howard D. White de l’American Heart Association (AMR21-236078) et Howard D. White et Vitold Galkin des National Institutes of Health des États-Unis (171261).
Materials
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10×70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
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