Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

Achtergrond
Recente ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) hebben structurele studies van steeds complexere systemen met hoge resolutie mogelijk gemaakt. Op enkele uitzonderingen na zijn dergelijke studies beperkt tot biologische macromoleculen bij evenwicht¹ of relatief langzame reacties². Veel processen in vivo vinden plaats op een snellere tijdschaal (milliseconden) en er is een toenemende belangstelling voor time-resolved cryo-EM (TrEM) op deze tijdschalen³. Conventionele cryo-EM-monstervoorbereiding door de blotting-methode is echter te traag voor milliseconde TrEM.

De blotting-methode heeft andere beperkingen dan een slechte tijdresolutie. Eiwitten en eiwitcomplexen kunnen last hebben van denaturatie of voorkeursoriëntatie op roosters⁴. Het is aangetoond dat het verminderen van de blootstellingstijd aan de lucht-waterinterface tijdens de monstervoorbereiding de voorkeursoriëntatie en eiwitdenaturatie^{vermindert 5,6}. Een snelle netvoorbereiding maakt dus niet alleen milliseconde TrEM mogelijk, maar kan ook de netkwaliteit verbeteren.

Momenteel zijn er drie verschillende benaderingen voor geautomatiseerde netvoorbereiding. De eerste benadering maakt gebruik van een pin of capillair dat een kleine hoeveelheid monster bevat. Na het vaststellen van contact tussen de vloeistof en het rasteroppervlak, wordt het monster ‘geschreven’ op het raster^7,8. Het aanvraagproces van het monster is relatief traag en duurt enkele seconden. Een alternatieve aanpak maakt gebruik van gecontroleerde druppelgeneratie door een piëzo-dispenser en zelfafvoerende roosters⁹. Dit maakt een snellere afgifte mogelijk om de tijden te bevriezen, maar wordt nog steeds beperkt door druppel- en afvoersnelheid (momenteel 54 ms bereiken). De snelste aanpak tot nu toe is de directe spuitbenadering, waarbij het monster wordt verneveld in een sproeikop en de kleine (~ 10 – 20 μm) en snelle (> 5 m/s) druppeltjes zich verspreiden bij contact met het cryo-EM-rooster. De monsterspray kan op verschillende manieren worden gegenereerd, zoals luchtstraalverstuivers, akoestische oppervlaktegolven of ultrasone luchtbevochtigers^10,11,12,13. In onze ervaring is de ijsdikte met de directe spuitbenadering groter, maar direct spuiten maakt het mogelijk om de sproeitijden < 10 ms te bevriezen.

Dit protocol beschrijft stap voor stap hoe een time-resolved EM-apparaat (TED) uitgerust met een microfluïdische sproeikop kan worden gebruikt om roosters voor te bereiden op een snelle tijdschaal^14,15. Het apparaat is gebruikt om roosters voor te bereiden met een minimale vertragingstijd van 6 ms tussen het aanbrengen van het monster en het invriezen en om snel twee monsters te mengen en in te vriezen. Het ontwerp van de TED is gebaseerd op een eerdere versie¹⁶ en is vergelijkbaar met andere op spray gebaseerde tijd-opgeloste cryo-EM-apparaten¹⁷.

Eerst worden de vier belangrijkste onderdelen van de TED-opstelling beschreven. De kern van de TED is de vloeistofbehandelingseenheid, die verantwoordelijk is voor monsteraspiratie en -afgifte. Een pneumatische plunjer verplaatst het rooster door de spray naar het vloeibare ethaan. Generatie van de spray wordt bereikt met microfluïdische sproeikoppen en het invriezen gebeurt in een vloeibare ethaancontainer, die kort worden beschreven. Ten slotte worden de extra functies om de rasteromgeving te regelen, met name de luchtvochtigheid, benadrukt. Dit wordt gevolgd door gedetailleerde protocollen voor de werking van het apparaat en voor het uitvoeren van TrEM-experimenten. Representatieve resultaten worden gegeven voor een snelle rastervoorbereiding en een eenvoudig TrEM-experiment.

Experimentele installatie

De vloeistofbehandelingseenheid
Het vloeistofbehandelingssysteem van de TED wordt gevormd door drie spuitaangedreven pompen (‘pompen 1 – 3’), elk uitgerust met een roterende klep(figuur 1). Een voeding voorziet pompen 1 – 3 van 24 V DC. Communicatie met de besturingssoftware (geschreven in Visual Basic en C++) verloopt via een RS232-interface naar pomp 1. Commando’s worden verdeeld via de seriële I/O-uitbreidingspoorten van pomp 1 tot pompen 2-3. Pompen 1-3 zijn uitgerust met glazen spuiten (‘spuiten 1-3’, we gebruiken hier spuiten met een dood volume van 250 μL/nul dood volume). Elke klep heeft twee standen, ‘load’ en ‘dispense’. De ‘load’-positie wordt gebruikt om monster in de spuit te zuigen. Een kort stuk (~ 3 – 4 cm) van 1/16″ O.D., 0.01′′ I.D. FEP-buizen is via ETFE/ETFE flensloze fittingen verbonden met de ‘load’-positie van kleppen 1-3. Dit korte stukje buis reikt tot in het monsterreservoir (meestal een plastic buis van 1,5 ml of 0,5 ml). De ‘dispense’-positie leidt naar de sproeikop. Verbinding tussen de ‘dispense’ uitlaat en de sproeikop wordt gemaakt door PE-buizen (~ 20-30 cm lengte, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), met een kort stuk mouwbuis (~ 0,5 cm) en ETFE/ETFE flensloze fittingen.

De pneumatische plunjer
De TED gebruikt een pneumatische plunjer om het rooster te versnellen en door de monsterspray in de vloeibare ethaancontainer te verplaatsen. Onderdrukpincet houdt het rooster vast, geschroefd in een zelfgebouwde houder die is gemonteerd op een dubbele stang pneumatische cilinder(figuur 2A).

Druk wordt geleverd door een grote stikstofgasfles (maat W), uitgerust met een meertrapsregelaar (0 – 10 bar, ‘hoofddruk’). Flexibele versterkte PVC-buizen (12 mm O.D.) verbinden de regelaar met een 12-poorts spruitstuk waar stikstof onder druk wordt afgeleverd bij het mondstuk en de pneumatische plunjer. De gasstroom door het mondstuk is constant, direct geregeld bij de stikstofcilinder (hoofddruk). De aansluiting op het mondstuk is gemaakt met PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), een kort stuk PE-buis (~ 8 cm lengte, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) en geschikte connectoren. De druk op de pneumatische plunjer wordt geregeld door een magneetventiel. PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden de magneetklep met een regelaar en de pneumatische plunjer, om een verminderde duikdruk (≤ hoofddruk) mogelijk te maken. Het magneetventiel is computergestuurd. Een schematisch overzicht van de opstelling wordt gegeven in figuur 2B.

Merk op dat bij deze opstelling de duikdruk altijd gelijk is aan of kleiner is dan de sproeigasdruk (hoofddruk). De opstelling kan echter eenvoudig worden gewijzigd door een tweede regelaar stroomopwaarts van de sproeikop op te nemen om hogere duiksnelheden bij lage sproeigasdruk mogelijk te maken. Hoge drukken (>> 2 bar) kunnen de PDMS-sproeikop beschadigen.

LET OP: Dit is een druksysteem en de ‘hoofddruk’ moet altijd < 7 bar zijn.

Drukken tussen 0,5 en 2 bar worden meestal gebruikt voor de pneumatische plunjer en vertonen een ongeveer lineaire relatie tussen druk en snelheid (op de verticale positie van de spray). Duiksnelheden worden gemeten met een oscilloscoop, verbonden in lijn met een schuifpotentiometer (10 kΩ) en parallel met een weerstand van 2 kΩ(figuur 2C). Een voeding voorziet de potentiometer van 9 V DC. Terwijl de geschatte duiksnelheid voorafgaand aan het experiment wordt ingesteld door de duikdruk in te stellen, geeft de potentiometer een nauwkeurige uitlezing van de snelheid na het experiment.

Sproeikoppen en vloeibare ethaan container
De fabricage en werking van gasdynamische virtuele nozzles voor monsterafgifte op basis van sproeien is elders in detail beschreven¹⁵. Zoals hierboven beschreven, zijn de ‘dispense’ uitgangen van kleppen 1-3 verbonden met de vloeistofinlaten van het mondstuk(figuur 3A). Het sproeigas onder druk is aangesloten op de gasinlaat van het mondstuk. De inlaten in de PDMS-sproeikoppen zijn zodanig dat 0,043″ O.D. PE-buizen direct kunnen worden gebruikt zonder dat fittingen nodig zijn. Ons nozzle-ontwerp bevat een ‘jet-in-jet’-geometrie voor het mengen van twee monsters, vergelijkbaar met het apparaat beschreven in ref.¹⁸. Een schema van het ontwerp wordt weergegeven in figuur 3B,een microscopisch beeld van een mondstuk wordt weergegeven in figuur 3C. De lay-out van het microfluïdische apparaat vereist het gebruik van drie spuiten om twee monsters te mengen. De sproeikop wordt meestal op 1-1,5 cm afstand van het rooster geplaatst (tijdens het aanbrengen van het monster).

We gebruiken vloeibaar ethaan als cryogeen, in een vloeibare ethaan/stikstof container zoals gebruikt voor de standaard blotting methode. Verticale positionering van de vloeibare ethaanbeker wordt bereikt met een laboratoriumhefplatform.

Controle van de spuit- en roosteromgeving
De plunjer en sproeikop bevinden zich in een op maat gemaakte PMMA (acrylglas) doos met een dubbele deur(figuur 4A). Een hoge relatieve vochtigheid in de doos wordt bereikt door een luchtbevochtigingssysteem aan de achterkant van de TED(figuur 4B). Lucht wordt geleverd door een pomp en gevoerd in een eerste 10 “bus (meestal gebruikt voor waterzuivering onder de gootsteen). De bus is gevuld met een laag (~ 5-10 cm) waterniveau en herbergt ook een luchtbevochtiger. De netvoeding naar de luchtbevochtiger wordt geregeld door een digitale vochtigheids-/temperatuurregelaar en een vochtigheids-/temperatuursensor in de acrylglasdoos. De regelaar is ingesteld om de pomp uit te schakelen wanneer de relatieve vochtigheid ≥ 90% bereikt. Bevochtigde lucht uit de eerste bus wordt door een diffuser gepompt, ondergedompeld in water in een tweede 10 “-bus en komt vervolgens in de acrylglasdoos.

LET OP: Omdat het monster in de sproeikop is verneveld, zijn gevaarlijke biologische of chemische monsters niet geschikt als monsters.

De loopvolgorde
Met de knop Script uitvoeren in de besturingssoftware wordt de reeks uitgevoerd. Deze reeks opdrachten kan vooraf worden gedefinieerd in een scriptbestand en worden gewijzigd via de software. De belangrijkste variabelen worden hier uitgelegd:

Spuitsnelheid: De spuitsnelheid bepaalt het vloeistofdebiet dat door de spuitpomp wordt gebruikt. Het debiet kan als volgt worden berekend: De hier gebruikte spuitpompmotoren hebben een vaste stapgrootte. Het volledige bereik van de pomp is verdeeld in 48.000 stappen. De tweede belangrijke factor is het spuitvolume. We gebruiken meestal spuiten van 250 μL. De spuitsnelheid in de besturingssoftware wordt ingesteld op aantal stappen per seconde. Een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde komt overeen met:

Spuitvolume: Het spuitvolume bepaalt het totale te spuiten volume. Het bepaalt dus ook de duur van de spray. Het spuitvolume in de besturingssoftware is ingesteld als een aantal stappen. Een spuitvolume van 2000 stappen, bij een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde, leidt tot een spuitduur van 2 s en een totaal volume van 10,4 μL.

Pre-spray tijd: Deze variabele definieert de tijd tussen het starten van de spray en het duiken. Het is belangrijk om de vertragingstijd zodanig te kiezen dat de spray voldoende tijd heeft om te stabiliseren voordat het rooster wordt gezonken. Meestal wordt de spray 1,5 – 4 s gegeven om te stabiliseren voordat het rooster wordt ondergedompeld. De spray wordt gehandhaafd totdat het rooster is doorgetrokken. Meestal wordt de vloeistofstroom (en dus de spray) 0,5 tot 1 s gestopt nadat het rooster is ondergedompeld. Met een spuitsnelheid van 1000 stappen/s en een spuitvolume van 2000 stappen is een typische voorspuittijd bijvoorbeeld 1,5 s.

Een voorbeeldige reeks opdrachten wordt weergegeven in figuur 5A, de rasterpositie in de loop van de tijd wordt geïllustreerd in figuur 5B.