JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

جيل من مكافئات الجلد البشري الوعائية ذاتية التجميع

Published: February 12, 2021
doi:
10.3791/62125
,
1Departments of Bioengineering,University of California

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف توليد وتحليل حجمي لمكافئات الجلد البشري الوعائي باستخدام تقنيات سهلة المنال وبسيطة للثقافة على المدى الطويل. وإلى أقصى حد ممكن، يوصف الأساس المنطقي للخطوات للسماح للباحثين بالقدرة على التخصيص على أساس احتياجاتهم البحثية.

Abstract

مكافئات الجلد البشري (HSEs) هي أنسجة مصممة لبنائها نموذج البشرة والمكونات الجلدية للبشرة البشرية. وقد استخدمت هذه النماذج لدراسة تطوير الجلد، وتضميد الجراح، وتقنيات التطعيم. ولا يزال العديد من HSEs يفتقر إلى الأوعية الدموية ويتم تحليله بالإضافة إلى ذلك من خلال قسم النسيج ما بعد الثقافة الذي يحد من التقييم الحجمي للهيكل. يقدم هنا بروتوكول مباشر يستخدم مواد يمكن الوصول إليها لتوليد مكافئات الجلد البشري الوعائي (VHSE)؛ كذلك وصفها هي التصوير الحجمي وتقنيات القياس الكمي لهذه البنى. لفترة وجيزة، يتم بناء VHSEs في 12 إدراج ثقافة البئر التي تزرع الخلايا الجلدية والجلدية في هلام الكولاجين ذيل الفئران الأول. تتكون المقصورة الجلدية من خلايا ليفية وخلايا بطانة منتشرة في جميع أنحاء هلام الكولاجين. تتكون مقصورة البشرة من خلايا القرنية (خلايا البشرة الظهارية) التي تفرق في واجهة الهواء السائل. الأهم من ذلك، هذه الأساليب قابلة للتخصيص على أساس احتياجات الباحث، مع نتائج تثبت جيل VHSE مع نوعين مختلفين من الخلايا الليفية الليفية: الخلايا الليفية الجلدية البشرية (hDF) والخلايا الليفية الرئة البشرية (IMR90s). تم تطوير VHSEs ، وتصويرها من خلال المجهر confocal ، وتحليلها حجميا باستخدام البرامج الحاسوبية في 4 – و 8 أسابيع timepoints. يتم وصف عملية محسنة لإصلاح وصمة عار وصورة و VHSEs واضحة للفحص الحجمي. هذا النموذج الشامل، والتصوير، وتقنيات التحليل قابلة للتخصيص بسهولة لتلبية الاحتياجات البحثية المحددة للمختبرات الفردية مع أو بدون خبرة HSE السابقة.

Introduction

الجلد البشري يؤدي العديد من الوظائف البيولوجية الأساسية بما في ذلك العمل كحاجز المناعة / الميكانيكية، وتنظيم درجة حرارة الجسم، والمشاركة في احتباس الماء والأدوار الحسية1،2،3،4. تشريحيا، والجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان و تتكون من ثلاث طبقات رئيسية (البشرة والأدمة، ونقص الدم) وتمتلك نظام معقد من سترومال والأوعية الدموية والغدة، ومكونات الجهاز المناعي / العصبي بالإضافة إلى خلايا البشرة. وتتكون البشرة نفسها من أربع طبقات من الخلايا التي يتم تجديدها باستمرار للحفاظ على وظيفة الحاجز وغيرها من هياكل الجلد الأصلي (أي العرق والغدد الدهنية والأظافر)3. فسيولوجيا الجلد مهم في وظيفة المناعة، التئام الجروح، بيولوجيا السرطان، وغيرها من المجالات، مما يؤدي الباحثين إلى استخدام مجموعة واسعة من النماذج، من الثقافات الأحادية في المختبر إلى نماذج الحيوانات في الجسم الحي. نماذج الحيوانات توفر القدرة على دراسة التعقيد الكامل لعلم وظائف الأعضاء الجلد، ومع ذلك، النماذج الحيوانية المستخدمة عادة مثل الفئران لديها اختلافات فسيولوجية كبيرة بالمقارنة مع البشر5. وقد أدت هذه القيود، وزيادة تكلفة النماذج الحيوانية، العديد من الباحثين إلى التركيز على تطوير نماذج في المختبر التي تعكس عن كثب فسيولوجيا الجلد البشري1،6. من هذه, واحدة من أبسط أنواع النموذج هو ما يعادل البشرة البشرية (HEE; يشار إليها أيضا باسم نماذج الجلد نصف سمك) التي تتكون من الخلايا القرنية البشرة فقط على مصفوفة جلدية الخلية, ولكن التقاط التمايز البشرة والتقسيم الطبقي ينظر في الجسم الحي. وبناء على ذلك، غالبا ما يشار إلى النماذج التي تحتوي على مكونات الجلد والجلد (الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية) على أنها مكافئات للبشرة البشرية (HSE)، أو نماذج الجلد كاملة السمك، أو بنيات الجلد العضوي (OSC). لفترة وجيزة، يتم إنشاء هذه النماذج عن طريق تغليف الخلايا الجلدية داخل المصفوفات هلام وبذر خلايا البشرة على القمة. ويمكن بعد ذلك التمييز البشرة والتقسيم الطبقي يمكن أن يتحقق عن طريق وسائل الإعلام المتخصصة والتعرض للهواء7. وقد ولدت في معظم الأحيان مكافئات الجلد من خلال تقنيات التجميع الذاتي باستخدام المواد الهلامية الجلدية المصنوعة من نوع الكولاجين الأول (إما من ذيل الفئران أو أصل الجلد البقري)1،8، ولكن نماذج مماثلة أدرجت مكونات مصفوفة أخرى مثل الفيبرين9،10، الخلايا الليفية المستمدة11،12، أغشية غير البشرة13،14،15،16، المواد الهلامية المتاحة تجاريا وغيرها1،12،13،17،18،19. حاليا، هناك ما يعادل الجلد المتاحة تجاريا (كما استعرضت سابقا1،2). ومع ذلك ، يتم تطوير هذه في المقام الأول لأغراض علاجية ولا يمكن تخصيصها بسهولة لأسئلة بحثية محددة.

وقد تم تطبيق HSEs في دراسات التئام الجروح، والتطعيم، والسموم، والأمراض الجلدية / التطور11،12،13،16،8،20،21،22،23. على الرغم من أن الثقافة 3D نماذج أكثر شمولا وظائف الأنسجة البشرية مقارنة مع الثقافات 2D24, إدراج أنواع الخلايا المتنوعة التي تعكس بدقة أكبر في السكان في الجسم الحي تمكن دراسات تنسيق الخلية الخلية في الأنسجة المعقدة24,25,26. معظم HSEs تشمل فقط الخلايا الليفية الجلدية وخلايا القرنية البشرة27، على الرغم من أن بيئة الجلد في الجسم الحي تشمل العديد من أنواع الخلايا الأخرى. وقد بدأت الدراسات الحديثة بما في ذلك عدد أكبر من الخلايا السكانية; وتشمل هذه الخلايا البطانية في الأوعيةالدموية 10،28،29،30،31،32،33،34، الخلايا الدهنية في الأنسجة الجلدية الفرعية35،36، المكونات العصبية19،21، الخلاياالجذعية27،37،38، الخلايا المناعية10،39،40،41،42، وغيرها من الأمراض / السرطان نماذج محددة16،40،43،44،45،46،47. ومن المهم بشكل خاص بين هذه الأوعية الدموية; في حين أن بعض HSEs تشمل خلايا الأوعية الدموية، عموما أنها لا تزال تفتقر إلى عناصر شعرية شاملة مع الاتصال عبر الأدمة كامل10،29، تمديد الاستقرار في المختبر28،وكثافة السفينة المناسبة. وعلاوة على ذلك، عادة ما يتم تقييم نماذج HSE من خلال قسم النسيج ما بعد الثقافة الذي يحد من تحليل الهيكل ثلاثي الأبعاد ل HSEs. تحليل ثلاثي الأبعاد يسمح لتقييم الحجمي كثافة الأوعية الدموية48،49 ، فضلا عن الاختلاف الإقليمي لسمك البشرة والتمايز.

على الرغم من أن HSEs هي واحدة من النماذج العضوية الأكثر شيوعا ، إلا أن هناك العديد من التحديات التقنية في توليد هذه البنى بما في ذلك تحديد المصفوفة المناسبة خارج الخلية وكثافات الخلايا ، وصفات الوسائط ، وإجراءات واجهة سائل الهواء المناسبة ، وتحليل ما بعد الثقافة. وعلاوة على ذلك، في حين نشرت نماذج HEE وHSE بروتوكولات، لا يوجد بروتوكول مفصل يتضمن الأوعية الدموية الجلدية والتصوير الحجمي بدلا من التحليل النسيجي. يقدم هذا العمل بروتوكولا يمكن الوصول إليه لثقافة مكافئات الجلد البشري الوعائية (VHSE) من خطوط الخلايا التجارية بشكل رئيسي. تمت كتابة هذا البروتوكول ليكون قابلا للتخصيص بسهولة ، مما يسمح بالتكيف المباشر مع أنواع الخلايا المختلفة واحتياجات البحث. ومن أجل سهولة الوصول والتوافر والتكلفة، أعطيت الأولوية لاستخدام المنتجات البسيطة وتقنيات التوليد على استخدام المنتجات المتاحة تجاريا. وعلاوة على ذلك، يتم وصف طرق التصوير الحجمي المباشرة والتحديد الكمي التي تسمح بتقييم البنية ثلاثية الأبعاد ل VHSE. ترجمة هذا الإجراء إلى بروتوكول قوي ويمكن الوصول إليه يمكن الباحثين غير المتخصصين من تطبيق هذه النماذج الهامة في الطب الشخصي ، وهندسة الأنسجة الوعائية ، وتطوير الكسب غير المشروع ، وتقييم الأدوية.

Protocol

1. التحضير للثقافة ثلاثية الأبعاد إعداد مخزون الكولاجين ذيل الفئران في 8 ملغ / مل، وذلك باستخدام بروتوكولات المنشأة50،51،52. بدلا من ذلك، يمكن شراء الكولاجين ذيل الفئران من البائعين (انظر قائمة المواد) بتركيزات مناسبة.ملاحظة: الكولاجين يمكن إعدادها أو شراؤها بتركيزات مختلفة في نطاق 3-10 ملغم / مل، أو أعلى50،51،52. تفترض الحسابات في البروتوكول تركيز 8 ملغم/مل ولكن يمكن تعديلها بناء على احتياجات الباحث. توسيع خطوط الخلايا: تحتاج الخلايا البطانية والخلايا الليفية إلى أن تكون جاهزة للبذر في بداية توليد مكون الجلد ثلاثي الأبعاد للكولاجين (الخطوة 2). يجب أن تكون الكريات الكيراتينية جاهزة في اليوم السابع من الثقافة ثلاثية الأبعاد. يتطلب بناء VHSE واحد كامل 7.5 × 105 خلايا البطانية; 7.5 × 104 الخلايا الليفية؛ و 1.7 × 105 الكيراتينية لتوليد (الجدول 1).ملاحظة: هذه الكثافات مناسبة لإدخال أو ما يعادلها من زراعة الأنسجة القابلة للتغلغل بحجم 12 بئرا. يمكن توسيع كثافة الخلية وشكلها صعودا أو أسفلا بناء على احتياجات الباحث. لتوضيح, هذا المبلغ من الخلايا البطانية والخلايا الليفية سوف البذور 1-3 مكونات الجلد, في حين أن كل مكون البشرة يتطلب 1.7 × 105 keratinocytes. إجراء كافة الطرد المركزي الخلية في هذا البروتوكول لمدة 5 دقائق في 300 x g، ولكن قد يتم تقليل هذا لأنواع الخلايا أكثر هشاشة. 2. توليد مكون جلدي الكولاجين ثلاثي الأبعاد ملاحظة: الخطوة 2 إجراء حساسة للوقت ويجب إكمال في إعداد واحد. ينصح بإكمال فحص جودة مخزون الكولاجين لضمان الهلام والتجانس السليمين قبل البدء في بذر المكونات الجلدية ، انظر استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة. إعداد طبقة الكولاجين الخلية وبذرإعداد اثنين من أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.7 مل توج، واحد لدعم الخلية وواحد للأدمة الخلوية. الكميات المعطاة في هذه الخطوة سوف تعد 1 مل من 3 ملغم / مل الكولاجين (تركيز الكولاجين الهدف)، كافية ل(3) 12-حجم جيد VHSEs. يتم سرد المعادلات إذا كان التعديل ضروريا. ويمكن قياس الحجم والكثافة على حد سواء استنادا إلى احتياجات الباحث (ترد أرقام مرجعية مشتركة في الجدول 2). إلى كل أنبوب، إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة الصف 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) (أنبوب واحد سوف تسفر عن 3 VHSEs) وإضافة 8.6 ميكرولتر من 1 N NaOH. ضع أنابيب مغطاة على الثلج الرطب لتبرد لمدة 10 دقائق على الأقل.Cs = تركيز مخزون الكولاجينVو = الحجم النهائي للكولاجين اللازمةCt = تركيز الكولاجين المستهدفVs = حجم الكولاجين الأسهم اللازمة للكمية المطلوبة (Vو)Vpbs = حجم 10X PBS اللازمة لتركيز الكولاجين المستهدف (Ct)VNaOH = حجم 1N NaOH اللازمة لC tVالوسائط = حجم الوسائط أو تعليق المكالمة أو ddH2O اللازمة ل Ct إعداد 1000 و 250 ميكرولتر ماصة الإزاحة الإيجابية للاستخدام وتنحى جانبا. كما الخطوات اللاحقة حساسة للوقت، فمن المريح لتحميل نصائح ماصة وتعيين وحدات التخزين (375 ميكرولتر و 125 ميكرولتر، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد ماصة عادية 1000 ميكرولتر ل 516 ميكرولتر.ملاحظة: يمكن استبدال ماصة الإزاحة الإيجابية بمواسير طبيعية إذا لزم الأمر ، ولكن بسبب اللزوجة العالية للكولاجين وحساسية الوقت / درجة الحرارة لهذا الإجراء ، يوصى بمصبوبات الإزاحة الإيجابية للمساعدة في تحقيق نتائج بذر متسقة. إذا كنت تستخدم ماصة طبيعية، استخدم حركات بطيئة. إعداد الثقافة إدراج لوحات الآبار: استخدام ملقط معقمة لوضع ثلاثة إدراج ثقافة حجم 12 جيدا في لوحة زراعة الأنسجة 12 بئرا معقمة، ومكان في أعمدة المركز. حدد الوسائط الباردة المناسبة لأنواع الخلايا الليفية والخلايا البطانية. بعد تبريد الأنابيب المتوجة، ضع أنبوبا واحدا (للدعم الخلوي) على رف مع محتويات مرئية. اترك الأنبوب الآخر (للأدمة الخلوية) على الجليد. إزالة 8 ملغ / مل مخزون الكولاجين من التبريد ومكان على الجليد الرطب.ملاحظة: لا تستخدم الثلج الفريزر أو -20 درجة مئوية مبردات benchtop، لأن هذا سوف تجميد الكولاجين. إلى أنبوب الباردة توج، إضافة 516 ميكرولتر من وسائل الإعلام وإضافة فورا 375 ميكرولتر من الكولاجين البارد باستخدام ماصة النزوح الإيجابي 1000 ميكرولتر. الاستغناء عن الكولاجين في الحل (وليس إلى جانب الأنبوب). إزالة فورا تلميح ماصة فارغة والتحول إلى ماصة النزوح الإيجابية 250 ميكرولتر المعدة لخلط. مزيج بسرعة ولكن بلطف لمنع تشكيل فقاعة، لا إزالة تلميح من الحل، إذا كان ذلك ممكنا. مزيج حتى الحل هو من لون متجانس، والذي يأخذ عادة حوالي 5 دورات ماصة أو 10 ق (إذا كان استخدام وسائل الإعلام مع فينول الأحمر، وسوف يصبح اللون أخف وزنا وموحدة). عند الاختلاط، تأكد من الاستفادة من مواقف مختلفة من الأنبوب (أسفل وأعلى) لخلط موحدة.ملاحظة: يمكن أن يؤدي ذلك مع 516 ميكرولتر من الماء الصف ثقافة الخلية أو غيرها من السائل الصف ثقافة الخلية، ومع ذلك، فينول الأحمر من معظم وسائل الإعلام هو مؤشر جيد للخلط. استخدم إما الخلايا الليفية أو الوسائط البطانية التي تم استخدامها للتوسعات ثنائية الأبعاد. تفريق فورا 125 ميكرولتر من الكولاجين acellular على غشاء كل من إدراج ثقافة 12 بئر الثلاثة. لضمان تغطية موحدة من هلام الكولاجين acellular، صخرة الطبق. إذا كان ذلك لا يخلق تغطية غشاء موحدة ثم استخدام طرف ماصة لطلاء أساسا الغشاء عن طريق نشر الكولاجين بلطف حولها; تجنب الضغط على الغشاء. يبدأ الجيليشن على الفور تقريبا. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لضمان تغطية حتى.ملاحظة: سيكون هناك الكولاجين اللاخلايا الزائد. ومع ذلك، يمكن تقليل الحجم، حيث يمكن أن يؤدي إعداد أقل من 1 مل من تعليق الكولاجين إلى صعوبات في خلط المحلول وعدم كفاية الجليشن. على الفور نقل لوحة 12 جيدا إلى حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية للسماح لها هلام لمدة 20 دقيقة على الأقل (الكولاجين اللاخلاياي يمكن هلام لفترة أطول إذا لزم الأمر؛ خلال هذا الوقت هلام، انتقل إلى الخطوة 2.2). إزالة تعليق الكولاجين من الجليد ووضعها مرة أخرى في التبريد (الكولاجين هو الأكثر استقرارا في 4 درجة مئوية). تعليق الخلية وإعداد البذرملاحظة: بالنسبة إلى المخطط الزمني للثقافة لهذا البروتوكول، يتوافق هذا مع يوم الغمر 1 (SD1) أثناء هلام دعم الكولاجين الخليوي ، جرب واحص خطوط الخلايا البطانية والخلايا الليفية. تعليق 7.5 × 105 خلايا البطانية و 7.5 × 104 الخلايا الليفية في 258 ميكرولتر من وسائل الإعلام الخاصة بهم والجمع بين تعليق الخلية لإنشاء aliquot 516 ميكرولتر. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد الرطب حتى الاستخدام. إعداد 1000 و 250 ميكرولتر ماصة الإزاحة الإيجابية للاستخدام وتنحى جانبا. كما الخطوات اللاحقة حساسة للوقت، فمن المريح لتحميل نصائح ماصة وتعيين وحدات التخزين (375 ميكرولتر و 250 ميكرولتر، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد ماصة عادية 1000 ميكرولتر ل 516 ميكرولتر. زرع الكولاجين المحملة بالخلايا من المقصورة الجلدية بعد فترة الهلام، قم بإزالة طبق البئر ال 12 من الكولاجين الخلوي من الحاضنة.ملاحظة: إذا لم يتم تهجين هذا الكولاجين بعد 30 دقيقة، لا تستمر الإجراء كما كان هناك خطأ على الأرجح أثناء البذر أو مخزون الكولاجين قد يكون مشكلة (انظر استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة). إزالة أنبوب 1.7 مل توج من الجليد الرطب (يحتوي على 10x برنامج تلفزيوني وNaOH). ضع الأنبوب في رف بحيث تكون المحتويات مرئية. تخفيف / فتح جميع القبعات (تعليق الخلية، أنبوب توج الباردة). إزالة الكولاجين الأسهم (8 ملغ / مل) من 4 درجة مئوية التبريد ووضعه على الجليد الرطب. اترك الغطاء مفتوحا. أضف 516 ميكرولتر من تعليق الخلية المبردة إلى الأنبوب البارد المتوج. استخدام ماصة النزوح الإيجابية 1000 ميكرولتر على الفور ماصة 375 ميكرولتر من محلول الكولاجين البارد مباشرة في حل الأنبوب المتوج. طرد كل الكولاجين من ماصة في الأنبوب والتخلص من تلميح ماصة النزوح الإيجابية. قم بالتبديل فورا إلى ماصة الإزاحة الإيجابية سعة 250 ميكرولتر واخلط محلول الكولاجين. اخلط محلول الكولاجين كما تم الانتهاء منه سابقا (بسرعة ولكن بلطف لمنع تكوين الفقاعات) ، لا تقم بإزالة البقشيش من الجل إذا أمكن. مزيج حتى الحل هو متجانس (حوالي 5 دورات ماصة أو 10 ق). عند خلط تأكد من استخلاص من مواقف مختلفة من الأنبوب (أسفل وأعلى) لخلط موحدة. مرة واحدة مختلطة، ونقل فورا 250 ميكرولتر من محلول الكولاجين الخلوي على الكولاجين acellular يدعم في كل من إدراج ثقافة 12 جيدا الثلاثة. لضمان تغطية موحدة لدعم الكولاجين الخليوي، قم بهز الطبق و/أو استخدم ماصة الإزاحة الإيجابية لتحريك الكولاجين الخلوي الطازج برفق دون إزعاج الطبقة اللاخلية. على الفور نقل لوحة 12 جيدا إلى 37 درجة مئوية حاضنة ثقافة الخلية للسماح لها هلام لمدة 30 دقيقة على الأقل. ضع الكولاجين مرة أخرى في تبريد 4 درجة مئوية بعد الاستخدام. بعد 30 دقيقة من الوقت هلام، إمالة بلطف لوحة لتقييم هلام. تأكد من تماسك الكولاجين. إضافة 500 ميكرولتر و 1000 ميكرولتر من مزيج وسائل الإعلام (نصف endothelial ونصف وسائل الإعلام صيانة الخلايا الليفية) إلى الغرفة العليا والغرفة السفلى من إدراج، على التوالي (أعلى أولا، ثم أسفل لمنع الضغط الهيدروستاتيكي من دفع الكولاجين لأعلى). أضف الوسائط ببطء إلى جانب البئر ، وليس مباشرة على هلام الكولاجين ، لتقليل اضطراب الكولاجين. تأكد من غمر جل الكولاجين، أضف المزيد من الوسائط إذا لزم الأمر. ضع لوحة البئر في حاضنة الخلية لاحتضانها بين عشية وضحاها. في هذه المرحلة، تحتوي الوسائط على 10٪ FBS; وسائط الصيانة العادية لكل خط خلية (الخط الزمني و التخطيطي في الشكل 1، أ).ملاحظة: يمكن تكييف الوسائط عبر الثقافة VHSE لأنواع الخلايا المخصصة; قد يكون بعض التحسين ضروريا. تغيير الوسائط في يوم الغمر الثاني (SD2) تغيير 10٪ FBS وسائل الإعلام في الآبار VHSE إلى 5٪ FBS نصف الخلايا الليفية، وسائل الإعلام نصف البطانية تكملها مع 100 ميكروغرام / مل L-حمض الأسكوربيك. إضافة 500 ميكرولتر إلى الغرفة العليا من إدراج الثقافة على جانب البئر (مرة أخرى، إضافة بعناية إلى الجدار الجانبي لتقليل تعطيل الكولاجين) وإضافة 1000 ميكرولتر إلى الغرفة السفلى. تجديد الوسائط كل يومين (SD4 و SD6) حتى يوم الغمر 7 (SD7). استخدام ماصة يدوية لإزالة الوسائط من الآبار. استخدام الطامح ممكن ولكن يمكن أن يؤدي إلى تلف أو تدمير البناء.ملاحظة: يجب أن تتكون حمض L-الأسكوربيك الطازجة كل 2-3 أيام (يتأكسد في حل لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين وبالتالي, مما أدى إلى الإجهاد التأكسدي وتلف الخلوية في نهاية المطاف53). وهكذا، يجب تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام من SD2 حتى نهاية الثقافة VHSE منذ حمض L-الأسكوربيك موجود. فمن الأسهل لجعل مخزون من وسائل الإعلام وإضافة كمية أعدت حديثا من حمض L-الأسكوربيك إلى aliquot وسائل الإعلام كل يوم التغذية. استخدام المياه ثقافة الصف أو وسائل الإعلام كمذيب وإعداد حمض L-الأسكوربيك الطازجة في 100 ملغم / مل. حمض L-الأسكوربيك يحفز تخليق الكولاجين بواسطة الخلايا الليفية بمعدل مناسب ويعزز استقرار الكولاجين54،55،56؛ كما أنه يقلل من نفاذية بطانة الرحم ويحافظ على سلامة جدارالسفينة 56،57 ويساهم بالإضافة إلى ذلك في تكوين حاجز البشرة6،58. 3. البذر من عنصر البشرة والتعريف الطبقي يوم الغمر 7 (SD7): خلايا القرنية البذورملاحظة: الخلايا القرنية البذور لإنشاء البشرة على SD7. يمكن تغيير هذه النقطة الزمنية بناء على احتياجات الباحث. يجب ألا تتجاوز مدة ثقافة الغمر بدون الكريات الكيراتينية 9 أيام ، حيث أن الغمر الأطول غالبا ما يؤدي إلى زيادة الانكماش الجلدي. إذا حدث انكماش قبل SD7، فمن المستحسن تقصير فترة الغمر إلى 5 أيام و البشرة البذور على SD5. تحسين فترة الغمر كما هو مطلوب لتجارب معينة (راجع استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة). الخلايا القرنية الثقافة (N/TERT-120،59 أو غيرها من الخلايا المناسبة) إلى حد التقاء قبل المحاولة والبذور على VHSEs. بالنسبة للخلايا N/TERT-1 ، يجب ألا يتجاوز الالتقاء بشكل كبير 30٪ لمنع التمايز غير المطلوب للخلايا القرنية في الثقافة 2D59. لخطوط الخلايا المناسبة الأخرى، مثل الخلايا الكيراتينية البشرة البشرية الأولية، يتم استخدام حد التقاء 75-80٪ بشكل عام60. بعد المحاولة، عد وتعليق 510،000 خلية في 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز الجلد البشري المكافئ (HSE) تكملها مع 5٪ FBS (الجدول 1).ملاحظة: 510,000 خلية في 600 ميكرولتر تسمح ب 170,000 خلية/بناء عند بذر 200 ميكرولتر لكل بناء (3 VHSEs). باستخدام ماصة يدوية، وجمع وتجاهل وسائل الإعلام حاليا في القاع والغرفة العليا لكل بناء جيدا. تأكد من جمع أكبر قدر ممكن من وسائل الإعلام. جمع الوسائط التي قد تكون عالقة مباشرة تحت الغشاء نفاذية عن طريق وضع بلطف تلميح ماصة تحت الغشاء إدراج الثقافة وضرب إدراج من مكان مؤقتا. قد تكون وسائل الإعلام عالقة بسبب التوتر السطحي. تأكد من أن إدراج الجلوس شقة في آبارهم قبل المتابعة. استخدام الطامح ممكن ولكن يمكن أن يؤدي إلى تلف أو تدمير البناء. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام HSE تكملها مع 5٪ FBS إلى الغرفة السفلى من كل بئر. ثم أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الغرفة العليا لكل بئر. البذور مباشرة على سطح بناء الجلد. السماح لخلايا القرنية تسوية ل 2 ح في الحاضنة. ح اثنين بعد بذر الخلايا القرنية، إضافة بعناية 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام HSE تكملها مع 5٪ FBS إلى الغرفة العليا من كل بئر بناء؛ وسائط ماصة ببطء على جانب إدراج الثقافة. تحميل وسائل الإعلام في الغرفة العليا بعناية فائقة لعدم إزعاج keratinocytes استقر التي قد لا تكون قد التزمت بإحكام إلى هلام الكولاجين الكامنة حتى الآن. بعد تحميل الوسائط، ضع البناء مرة أخرى في الحاضنة. يوم الغمر 8/9 (SD8 أو SD9) يشكلون وسائل الإعلام HSE تستكمل مع 1٪ FBS و 100 ميكروغرام / مل L-حمض الأسكوربيك. إزالة الوسائط من كل من الغرف العلوية والسفلى باستخدام مسور يدوي. أضف وسائط 500 ميكرولتر إلى الغرفة العلوية أولا ثم 1 مل في الغرفة السفلية. (يمكن القيام بهذه الخطوة على SD8 أو SD9) يوم الغمر 9/10 (SD9 أو SD10، يجب أن يكون هذا اليوم بعد الخطوة 3.2) يشكلون مصل الحرة HSE التمايز وسائل الإعلام مع 100 ميكروغرام / مل L-حمض الأسكوربيك. إزالة الوسائط من كل من الغرف العلوية والسفلى باستخدام مسور يدوي. تحميل 500 ميكرولتر في الغرفة العليا و 1 مل في الغرفة السفلى. الهواء السائل واجهة اليوم 1 (ALI1)ملاحظة: يتم تنفيذ ALI في اليوم التالي الخطوة 3.3. ارفع كل بناء إلى واجهة سائلة الهواء (ALI) عن طريق إزالة نفايات الوسائط من الغرفة العلوية فقط. استخدام ماصة يدوية للحصول على أقرب إلى طبقة البشرة ممكن دون لمس أو إتلافه. إمالة لوحة قليلا في زوايا مختلفة لجمع وسائل الإعلام. إزالة الوسائط قدر الإمكان في هذه الخطوة. إضافة ما يقرب من 2 مل من المياه العقيمة إلى الآبار المحيطة بها في لوحة للحفاظ على رطوبة متسقة; الحفاظ على الآبار مليئة بالمياه في جميع أنحاء الثقافة. تحقق من لوحة بضع ح في وقت لاحق للتأكد من أن keratinocytes لا تزال في واجهة الهواء السائل. إذا كان هناك وسائل الإعلام في الغرفة العليا إزالته. تتبع مقدار الوسائط التي تتم إزالتها لكل بئر VHSE ، (الحجم الأولي للغرف العلوية والسفلية (1500 ميكرولتر) – تمت إزالة الوسائط = نقطة انطلاق جيدة لتغذية ALI).ملاحظة: لا تتطلب VHSEs بالضرورة نفس مستوى الوسائط لرفع الهواء؛ عادة إذا كانت بذور VHSEs معا ثم يحتاجون إلى نفس المستوى من وسائل الإعلام لرفع الهواء، ولكن هذا ليس هو الحال دائما. ضبط وحدات التخزين حسب الحاجة للحفاظ على ALI ولكن تأكد من أن مستويات الوسائط ليست منخفضة بحيث تجف VHSEs. من الأسلم توخي الحذر وإزالة كميات الوسائط الصغيرة يوميا حتى يتم تحقيق التوازن بين رفع الهواء والترطيب. علي اليوم الثاني (ALI2) من هذه النقطة فصاعدا، استخدم فقط مصل الحرة HSE وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل L-حمض الأسكوربيك. تغيير وسائل الإعلام في يوم علي 2 (ALI2). إذا كان هناك وسائط في الغرفة العلوية، قم بإزالتها وإضافتها إلى كمية الوسائط التي تمت إزالتها المسجلة سابقا. حساب حجم الوسائط المطلوبة باستخدام المعادلة في الخطوة السابقة. على سبيل المثال: إذا تمت إزالة 200 ميكرولتر من الوسائط من الغرفة العليا، فأضف 1300 ميكرولتر لإنشاء ALI (بما يصل إلى 1500 ميكرولتر – 200 ميكرولتر = 1300 ميكرولتر) استخدام حجم محسوبة لتحميل في الغرفة السفلية من كل بئر، ثم وضع لوحة مرة أخرى إلى حاضنة الخلية. تتبع حجم المستخدمة في اليوم الواحد. عند استخدام كميات الكولاجين الموصى بها في إدراج ثقافة 12 بئرا ، ينخفض النطاق المعتاد لقيم ALI بين 750 ميكرولتر و 1300 ميكرولتر. اعتمادا على تفاصيل الثقافة، قد يتغير هذا الرقم ويجب تحسينه (كما هو موضح في 3.4.2 – 4.1). 4. الصيانة الروتينية لمعادلة الجلد البشري الوعائي من ALI Day 3 (ALI3) مرورا بنقطة النهاية الثقافية: تجديد الوسائط في الغرفة السفلية كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام وسائط HSE خالية من المصل مع 100 ميكروغرام/مل من حمض L-ascorbic. استمر في ضبط مستوى الوسائط المطلوب في الغرفة السفلية ل ALI وتتبعه كما هو موضح في الخطوة 3.5.2. كما يجب أن يبقى سطح البشرة على اتصال مع الهواء، والتحقق وضبط مستوى وسائل الإعلام يوميا حتى يتم تأسيس مستويات ALI متسقة. يجب أن تبدو طبقة البشرة رطبة ، وليست جافة ، ولكن لا ينبغي أن تكون هناك وسائط مجمعة فوق البناء. وقد وفرت الثقافات مع 8 أسابيع من ALI مورفولوجيا والتعبير الأكثر اتساقا; ومع ذلك، اعتمادا على التطبيق، والثقافات من 4 إلى 12 أسابيع قد تكون مناسبة. قد تحتاج مدة الثقافة لظروف الخلايا والثقافة المختلفة إلى تحسينها.ملاحظة: تغيير الوسائط الاثنين والأربعاء والجمعة هو ممارسة جيدة. تتمتع VHSEs بصحة جيدة خلال عطلة نهاية الأسبوع ، ولكن يجب تغيير وسائل الإعلام في وقت مبكر من يوم الاثنين وفي وقت متأخر من يوم الجمعة. بعد الانتهاء تماما من الخطوات 1-4 ، اكتمال إنشاء VHSE. الخطوات 5-end من البروتوكول هي تقنيات المعالجة والتصوير الاختيارية التي تم تحسينها لهذا النوع من البناء ثلاثي الأبعاد. 5. تثبيت و permeabilization من 3D يبني ملاحظة: تم تحسين الخطوة 5 لتقنيات التصوير الخاصة بهذا البناء ثلاثي الأبعاد الموضحة في باقي البروتوكول. الخطوات التالية غير ضرورية لإنشاء VHSE. التثبيت/التهيئة إزالة جميع الوسائط بعناية من الغرف العليا والسفلى لكل بئر عند نقطة نهاية فترة الثقافة.ملاحظة: طبقة البشرة ربما هشة، والتعامل معها بعناية ولا تثير البشرة مع pipetting العدوانية. إضافة 4٪ paraformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 6.9) إلى جدار الغرفة العليا (وليس مباشرة على بناء) ومن ثم إلى الغرفة السفلى، لإصلاح مسبق لكل بناء. إضافة 1 مل لكل غرفة وفضح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تنبيه: PFA خطير ويجب التعامل معه بعناية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك حماية العين. إزالة 4٪ PFA الحل بعد 5 دقائق وإضافة 0.5٪ تريتون X 100 في 4٪ PFA الحل إلى الغرف العليا والسفلى كما هو موضح في الخطوة السابقة. يعرض لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بناء VHSE لا يتطلب بيئة معقمة من الآن فصاعدا. بعد 1 ساعة، وإزالة بعناية permeabilization / التثبيت الحل من كل من الغرف وغسل العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في التبريد 4 درجة مئوية أو وصمة عار على الفور. لتخزين العينات، قم بلف الطبق في غلاف بلاستيكي ثم أحبط لتقليل التبخر والتعرض للضوءملاحظة: نقطة إيقاف مؤقت – بعد التثبيت و permeabilization، يمكن إيقاف هذا الإجراء مؤقتا منذ العينات مستقرة لعدة أسابيع إذا تم إعدادها كما هو موضح في الخطوة 5.1.5. بدلا من ذلك، يمكن إكمال تلطيخ (كما هو موضح في الخطوة 6) مباشرة بعد الخطوة 5. 6. تلطيخ immunofluorescent من البنى 3D بناء إعدادملاحظة: VHSEs وصمة عار جيدا عند فصلها عن غشاء مسامية من إدراج الثقافة; الانفصال عن الغشاء ضروري أيضا للتصوير غير المعرقل ويمكن من تقليل الأحجام للتلطيخ. لإعداد بناء لتلطيخ immunofluorescent، بدوره إدراج رأسا على عقب ووضعه على بئر على لوحة البئر (إذا كان VHSE يقع، وسوف تقع في البئر مع برنامج تلفزيوني) (الشكل التكميلي 1A). تثبيت إدراج بيد واحدة على البئر أثناء استخدام ملقط تلميح غرامة و / أو سكين الدقة لقطع حوالي نصف محيط الغشاء إدراج. قطع أقرب إلى السكن البلاستيكي ممكن مع يد لطيف لمنع الضرر من بناء VHSE. باستخدام ملقط طرف غرامة، والاستيلاء على حافة رفرف غشاء قطع وتقشير بلطف الغشاء المسامية قبالة إدراج فضلا عن بناء VHSE. القيام بذلك بعناية فائقة وببطء لمنع الأضرار التي لحقت هيكل بناء VHSE. إذا كان بناء VHSE يفصل بسهولة ثم ينبغي أن تقع في أسفل بكثير، إذا كان يحصل عالقا على جانب الغرفة ثم استخدام ملقط تلميح غرامة أو مغرفة صغيرة لنقله إلى البئر. أن تضع في اعتبارها جدا من طبقة البشرة كما هو هش عادة(الشكل التكميلي 1A).ملاحظة: في بعض الأحيان لا يخرج الغشاء بسهولة أو يخرج في قطع ، إذا حدث ذلك استخدم الأدوات لسحب الغشاء بعناية وبناء VHSE بعيدا. تأكد من أن VHSEs لا تجف خلال هذه العملية عن طريق الغمس في PBS ، إذا لزم الأمر. بمجرد أن يكون VHSE في البئر ، تجاهل أي قطع متبقية من غشاء الإدراج والحفاظ على إدراج الثقافة في كل بئر لعقد VHSEs في وضع مغمور أثناء التلطيخ. تلطيخملاحظة: يجب أن يتم تلطيخ وما يرتبط بها من معالجة / معالجة ويغسل بلطف قدر الإمكان منذ VHSEs يمكن أن تكون هشة. إذا كانت أجزاء من البشرة ترفع ، يمكن أن تكون ملطخة القطع بشكل منفصل . الطبقات العليا من البشرة هشة وتمر بإزالة التربيع الطبيعي4، ولكن للتحليل من المهم الحفاظ على السلامة قدر الإمكان. إعداد البقع الأجسام المضادة الأولية المختارة في 700 ميكرولتر من العازلة حجب لكل بئر بناء (عادة، يمكن أن تكون جميع الأجسام المضادة الأولية في نفس محلول تلطيخ، ولكن ينبغي تأكيد هذا للأجسام المضادة الجديدة). يعمل 700 ميكرولتر لحجم 12 جيدا، ولكن يمكن تعديله لتنسيقات الثقافة الأخرى. يتم إعطاء التركيزات الموصى بها من الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع وصفة العازلة حظر في الجدول 3 (قد تكون هناك حاجة الأمثل). إزالة أي برنامج تلفزيوني من البئر باستخدام ماصة يدوية، يجب الحرص على ماصة بعيدا عن VHSEs (كما VHSEs تطفو، لا ينصح فراغ الطموح). إضافة الحل وصمة عار الأولية لكل بئر ووضع الثقافة إدراج السكن في البئر للحفاظ على VHSE غارقة في السوائل (الشكل التكميلي 1B). التفاف لوحة البئر مع غلاف بلاستيكي. احباط وصمة عار لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية التبريد دون التحريض أو هزاز (هزاز قد تضر بناء VHSE). بعد 48 ساعة، وإعداد الأجسام المضادة الثانوية والبقع الكيميائية في 700 ميكرولتر من العازلة حجب (لكل بئر). إزالة الثقافة إدراج السكن والمحلول وصمة عار الأولية ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1x، 3x لمدة 5 دقائق قبل إضافة محلول وصمة عار الثانوية. ضع الثقافة إدراج السكن مرة أخرى في البئر للحفاظ على بناء VHSE المغمورة(الشكل التكميلي 1B). يعرض لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية التبريد دون التحريض أو هزاز. بعد التعرض 48 ساعة، وإزالة محلول وصمة عار مع ماسورة يدوية وغسل بلطف 3X مع برنامج تلفزيوني. لا ماصة السوائل مباشرة على VHSEs لأنها قد تكون هشة. إعادة الترطيب مع برنامج تلفزيوني زائد ووضع الثقافة إدراج السكن مرة أخرى في البئر للحفاظ على VHSE مغمورة ورطبة أثناء التخزين (تخزين عن طريق التفاف في غلاف بلاستيكي واحباط للحد من التبخر والتعرض للضوء) المقاصة (اختيارية ومحطة طرفية)ملاحظة: المقاصة اختيارية للتصوير. إذا اكتملت، ينبغي أن يتم ذلك بعد تلطيخ / تصوير العينة تماما منذ تطهير يمنع مزيد من تلطيخ، قد يغير أداء الفلوروفور، ويمكن أن تلحق الضرر هيكل VHSE. توجد طرق متعددة لإزالة الأنسجة49،61،62 ويمكن تحسينها لمشاريع محددة. مقاصة الساليسيلات الميثيل، الموصوفة أدناه، بسيطة وفعالة على حد سواء لVHSE. يجب أن تكتمل تقنية المقاصة التالية في حاويات زجاجية ويجب أن تكون نصائح ماصة الزجاج أو البولي بروبلين (البوليسترين سوف تذوب في اتصال مع ساليسيلات الميثيل). أكمل جميع إجراءات التطهير في منطقة جيدة التهوية أو غطاء الدخان. أضف الميثانول بنسبة 100٪ إلى حاوية زجاجية ضحلة صغيرة (أطباق بيتري الزجاجية تعمل بشكل جيد). استخدام أصغر حاوية ممكنة التي تناسب بناء (لتقليل النفايات الكاشف). إزالة بناء من لوحة البئر باستخدام ملقط / مغرفة (الشكل التكميلي 1C) ومكان في حاوية مملوءة الميثانول. إضافة المزيد من الميثانول إذا لم يتم غمر البناء. الجفاف بناء VHSE في الميثانول لمدة 3 × 10 دقيقة الغمر؛ استبدال الميثانول بالكامل بعد كل الغمر وإزالة الميثانول على الفور بعد الحمام الأخير. على مدار هذا الإجراء، قد يصبح بناء أكثر مبهمة وتقلص قليلا.ملاحظة: تم تحسين هذه المدد والتكرار ولكن الميثانول وإجراءات ساليسيلات الميثيل التالية قد تحتاج إلى تخصيص، اعتمادا على شكل ثقافة محددة والبقع. مباشرة بعد إزالة الميثانول، إضافة salicylate الميثيل وغمر VHSE في 5 × 5 دقائق الغمر. استبدال الكاشف بالكامل بعد كل الغمر وترك VHSE في حل الغمر 5 للتخزين. خلال هذا الإجراء، يصبح البناء شفافا. صورة البناء أو المخزن عند درجة حرارة 4 مئوية. بعد التطهير، أكمل جميع التصوير في أقرب وقت ممكن، حيث قد تتحلل الفلوروفوريس في ساليسيلات الميثيل في غضون أيام. المقاصة يسبب البنى لتصبح هشة والتخزين الموسعة، في حين لا ينصح، يحتاج إلى فحص منتظم للتأكد من أن هناك كمية كافية من salicylate الميثيل. 7. التصوير Confocal من 3D يبني ملاحظة: التصوير من خلال البلاستيك زراعة الأنسجة لن تسفر عن نفس نوعية الصورة والتصوير من خلال الزجاج coverslip، ويصف هذا الأسلوب تلفيق بئر الزجاج القاع مخصص لمنع التجفيف أثناء التصوير confocal. عادة، وهذا يكفي لمدة 3 ساعة على الأقل من التصوير. قبل يومين من التصوير: إعداد البوليديمثيلسيلوكسيان (PDMS) إعداد PDMS48،63،64 بتركيز مقترح من [9:1] ، قاعدة: وصلة عرضية. إعداد 30 غرام من مجموع PDMS: 27 غرام من المكون الأساسي و 3 غرام من crosslinker. وضع أي وعاء خلط نظيفة على توازن الوزن وتاري المقياس. إضافة قاعدة (27 غرام) ثم إضافة crosslinker (3 غرام) لتحقيق ما مجموعه 30 غرام. قم دائما بإضافة قاعدة قبل الوصلة المتقاطعة. تحريك الحل بقوة لمدة 4 دقائق على الأقل. وهذا سيخلق فقاعات صغيرة. بعد خلط كافية، صب PDMS في طبق بيتري 100 ملم، أو حاوية مقاومة للحرارة أسفل شقة مماثلة. إزالة الغاز PDMS في غرفة فراغ حتى تختفي جميع فقاعات من خلط وPDMS واضحة. حرر الفراغ ببطء وأزل PDMS (ببطء). وضع الطبق في الفرن لعلاج بين عشية وضحاها (50-60 درجة مئوية)؛ ضمان الطبق يجلس شقة لPDMS لعلاج بالتساوي.ملاحظة: بعد المعالجة، يجب أن يكون PDMS واضحا ويجب أن يكون السطح ناعما وليس لزجا (قد يشير الالتصاق إلى عدم كفاية الخلط). قبل يوم واحد من التصوير: PDMS إعداد جيد باستخدام لكمة فولاذية أو سكين دقة محمولة باليد، لكمة أو قطع بئر دائرية من ورقة PDMS المعدة في 7.1. يجب أن يكون البئر بنفس حجم بناء VHSE. قطع التصحيح مربع حول البئر الدائري لإنشاء نظام إدارة الأداء الموحد واحد جيدا. وينبغي أن كمية 30 غرام PDMS أعدت تسفر عن أربعة آبار مخصصة على الأقل.ملاحظة: يجب أن تكون الآبار PDMS قريبة من حجم بناء VHSE. يجب أن تضيق حركة العينة أثناء التصوير. يمكن تصنيع آبار متعددة في وقت واحد وتخزينها إلى أجل غير مسمى في حاوية نظيفة. باستخدام غطاء زجاجي بحجم مماثل ل PDMS جيدا ، أضف غراء سيانواكريلات (على سبيل المثال ، الغراء الفائق) إلى السطح السفلي ل PDMS (السطح السلس الذي كان على اتصال مع طبق بيتري) ولطخة بالتساوي مع طرف ماصة يمكن التخلص منه. مركز، واضغط على PDMS جيدا على الزجاج في حين ترك نافذة زجاجية واضحة داخل دائرة لكمة (تأكد من عدم تلطيخ الغراء على نافذة العرض).ملاحظة: إذا كان متوفرا، والترابط البلازما من PDMS إلى coverslip هو بديل65،66،67. دع الغراء يجف لعدة ساعات، أو بين عشية وضحاها، قبل الاستخدام. هذه قابلة لإعادة الاستخدام حتى تنفصل عن البلى العادي.ملاحظة: لا ينصح بتلطيخ العينات في PDMS الملصقة المستخدمة بشكل جيد للتصوير. هذه الآبار عقد السوائل لعدة ساعات ولكن يمكن أن تسرب خلال تلطيخ أطول. تصوير VHSEملاحظة: إذا كان التصوير عينات غير واضحة، استخدم برنامج تلفزيوني كحل التصوير. إذا كان التصوير مع عينات مسح، استخدم salicylate الميثيل (أو الحل المقاصة المختار) كحل التصوير. إضافة بضع قطرات من محلول التصوير في PDMS جيدا والتحقق من وجود تسرب (إذا كان هناك تسرب، وإصلاحه مع نقطة / تشويه من الغراء السوبر سيانواكريلات أو استخدام بئر آخر). حافظ على حل التصوير في PDMS جيدا عند إضافة VHSE. باستخدام scoopula أو ملقط تلميح غرامة (الشكل التكميلي 1C)، إزالة بناء من لوحة 12 جيدا ومكان في PDMS جيدا على غطاء الزجاج. مكان بناء مع اتجاه الاهتمام التي تواجه نحو الهدف. على سبيل المثال، لتصوير البشرة باستخدام مجهر مقلوب، تأكد من أن البشرة تواجه لأسفل، نحو الزجاج. بدلا من ذلك، للحصول على المجهر تستقيم، ومواجهة البشرة. يتم وصف إجراءات التصوير أدناه للمجهر المقلوب ، ولكن يمكن تكييفها بسهولة للحصول على تستقيم.ملاحظة: كن حذرا عند معالجة VHSE لتجنب التلف. نقل على لوحة البئر في حالة سقوط VHSE. وعازمة، مغرفة طرف شقة هو أسهل طريقة لنقل بناء(الشكل التكميلي 1C). تأكد من أن العينة مسطحة في البئر وأنه لا يتم طي أي أجزاء من البشرة أو الأدمة تحت العينة. إذا حدث للطي، والتعامل بلطف العينة مع ملقط أو مغرفة. إضافة حل التصوير إضافية مؤقتا لتعويم VHSE قد يساعدها على تصحيح. يمكن رؤية طي العينة أو تجعيدها بالعين أو باستخدام المجهر. ملء البئر مع محلول التصوير، وذلك باستخدام ما يكفي من السوائل للحفاظ على عينة رطب؛ الكثير من السوائل سوف تطفو العينة، مما أدى إلى الحركة أثناء التصوير. يجب أن يكون البناء جالسا على نافذة الرؤية الزجاجية؛ اختبار للحركة عن طريق إمالة PDMS جيدا. إذا كان هناك حركة، وإزالة بعض السوائل. إضافة وإزالة السائل قطرة الحكمة حتى توقف الحركة. ضع شريحة زجاجية فوق البئر لتقليل التبخر أثناء التصوير(الشكل التكميلي 1D). لجلسات تصوير أطول، تحقق من العينة بشكل متكرر لضمان مستويات السوائل المناسبة. إذا كان الوصول إليها، يمكن استخدام غرفة مرطبة أثناء التصوير (على الرغم من أنه عادة ما لا يكون ضروريا). ضع عينة على مرحلة المجهر والصورة من خلال نافذة غطاء الزجاج(الشكل التكميلي 1D). تسمح هذه التقنية بما لا يقل عن 3 ح من التصوير البؤري المستمر ، ولكن يجب فحص ترطيب العينة بانتظام ، مع إضافة محلول التصوير عند الحاجة.ملاحظة: إذا تم مسح العينة، سوف salicylate الميثيل تتحلل الغراء مع مرور الوقت. يمكن إعادة ربط الغراء PDMS بين تشغيل التصوير؛ أو يمكن نقل العينة إلى آبار جديدة بشكل دوري. في الآبار مع الترابط البلازما، وهذا لن يكون مشكلة. بعد التصوير، تعويم العينة مع السائل التصوير قدر الإمكان في البئر. استخدم ملعقة أو ملقط طرف ناعم لنقل العينة إلى بئر التخزين الخاص بها. إجراء نقل أكثر من لوحة بئر في حالة سقوط العينة. يمكن إعادة استخدام كل نظام إدارة شرطة PDF بشكل جيد وأعلى غطاء زجاجي حتى ينكسر. تنظيف الزجاج السفلي قبل التصوير، داخل وخارج البئر. قبل إعادة استخدام، تحقق دائما من وجود تسرب وإصلاح مع الغراء، حسب الضرورة. تخزين العينات كما هو موضح في الخطوة 6.3.6 وإضافة برنامج تلفزيوني كل بضعة أشهر للحفاظ على؛ إذا تم مسح العينات، وتخزينها في الزجاج باستخدام salicylate الميثيل والتحقق من مستويات بانتظام. قد تتحلل العينات التي تم مسحها بسرعة (في غضون أيام) وينبغي تصويرها في أقرب وقت ممكن.

Representative Results

هنا هو تقديم بروتوكول لتوليد في المختبر الأوعية الدموية ما يعادل الجلد البشري (VHSE) باستخدام التيلوميراز عكس transcriptase (TERT) خلدت الخلايا القرنية (N/TERT-120,59),الكبار الإنسان الجلد الليفي (hDF), والخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة البشرية (HMEC-1) (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، يتم تمييز طبيعة تخصيص هذا البروتوكول من خلال إظهار أيضا توليد VHSE والاستقرار عند استخدام الخلايا الليفية الرئة المتاحة عادة (IMR90) بدلا من قوات الدفاع الذاتى. يتم إكمال إنشاء VHSE في الخطوات 1-4، في حين أن الخطوات 5-7 هي تقنيات معالجة وتصوير نقاط النهاية الاختيارية التي تم تحسينها لهذه VHSEs. من المهم ملاحظة أنه يمكن معالجة VHSEs وفقا لأسئلة بحثية محددة ولا يلزم الخطوات 5-7 لإنشاء البناء. تم الانتهاء من التصوير الحجمي والتحليل والتجسيدات ثلاثية الأبعاد لإظهار طريقة تحليل حجمي. تحافظ بروتوكولات الإعداد والتصوير الحجمية هذه على بنية VHSE على المستويين المجهري والكلي ، مما يسمح بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد شامل. توصيف البشرة والأدمة تظهر علامات immunofluorescent المناسبة للبشرة البشرية في بنيات VHSE (الشكل 2، 3). Cytokeratin 10 (CK10) هو علامة التمايز المبكر keratinocyte الذي عادة ما يمثل جميع طبقات فوقbasal في ما يعادل الجلد18،30،68 ( الشكل2). Involucrin وfilaggrin علامات التمايز في وقت متأخر في keratinocytes ووضع علامة على الطبقات فوق القاعدية العلوي في ما يعادل الجلد12،30،68،69 ( الشكل2). تم استخدام صبغة نووية فلورية حمراء بعيدة (انظر قائمة المواد) لوضع علامة على النوى في كل من البشرة والأدمة ، مع وضع علامة على العقيد الرابع في الأوعية الدموية للدم (الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4). غشاء الطابق السفلي البشرة (BM) مكونات لا يتم التعبير عنها دائما بشكل صحيح في الثقافات HSE15,16; و تلطيخ العقيد الرابع من BM لا يلاحظ باستمرار باستخدام هذا البروتوكول. وسوف تركز البحوث مكونات BM وهيكل الاستفادة من وسائل الإعلام إضافية، والخلية، والتصوير الأمثل14. على الرغم من أن التصوير البؤري من خلال الجزء الأكبر من ثقافات VHSE غالبا ما ينتج صورا عالية الدقة كافية للتحليل الحسابي للأدمة و البشرة ، فإن طريقة المقاصة الموصوفة تسمح بتصوير أعمق للأنسجة. يحسن المقاصة عمق اختراق الليزر البؤري ، ويمكن تحقيق التصوير الفعال في VHSEs إلى أكثر من 1 مم للعينات المسحة (مقارنة ب ~ 250 ميكرومتر للممسحة). تقنية المقاصة الموصوفة (جفاف الميثانول وساليسيلات الميثيل) تتطابق بما فيه الكفاية مع مؤشر الانكسار في جميع أنحاء أنسجة عينة VHSE61. السماح بمسح VHSE للتصوير المباشر من خلال البناء بأكمله دون تلاعب (على سبيل المثال ، إعادة توجيه البناء لتصوير الأدمة وال للبشرة بشكل منفصل) ،(الشكل 3). تسمح الصور الحجمية بتوليد التقديم ثلاثي الأبعاد لرسم خريطة ل الأوعية الدموية في كل بناء(الشكل 4). لفترة وجيزة ، تم التقاط مجموعات صور confocal في الجلد إلى اتجاه البشرة للعديد من المجلدات الفرعية من VHSEs للكشف عن وصمة الكولاجين الرابع (وضع علامات على جدران الأوعية) والنوى (التي تتميز بصبغة نووية فلورية حمراء بعيدة). يتم تحميل مداخن الصور في البرامج الحاسوبية (انظر قائمة المواد) ويتم استخدام خوارزمية مخصصة (استنادا إلى هذه المصادر 48،70،71،72،73،74،75)لتقديم 3D والتحديد الكمي كما هو موضح سابقا48. هذه الخوارزمية تلقائيا يقسم مكون الأوعية الدموية على أساس وصمة عار العقيد الرابع. يتم تمرير تجزئة الحجم إلى خوارزمية الهيكل العظمي على أساس مسيرة سريعة75،76،77. الهيكل العظمي يجد المركز النهائي لكل سفينة علامة العقيد الرابع ويمكن استخدام البيانات الناتجة لحساب قطر السفينة وكذلك كسر الأوعية الدموية(الشكل 4). يعد المجهر الفلوري واسع النطاق خيارا يمكن الوصول إليه إذا لم يتوفر الفحص المجهري بالليزر؛ ويمكن تصوير شبكة الأوعية الدموية و البشرة مع المجهر الفلورسنت واسعة النطاق (الشكل التكميلي 2). يمكن إجراء القياس الكمي ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير واسع النطاق ل VHSEs بدلا من الفحص المجهري بالليزر ، على الرغم من أنه قد يتطلب المزيد من التصفية وتفكيك الصور بسبب الضوء خارج الطائرة. الشكل 1:الجدول الزمني التخطيطي لجيل مكافئ للبشرة البشرية الوعائية. أ) يظهر تطور نموذج VHSE من 1) البذر المكون الجلدي، 2) بذور الكيراتينوسيت على المكون الجلدي، 3) التقسيم الطبقي الظهاري عبر واجهة سائل الهواء وصيانة الثقافة. يمكن إجراء المعالجة بعد الثقافة والتصوير الحجمي عند نقطة النهاية الثقافية. ب) صور الكاميرا من hDF VHSE macrostructure في الثقافة إدراج في نقطة النهاية ثقافتها، 8 أسابيع. مستويات مختلفة من الانكماش طبيعية ل VHSEs; يمكن تقليل الانكماش كما يصف البروتوكول. (1 & 2) عينات أقل تعاقدا. (3 & 4) المزيد من العينات المتعاقد عليها لا تزال تسفر عن عناصر الجلد المناسبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: توصيف البشرة عن طريق علامات immunofluorescent. تم التقاط جميع الصور من VHSEs في نقطة زمنية الثقافة 8wk عبر المجهر confocal. يتم وصف أساليب تلطيخ المطابق في الخطوة البروتوكول 6. توجد علامات الظهارية المناسبة في كل من HDF VHSEs (العمود الأيسر) وIMR90 VHSEs (العمود الأيمن). إنفولوكرين وفيلاغرين هي علامات التمايز في وقت متأخر من الخلايا القرنية وإثبات أن البشرة هي طبقية تماما في كل من أنواع VHSE. Cytokeratin 10 هو علامة التمايز المبكر الذي هو تحديد طبقات فوقbasal في VHSEs. تظهر النوى في مناظر متعامدة باللون الأصفر. تم تقديم صور الإسقاط القصوى المتعامدة والوجهية عبر البرامج الحاسوبية؛ يتم قياس الصور بشكل فردي مع طرح الخلفية والتصفية الوسيطة للوضوح. أشرطة المقياس هي 100 ميكرومتر (يتم إعطاء الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع وصفة عازلة حظر في المنزل في الجدول 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: مقارنة مسح مقابل مسح VHSE. تم إنشاء VHSE هذا مع IMR90s وتم التقاط الصور في نقطة زمنية للثقافة 4wk عبر المجهر confocal. يظهر الكولاجين الرابع في سماوي; تظهر النوى باللون الأرجواني؛ أرجواني في تقديم 3D مسح يمثل توطيد النوى في طبقة البشرة من VHSE. صورة VHSE غير واضحة هو مثال على تخفيف الليزر في بنيات VHSE أكثر سمكا، من خلال تطهير (الميثانول وميثيل ساليسيلات) يمكن تصوير البناء كله مع القليل / لا تخفيف الليزر من الجانب الجلد من البناء. تم تخفيض إعدادات التصوير بما في ذلك خط الليزر والكسب والثقب ل VHSE المسحة للحد من التشبع الزائد. تم الانتهاء من المقاصة والتصوير كما هو موضح في الخطوات 6 و 7 في البروتوكول. تم الانتهاء من صور الإسقاط القصوى المتعامدة والتجسيد ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج حسابي ، وتم إنشاء تقديم ثلاثي الأبعاد من صور البناء الواضحة. يتم قياس الصور بشكل فردي مع طرح الخلفية والتصفية الوسيطة للوضوح. أشرطة المقياس هي 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4:تحليل ثلاثي الأبعاد لل الوعائية داخل VHSEs. تمكن الصور الحجمية الملتقطة عبر المجهر البؤري من تحديد كمي للمعلمات الوعائية عند نقاط النهاية الثقافية من خلال تحليل الصور الحسابي. من المجلدات الفرعية VHSE ، الكشف عن وصمة الكولاجين الرابع (سماوي) علامات الجدران البطانية من الأوعية الدموية ويسمح لتقسيم الأوعية الدموية على أساس موقع الكولاجين الرابع ؛ ثم يتم هيكلة بيانات التقسيم العظمي ، ويتم العثور على مركز كل وعاء (أرجواني). وترد أمثلة من الهيكل العظمي 3D لمدة 4 أسابيع و 8 أسابيع عينات IMR90 VHSE، un-cleared. واستخدمت البيانات الناتجة عن مجموعة تجارب IMR90 VHSE لحساب أقطار السفن وكسور الأوعية الدموية لأربعة أحجام فرعية (كل منها 250 ميكرومتر في الاتجاه z) داخل كل بناء، وتم متوسط البيانات لكل VHSE ومتوسط إضافي لكل نقطة زمنية للثقافة. تظهر هذه البيانات التوازن الشبكي الوعائي الذي يمتد لمدة 4 و 8 أسابيع مع أقطار ذات صلة بجلد الإنسان الحي78، وكسر الأوعية الدموية ضمن نفس الترتيب كما هو الحال في بشرة الإنسان الحي79 (وقد ثبت أن كسر الأوعية الدموية في بنيات الكولاجين قابل للتخصيص48 ويمكن تحسينه بشكل أكبر لزيادة القيم). يتم تمثيل البيانات كوسيلة ± يعني خطأ قياسي (S.E.M); n = 3 لكل نقطة زمنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وسائط مكونات خط الخلية الليفية الجلدية البشرية (hDF) DMEM HG 5٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) 1٪ البنسلين/ستريبتومايسين (P/S) IMR90 خط الخلية الليفية DMEM / هام F12 50:50 10٪ FBS 1٪ P/S HMEC-1 خط الخلية البطانية MCDB131 وسيطة أساسية 10٪ FBS 1٪ P/S إل-جلوتامين [10 mM] عامل نمو البشرة (EGF) [10 نانوغرام/مل] هيدروكورتيزون [10 ميكروغرام/مل] N/TERT-1 خط الخلية الكيراتينية K- SFM قاعدة وسائل الإعلام 1٪ P/S استخراج الغدة النخامية البقري (BPE) [25 ميكروغرام / مل]، من مجموعة ملحق K-SFM عامل نمو البشرة (EGF) [0.2 نانوغرام/مل]، من مجموعة مكملات K-SFM كاكلين2 [0.3 mM] تمايز مكافئ للبشرة البشرية (HSE) 3:1 DMEM : هام F12 1٪ P/S 0.5 ميكرومتر هيدروكورتيزون 0.5 ميكرومتر إيسوبروترينول 0.5 ميكروغرام/مل الأنسولين الجدول 1: وصفات وسائل الإعلام. يتم إعطاء وصفات وسائل الإعلام للثقافة 2D من الخلايا الليفية الجلدية البشرية، IMR90 الخلايا الليفية، HMEC-1، وN/TERT-1 keratinocytes. تم استخدام هذه الوصفات لتوسيع خطوط الخلايا قبل توليد VHSEs. يستخدم الجلد البشري مكافئ (HSE) وسائط التمايز لتوليد VHSEs; يتم إعطاء وصفة أساسية، خلال أجزاء من ثقافة الغمر والتعريف الطبقي، ينبغي إضافة كميات مستدق من FBS كما هو موضح في الخطوة البروتوكول 3. وصفة HSE على أساس هذه المصادر11،80. تركيز مخزون الكولاجين (Cs) : 8 ملغم/مل الحجم المطلوب (Vf): 1 مل تطبيع تعديل NaOH*: 1 اكس * كل الكثير من الكولاجين يحتاج إلى اختبار لتحديد كمية NaOH اللازمة لضبط pH 7 – 7.4 تركيز الكولاجين المطلوب (ملغم/ مل) 2 3 4 5 10X برنامج تلفزيوني (Vبرنامج تلفزيوني) 0.1 0.1 0.1 0.1 مخزون الكولاجين (Vs) 0.25 0.375 0.5 0.625 1N ناوه (Vناوه) 0.00575 0.008625 0.0115 0.014375 وسائل الإعلام (Vوسائل الإعلام) 0.64425 0.516375 0.3885 0.260625 الجدول 2: جدول مرجعي لحساب الكولاجين. يعطي الجدول المرجعي تركيزات الكولاجين المرغوبة عادة محسوبة على افتراض تركيز مخزون الكولاجين 8 ملغم / مل وحجم نهائي مرغوب فيه من 1 مل؛ جميع القيم في mL. وترد المعادلات المستخدمة لحساب هذه المبالغ في الخطوة 2-2 من البروتوكول. من المهم التحقق من الحموضة لكل مخزون الكولاجين. إذا لزم الأمر، ينبغي إضافة كميات NaOH لتحقيق رقم الحموضة 7-7.4 (بعد برنامج تلفزيوني، NaOH، الكولاجين المخزون، يتم إضافة وسائل الإعلام). وقد تم تحسين البروتوكول ل VHSEs باستخدام تركيز الكولاجين 3 ملغم / مل; قد تكون التغييرات في تركيز الكولاجين ضرورية لخطوط الخلايا المختلفة / النتائج النهائية المرجوة48. الأجسام المضادة الأولية مصدر تركيز استخدام Filaggrin (AKH1) الماوس أحادي النسيلة IgG سانتا كروز;sc-66192 (200 ميكروغرام/مل) [1:250] علامة التمايز المتأخر15 إنفولوكورين أرنب متعدد النسيلة IgG بروتينتك;55328-1-AP (30 ميكروغرام/150 ميكرولتر) [1:250] علامة التمايز النهائي المتأخر15 Cytokeratin 10 (DE-K10) الماوس IgG، supernatant سانتا كروز;sc-52318 [1:350] فوق الجلد علامة14،36،59 الكولاجين الرابع أرنب متعدد النسيلة بروتينتك;55131-1-AP [1:500] جدار الأوعية الدموية البطانية67 دراق 7 إشارات الخلية; 7406 (0.3 متر في اليوم) [1:250] علامة نووية الأجسام المضادة الثانوية مصدر تركيز استخدام الماعز المضادة للأرانب IgG DyLight™ 488 مترافق إنفيتروجين; 35552 (1 ملغم/مل) [1:500] الكولاجين الرابع الثانوي المضادة الأرنب IgG (H &amp؛ L) (GOAT) الأجسام المضادة، DyLight™ 549 مترافق المواد الكيميائية المناعية في روكلاند؛ 611-142-002 [1:500] إنفولوكرين الثانوية الماعز المضادة للفأرة IgG (H &amp؛ L)، DyLight™ 488 الحرارية العلمية؛ 35502 (1 ملغم/مل) [1:500] فيلاغرين أو سيتاكراتين 10 الثانوية حظر المخزن المؤقت (500 مل) الكاشف مبلغ ddH2O 450 مل 10 × برنامج تلفزيوني 50 مل ألبوم مصل البقر (BSA) 5 جم توين 20 0.5 مل الماء البارد الأسماك الجيلاتين 1 غرام صوديوم أزيد (10٪ صوديوم أزيد في diH2O) 5 مل (تركيز نهائي 0.1٪) الجدول 3: الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع حظر وصفة العازلة. واستخدمت الأجسام المضادة المذكورة والبقع الكيميائية لتلطيخ هو مبين في الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4. تم الانتهاء من تلطيخ كما هو موضح في البروتوكول الخطوة 6 باستخدام وصفة حظر العازلة المذكورة هنا. قد تكون هناك حاجة إلى بعض الأمثل من تركيزات تلطيخ ومدة اعتمادا على تقنيات الثقافة المختارة وخطوط الخلية. الجدول التكميلي 1: قائمة المختصرات. قائمة الاختصارات المدرجة لراحة القارئ. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول. الشكل التكميلي 1: VHSE المساعدة التقنية للتعامل معها. التعامل مع VHSEs يشكل تحديا خاصة أثناء التثبيت والمعالجة والتلوين. A-D يتوافق مع التعليمات في الخطوات 5-7. A يظهر التعامل التقني لإزالة الغشاء المسامية من إدراج ثقافة لضمان تلطيخ السليم. B يوضح كيفية الحفاظ على كل VHSE مغمورة أثناء تلطيخ والتخزين. C يظهر الطريقة الأكثر أمانا وأسهل لنقل البنى إلى آبار التصوير PDMS. D يظهر VHSE يجلس في التصوير PDMS جيدا: يتم لصقها بشكل جيد PDMS إلى شريحة زجاجية في الجزء السفلي، وخلق نافذة للتصوير، يتم وضع شريحة زجاجية على رأس للحفاظ على الرطوبة من خلال تشغيل التصوير الطويل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل التكميلي 2:يمكن استخدام المجهر الفلوري القياسي واسع النطاق لتقييم VHSEs. يمكن استخدام التصوير على نطاق واسع للتصوير الحجمي للتقييم الروتيني عندما لا يتوفر الفحص المجهري بالليزر. وكمثال على ذلك، يظهر تصوير VHSEs من كلا الجانبين القاعدي والأزالي على أنه إسقاطات قصوى على الوجه وتقويم (Ortho.) . (أعلى) تم تصوير البشرة باستخدام إنفولوكرين ونوكلي كعلامات. (أسفل) تم تصوير الأوعية الدموية الجلدية باستخدام الكولاجين الرابع كعلامة. يتم طرح الصور الخلفية للوضوح. ضوء خارج الطائرة يؤدي إلى “streaking” أو “مضيئة” القطع الأثرية واضحة في وجهات النظر متعامدة. يمكن استخدام التصوير على نطاق واسع للقياس الكمي ولكنه قد يتطلب المزيد من معالجة الصور. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

وقد أظهر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لتوليد VHSEs وتحليلها ثلاثي الأبعاد. والأهم من ذلك، تعتمد هذه الطريقة على عدد قليل من التقنيات المتخصصة أو قطع المعدات، مما يجعلها في متناول مجموعة من المختبرات. علاوة على ذلك، يمكن استبدال أنواع الخلايا بتغييرات محدودة في البروتوكول، مما يسمح للباحثين بتكييف هذا البروتوكول مع احتياجاتهم المحددة.

جيليشن الكولاجين السليم هو خطوة صعبة في تأسيس ثقافة الجلد. خاصة عند استخدام الاستعدادات الخام دون تنقية، يمكن أن تؤثر الملوثات تتبع عملية الهلام. للمساعدة في ضمان الاتساق، يجب إجراء مجموعات من التجارب بنفس مخزون الكولاجين الذي سيتم استخدامه لتوليد VHSE. علاوة على ذلك ، يجب أن يحدث الجليشن بشكل مثالي عند رقم PH من 7-7.4 ، وقد تحول الملوثات النزرة رقمH. قبل استخدام أي مخزون الكولاجين، يجب إجراء هلام الخلية الممارسة في التركيز المطلوب، وينبغي قياس الحموضة قبل هلام. إن إكمال فحص جودة الكولاجين هذا قبل البدء في بذر المكونات الجلدية سيحدد المشاكل المتعلقة بالجيليشن السليم وتجانس الكولاجين قبل إعداد تجربة كاملة. بدلا من بذر الكولاجين اللاخلاياي مباشرة على إدراج الثقافة، قم بزرع بعض الكولاجين على شريط pH الذي يقيم مقياس الحموضة بأكمله وتحقق من رقم الحموضة من 7-7.4. يمكن تقييم الهلام عن طريق تطبيق قطرة من محلول هلام الكولاجين على غطاء أو لوحة بئر بلاستيكية زراعة الأنسجة (يوصى بلوحة بئر لمحاكاة الجوانب المحصورة لإدراج الثقافة). بعد وقت الهلام ، يجب أن يكون الكولاجين صلبا ، أي أنه لا ينبغي أن يتدفق عندما يميل الطبق. تحت المجهر النقيض المرحلة، يجب أن تبدو الكولاجين متجانسة وواضحة. فقاعات عرضية من بذر الكولاجين طبيعية ولكن النقط غير متبلور كبيرة من الكولاجين مبهمة داخل هلام واضح يشير إلى مشكلة المرجح بسبب عدم كفاية الاختلاط، وHH خاطئ، و / أو الفشل في الحفاظ على الكولاجين مبردة أثناء الاختلاط.

قد يتم ضبط كميات البذر الخلية والوسائط. في البروتوكول أعلاه، تم تحسين كميات الخلايا المغلفة لإدراج 12 جيدا في 7.5 × 104 الخلايا الليفية و 7.5 × 105 خلايا البطانية لكل مل من الكولاجين مع 1.7 × 105 الخلايا الكيراتينية المصنفة على رأس بناء الجلد. وقد تم تحسين كثافة الخلايا لهذا البروتوكول VHSE استنادا إلى الدراسات الأولية والبحوث السابقة التحقيق في توليد شبكة الأوعية الدموية 3D في تركيزات الكولاجين المختلفة48 وHSE جيل22،80،81. في أنظمة مماثلة، وكثافات الخلايا البطانية المنشورة هي 1.0 × 106 خلايا / مل الكولاجين48؛ غالبا ما تتراوح تركيزات الخلايا الليفية من 0.4 × 105 خلايا / مل من الكولاجين22،28،82 إلى 1 × 105 خلايا / مل من الكولاجين8،58،83،84،85؛ وتتراوح تركيزات الكيراتينوسيت من 0.5 × 105 [خلايا/سم2]80 إلى 1 × 105 [خلايا/سم2]8. يمكن تحسين كثافات الخلايا لخلايا محددة وسؤال بحثي. يمكن للثقافات ثلاثية الأبعاد مع الخلايا المتقلصة ، مثل الخلايا الليفية ، أن تتقلص مما يؤدي إلى الحد من الجدوى وفقدان الثقافة86،87. يجب إكمال التجارب الأولية لاختبار تقلص المقصورة الجلدية (التي يمكن أن تحدث مع المزيد من الخلايا الجلدية ، والخلايا الجلدية الأكثر انقباضا ، وثقافات الغمر الأطول ، أو المصفوفات الأكثر ليونة) واختبار التغطية السطحية البشرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تخصيص عدد الأيام في الغمر ومعدل خفض محتوى المصل إذا حدث انكماش جلدي مفرط أو كان هناك حاجة إلى معدل مختلف من تغطية الخلايا الكيراتينية. على سبيل المثال، إذا لوحظ انكماش خلال فترة الغمر الجلدي أو في حين أن الخلايا القرنية هي إنشاء طبقة أحادية السطح، والتحرك بسرعة أكبر من خلال عملية خفض المصل ورفع VHSEs إلى ALI يمكن أن تساعد في منع انكماش إضافي. وبالمثل، إذا كانت تغطية الكيراتينوسيت ليست مثالية، فإن تغيير عدد الأيام التي تغمر فيها VHSE دون مصل قد يساعد على زيادة تغطية أحادية البشرة والتخفيف من الانكماش منذ أن تم استبعاد المصل. يجب تحسين التغييرات في كثافة الخلايا أو اقتراحات أخرى أعلاه للثقافات وأهداف البحث المحددة.

لإنشاء التقسيم الطبقي السليم للبشرة خلال فترة واجهة سائل الهواء (ALI) ، من المهم التحقق بانتظام والحفاظ على مستويات السوائل في كل بئر بحيث يتم الاحتفاظ ب ALI والترطيب المناسب لكل بناء طوال طول الثقافة. يجب فحص مستويات الوسائط وتتبعها يوميا حتى يتم تحديد مستويات ALI متسقة. يجب أن تبدو طبقة البشرة رطبة ، وليست جافة ، ولكن لا ينبغي أن تكون هناك برك من الوسائط على البناء. خلال ALI، فإن بناء تطوير لون أبيض / أصفر مبهمة وهو أمر طبيعي. طبقة البشرة من المرجح أن تتطور بشكل غير متساو. عادة، يميل VHSEs بسبب بذر الكولاجين أو انكماش الجلد. ومن الطبيعي أيضا أن نلاحظ أعلى جزء البشرة في منتصف بناء في أصغر البنى (24 حجم البئر) وتشكيل التلال حول محيط VHSE في حجم بئر 12. انكماش البنى13 قد يغير هذه التكوينات الطوبوغرافية، و / أو قد لا يلاحظ على الإطلاق.

تلطيخ وتصوير VHSEs يدخل التلاعب الميكانيكية لVHSEs. من المهم جدا تخطيط والحد من التلاعب بكل ثقافة. عندما يكون التلاعب ضروريا، حافظ على حركات لطيفة عند إزالة VHSEs من أغشية الإدراج، وعند إضافة حلول تلطيخ أو غسل إلى سطح البناء، وعند إزالة واستبدال VHSEs في آبار التخزين / التصوير أثناء إعداد التصوير. على وجه التحديد ، قد تكون الطبقات apical من مكون البشرة هشة معرضة لخطر التخلص من طبقات البشرة القاعدية. الطبقات Apical من البشرة هشة وتذهب من خلال desquamation حتى في الأنسجةالأصلية 4، ولكن لتحليل دقيق لهيكل البشرة من المهم تقليل الضرر أو الخسارة. إذا رفعت طبقات البشرة من البناء ، فيمكن تصويرها بشكل منفصل. الطبقات القاعدية من البشرة هي على الأرجح لا تزال تعلق على الأدمة في حين أن أجزاء من الطبقات apical قد تنفصل. لتصور البشرة ، وصمة عار النووية مفيدة في مراقبة هذا لأن النوى الكثيفة هي سمة من سمات الطبقات الدنيا والمتوسطة من البشرة.

وقد نوقشت التصوير Confocal من VHSE بعد التثبيت في البروتوكول، ولكن من الممكن أيضا لتصوير VHSEs في جميع أنحاء الثقافة عن طريق تستقيم القائم على التماسك البصري التصوير المقطعي (أكتوبر)88،89،90،91،92،93. VHSE مستقرة بما يكفي لتحمل التصوير دون حضانة أو ترطيب لمدة ساعتين على الأقل دون آثار ملحوظة. كما أكتوبر هو التسمية الحرة وغير الباضعة، فمن الممكن لتتبع سمك البشرة أثناء النضج. من المحتمل أن يتم استخدام طرائق تصوير أخرى غير جراحية أيضا.

التصوير الحجمي للهياكل الجلدية والجلدية مجتمعة يمكن أن يكون تحديا بسبب تخفيف الليزر أعمق في VHSE. ويمكن التخفيف من ذلك عن طريق تصوير بناء في اتجاهين، من الجانب البشرة(الشكل 1)ومن الجانب الجلدي(الشكل 2)،مما يسمح لقرار جيد من هياكل الأوعية الدموية الجلدية و البشرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن مسح العينة، مما يسمح للصور الحجمية للهيكل بأكمله مع الحد الأدنى من التوهين. ومع ذلك، جرت محاولة استخدام عدة طرق للمقاصة، حيث أسفرت طريقة الميثانول/الميثيل الساليسيلات الموصوفة عن أفضل النتائج. يتم توجيه الباحثين المهتمين في تحسين طرق المقاصة الأخرى نحو هذه الاستعراضات49،61،62. إذا كان المقاصة، يقترح أن تصور تماما العينة قبل المقاصة، كما يمكن أن تلحق الضرر الأسلوب الفلوروفوريس و / أو الهيكل. وعلاوة على ذلك، ينبغي الانتهاء من التصوير في أقرب وقت ممكن بعد إزالة، كما قد تتلاشى الفلورسينس في غضون أيام.

للبساطة وسهولة الوصول، استخدم هذا البروتوكول أبسط مزيج من الوسائط الموجودة في الأدب السابق11،80. على الرغم من أن هناك العديد من المزايا لاستخدام وسائل الإعلام يمزج بسيطة، يتم التعرف على القيود المفروضة على هذا الاختيار أيضا. وقد درست مجموعات أخرى آثار مكونات وسائل الإعلام محددة على البشرة والصحة الجلدية ووجدت أن المضافات وسائل الإعلام الأخرى94, مثل الأحماض الدهنية الحرة الخارجية / الدهون, تعزيز الطبقة كورنيوم البشرة وتحسين وظيفة حاجز الجلد. على الرغم من أن علامات المناعة لدينا تظهر التمايز المناسب والتقسيم الطبقي في البشرة ، اعتمادا على الدراسات التي تجري ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين وسائل الإعلام الإضافية. علاوة على ذلك ، لم يتم إجراء تحليل مستفيض ل BM البشرة عند تقييم VHSEs المعروضة هنا. سلامة BM هو مؤشر مهم على ما يعادل الجلد. وقد فعلت مجموعات مختلفة البحوث على مدة الثقافة وتأثيرها على علامات BM95 وكذلك تحليل وجود الخلايا الليفية وأضاف آثار عامل النمو على التعبير BM14. من المهم ملاحظة أنه يجب تقييم تحليل مكون BM وتحسينه عند استخدام هذا البروتوكول.

في هذا البروتوكول يوصف إجراء لتوليد VHSE، مما يدل على النتائج بعد 8 أسابيع في ALI. وقد تم استزراع ثقافات VHSE لمدة تصل إلى 12 أسبوعا في ALI دون تغيير ملحوظ أو فقدان القدرة على البقاء ، ومن الممكن أن تكون قابلة للحياة لفترة أطول. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة لأنواع الخلايا المتاحة عادة، كما يتضح من استبدال الخلايا الليفية الجلدية مع الخلايا الليفية الرئة IMR90. اعتمادا على حاجة الباحث والموارد المتاحة، يمكن تعديل أنواع الخلايا والوسائط على الثقافة، على الرغم من أن أنواع الخلايا الأكثر مختلفة قد تتطلب تحسين الوسائط. وباختصار، تهدف هذه الإجراءات إلى توفير الوضوح بشأن ثقافة VHSEs لدراسة بيولوجيا الجلد والمرض. ولتعظيم إمكانية الوصول، تم تطوير البروتوكول بهذه البساطة والقوة باستخدام المعدات المشتركة وخطوط الخلايا والكواشف كنهج فعال بسيط يمكن تكييفه بشكل أكبر مع الاحتياجات المحددة للدراسات البحثية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر الدكتور جيم راينوالد59 والدكتور إلين H. فان دن بوغارد20 لهدية سخية من خطوط الخلية N / TERT. تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (19IPLOI34760636).

Materials

1 N NaOH Fisher Chemical S318-100 (Dilute from Lab stock)
4% Paraformaldehyde ACROS Organics #41678-5000, Lot # B0143461 Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9
Autoclaved forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
CaCl2 Fisher bioreagents Cat # BP510-250, Lot # 190231 Rnase, Dnase, Protease-Free
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) ATCC CRL-3243 SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult ATCC PCS-201-012 Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) ATCC CCL-186 Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used.
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines.
Centrifuge Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (standard lab equipment)
Computational Software MATLAB MATLAB 2020a MathWorks, Natick, MA.
Confocal Microscope Leica TCS SPEII confocal Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy.
Cover Glass (22 x 22) Fisher Scientific 12-545F 0.13-0.17 mm No.1 Thickness
Cyanoacrylate super glue or silicone grease Glue Masters #THI0102 Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred
DMEM media base Corning; Mediatech, Inc REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
DMEM/F-12 50/50 Corning; Mediatech, Inc REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethanol Decon Labs #V1101 (standard lab reagent)
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered
Fine tip forceps Fine Science Tools #11295-00 Dumont #5 forceps
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 Made up in 0.1% BSA in PBS
Hydrocortisone Alpha Easar Lot # 5002F2A made up in DMSO
Insulin (human) Peprotech Lot # 9352621
Inverted Light/Phase Contrast Microscope VWR 76317-470 (standard lab equipment)
Isoproterenol Alfa Aesar #AAJ6178806 DL-Isoproterenol hydrochloride, 98%
Keratinocyte-SFM (1x) media base Gibco; Life Technologies Corporation REF #: 10724-011; Lot # 2085518 Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium
L-Ascorbic Acid Fisher Chemical Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt
L-glutamine (solid) Fisher Bioreagents CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder
MCDB 131 media base Gen Depot CM034-050, Lot # 03062021 MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered
Metal punches Sona Enterprises (SE) 791LP, 12PC Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2".
Methanol Fisher Chemical CAS # 67-56-1 (optional). For clearing dehydration step.
Methyl Salicylate Fisher Chemical O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 (optional). For clearing.
Microtubes, 1.7 mL Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics Cat # 24-282; Lot # 19467 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free
PBS, 10x Culture grade or autoclaved APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated.
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium Genesee Scientific Corporation Ref # 25-508; Lot # 07171015
PBS, 1x non-Culture grade APEX Bioresearch Products Cat # 20-134, Lot # 202237 PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. 
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 15140-122, Lot # 2199839 Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin)
Petri Dish, glass, small Corning PYREX 316060 (optional). To be used as a clearing container
Petri Dishes, 100 mm Fisher Scientific FB0875713 Use for making up PDMS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning GMID 02065622, Batch # H04719H035 Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI)
Dow Corning GMID 02065622, Batch # H047JC4003 DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components.
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) Gilson 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S Sterilized capillaries and pistons
Round tipped scoopula (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging
Supplements for Keratinocyte-SFM media Gibco; Life Technologies Corporation Ref # 37000-015, Lot # 2154180 Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014)
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size Corning; Costar REF # 3462 – Clear; Lot # 14919057 Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, 
Tissue Culture Plates, 12 well size Greiner Bio-one; CellStar Cat # 665 180; Lot # E18103QT 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area Genesee Scientific Corporation Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene
Triton x 100 Ricca Chemical Company Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 Wetting agent
Trypsin 0.25% Corning; Mediatech, Inc Ref # 25-053-CI 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate
Type 1 Collagen isolated from Rat tail Pel-Freez Biologicals 56054-1 Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249)
Vaccum chamber, benchtop Bel-Art F42010-0000 (standard lab equipment)
Handheld Precision knife X-Acto X3311 (X-Acto knife optional if purchased steel punches)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stojic, M., et al. Skin tissue engineering 3. Biomaterials for Skin Repair and Regeneration. , 59 (2019).
  2. Shevchenko, R. V., James, S. L., James, S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. Journal of The Royal Society Interface. 7 (43), 229-258 (2010).
  3. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses’ Association. 3 (4), (2011).
  4. McGrath, J. A., Eady, R. A. J., Pope, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook’s textbook of dermatology. 10, 9781444317633 (2004).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue Engineered Human Skin Equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), (2012).
  7. Oh, J. W., Hsi, T. -. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. The Journal of investigative dermatology. 133 (11), 1-4 (2013).
  8. El-Ghalbzouri, A., Gibbs, S., Lamme, E., Van Blitterswijk, C. A., Ponec, M. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. British Journal of Dermatology. 147 (2), 230-243 (2002).
  9. Sun, T., Haycock, J., MacNeil, S. In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels. Biomaterials. 27 (18), 3459-3465 (2006).
  10. Kreimendahl, F., et al. Macrophages significantly enhance wound healing in a vascularized skin model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1340-1350 (2019).
  11. El Ghalbzouri, A., Commandeur, S., Rietveld, M. H., Mulder, A. A., Willemze, R. Replacement of animal-derived collagen matrix by human fibroblast-derived dermal matrix for human skin equivalent products. Biomaterials. 30 (1), 71-78 (2009).
  12. Roger, M., et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 234, 438-455 (2019).
  13. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin. Current Protocols in Cell Biology. 41 (1), 1-17 (2008).
  14. El Ghalbzouri, A., Jonkman, M. F., Dijkman, R., Ponec, M. Basement Membrane Reconstruction in Human Skin Equivalents Is Regulated by Fibroblasts and/or Exogenously Activated Keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 124 (1), 79-86 (2005).
  15. Pruniéras, M., Régnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
  16. Ali, N., Hosseini, M., Vainio, S., Taieb, A., Cario-André, M., Rezvani, H. R. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  17. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69-70, 81-102 (2014).
  18. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by chitosan modulated dermal matrices. PLOS ONE. 12 (3), 0174478 (2017).
  19. Vidal, S. E. L., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Abbott, R. D., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. 3D biomaterial matrix to support long term, full thickness, immuno-competent human skin equivalents with nervous system components. Organoids and Ex Vivo Tissue On-Chip Technologies. 198, 194-203 (2019).
  20. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838 (2017).
  21. Lebonvallet, N., et al. Effects of the re-innervation of organotypic skin explants on the epidermis. Experimental Dermatology. 21 (2), 156-158 (2011).
  22. Van Drongelen, V., et al. Barrier Properties of an N/TERT-Based Human Skin Equivalent. Tissue Engineering Part A. 20 (21-22), 3041-3049 (2014).
  23. . Establishment and initial characterization of a simple 3D organotypic wound healing model Available from: https://opus.hs-furtwangen.de/frontdoor/index/index/docld/4852 (2018)
  24. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  25. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  26. Amelian, A., Wasilewska, K., Megias, D., Winnicka, K. Application of standard cell cultures and 3D in vitro tissue models as an effective tool in drug design and development. Pharmacological Reports. 69 (5), 861-870 (2017).
  27. Lu, W., et al. Mixture of Fibroblasts and Adipose Tissue-Derived Stem Cells Can Improve Epidermal Morphogenesis of Tissue-Engineered Skin. Cells Tissues Organs. 195 (3), 197-206 (2012).
  28. Marino, D., Luginbühl, J., Scola, S., Meuli, M., Reichmann, E. Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries. Science Translational Medicine. 6 (221), 221 (2014).
  29. Martins-Green, M., Li, Q. -. J., Yao, M. A new generation organ culture arising from cross-talk between multiple primary human cell types. The FASEB Journal. 19 (2), 222-224 (2004).
  30. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. 3D Cell Printing of Perfusable Vascularized Human Skin Equivalent Composed of Epidermis, Dermis, and Hypodermis for Better Structural Recapitulation of Native Skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019 (2019).
  31. Baltazar, T., et al. 3D bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 26 (5-6), 227-238 (2019).
  32. Klar, A. S., et al. Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. Biomaterials. 35 (19), 5065-5078 (2014).
  33. Grebenyuk, S., Ranga, A. Engineering Organoid Vascularization. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  34. Black, A. F., Berthod, F., L’heureux, N., Germain, L., Auger, F. A. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. The FASEB Journal. 12 (13), 1331-1340 (1998).
  35. Huber, B., Link, A., Linke, K., Gehrke, S. A., Winnefeld, M., Kluger, P. J. Integration of Mature Adipocytes to Build-Up a Functional Three-Layered Full-Skin Equivalent. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (8), 756-764 (2016).
  36. Monfort, A., Soriano-Navarro, M., García-Verdugo, J. M., Izeta, A. Production of human tissue-engineered skin trilayer on a plasma-based hypodermis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 7 (6), 479-490 (2013).
  37. Shamis, Y., et al. Fibroblasts derived from human embryonic stem cells direct development and repair of 3D human skin equivalents. Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 10 (2011).
  38. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
  39. Chau, D. Y. S., Johnson, C., MacNeil, S., Haycock, J. W., Ghaemmaghami, A. M. The development of a 3D immunocompetent model of human skin. Biofabrication. 5 (3), 035011 (2013).
  40. Vanden Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. 134 (3), 719-727 (2014).
  41. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating Macrophages into Organotypic Co-Cultures: A 3D In Vitro Model to Study Tumor-Associated Macrophages. PLOS ONE. 7 (7), 40058 (2012).
  42. Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical Advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
  43. Weinmüllner, R., et al. Organotypic human skin culture models constructed with senescent fibroblasts show hallmarks of skin aging. npj Aging and Mechanisms of Disease. 6 (1), 4 (2020).
  44. Barker, C. L., et al. The Development and Characterization of an In Vitro Model of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 892-901 (2004).
  45. Larcher, F., Espada, J., Díaz-Ley, B., Jaén, P., Juarranz, A., Quintanilla, M. New Experimental Models of Skin Homeostasis and Diseases. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition). 106 (1), 17-28 (2015).
  46. Varkey, M., Ding, J., Tredget, E. E. Fibrotic Remodeling of Tissue-Engineered Skin with Deep Dermal Fibroblasts Is Reduced by Keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 716-727 (2013).
  47. Moulin, V. J. Reconstitution of skin fibrosis development using a tissue engineering approach. Methods in Molecular Biology. 961, 287-303 (2013).
  48. Morgan, J. T., Shirazi, J., Comber, E. M., Eschenburg, C., Gleghorn, J. P. Fabrication of centimeter-scale and geometrically arbitrary vascular networks using in vitro self-assembly. Biomaterials. 189, 37-47 (2019).
  49. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 1-8 (2016).
  50. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  51. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1, 2753 (2007).
  52. Bornstein, M. B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  53. Clément, M. -. V., Ramalingam, J., Long, L. H., Halliwell, B. The In Vitro Cytotoxicity of Ascorbate Depends on the Culture Medium Used to Perform the Assay and Involves Hydrogen Peroxide. Antioxidants & Redox Signaling. 3 (1), 157-163 (2001).
  54. Tajima, S., Pinnell, S. R. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. Journal of Dermatological Science. 11 (3), 250-253 (1996).
  55. Murad, S., Tajima, S., Johnson, G. R., Sivarajah, A., Pinnell, S. R. Collagen Synthesis in Cultured Human Skin Fibroblasts: Effect of Ascorbic Acid and Its Analogs. Journal of Investigative Dermatology. 81 (2), 158-162 (1983).
  56. Villacorta, L., Azzi, A., Zingg, J. -. M. Regulatory role of vitamins E and C on extracellular matrix components of the vascular system. Vitamin E: An Overview of Major Research Directions. 28 (5), 507-537 (2007).
  57. Ashino, H., et al. Novel Function of Ascorbic Acid as an Angiostatic Factor. Angiogenesis. 6 (4), 259-269 (2003).
  58. Ponec, M., et al. The Formation of Competent Barrier Lipids in Reconstructed Human Epidermis Requires the Presence of Vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  59. Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
  60. Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. Journal of visualized experiments: JoVE. (130), e56863 (2017).
  61. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  62. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  63. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  64. Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS. 23 (20), 3461-3473 (2002).
  65. Eddings, M. A., Johnson, M. A., Gale, B. K. Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (6), 067001 (2008).
  66. Markov, D. A., Lillie, E. M., Garbett, S. P., McCawley, L. J. Variation in diffusion of gases through PDMS due to plasma surface treatment and storage conditions. Biomedical microdevices. 16 (1), 91-96 (2014).
  67. Katzenberg, F. Plasma-bonding of poly(dimethylsiloxane) to glass. e-Polymers. 5 (1), (2005).
  68. El Ghalbzouri, A., Lamme, E., Ponec, M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell and Tissue Research. 310 (2), 189-199 (2002).
  69. Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology: EJD. 12 (4), 390-399 (2002).
  70. Hessian based Frangi Vesselness filter. MATLAB Central File Exchange Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/24409-hessian-based-frangi-vesselness-filter (2010)
  71. Jerman, T., Pernuš, F., Likar, B. Špiclin Enhancement of Vascular Structures in 3D and 2D Angiographic Images. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35 (9), 2107-2118 (2016).
  72. Kovesi, P. Phase Preserving Denoising of Images. signal. 4, 6 (1999).
  73. Vincent, L. Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and efficient algorithms. IEEE Transactions on Image Processing. 2 (2), 176-201 (1993).
  74. Xie, L., et al. Quantitative susceptibility mapping of kidney inflammation and fibrosis in type 1 angiotensin receptor-deficient mice. NMR in Biomedicine. 26 (12), 1853-1863 (2013).
  75. Van Uitert, R., Bitter, I. Subvoxel precise skeletons of volumetric data based on fast marching methods. Medical Physics. 34 (2), 627-638 (2007).
  76. Sethian, J. A. A fast marching level set method for monotonically advancing fronts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1591-1595 (1996).
  77. Sethian, J. A. Fast Marching Methods. SIAM Review. 41 (2), 199-235 (1999).
  78. Braverman, I. M. The Cutaneous Microcirculation. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 3-9 (2000).
  79. Men, S. J., Chen, C. -. L., Wei, W., Lai, T. -. Y., Song, S. Z., Wang, R. K. Repeatability of vessel density measurement in human skin by OCT-based microangiography. Skin research and technology: official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (4), 607-612 (2017).
  80. Commandeur, S., Ho, S. H., de Gruijl, F. R., Willemze, R., Tensen, C. P., El Ghalbzouri, A. Functional characterization of cancer-associated fibroblasts of human cutaneous squamous cell carcinoma. Experimental Dermatology. 20 (9), 737-742 (2011).
  81. Thakoersing, V. S., Danso, M. O., Mulder, A., Gooris, G., Ghalbzouri, A. E., Bouwstra, J. A. Nature versus nurture: does human skin maintain its stratum corneum lipid properties in vitro. Experimental Dermatology. 21 (11), 865-870 (2012).
  82. Thakoersing, V. S., Gooris, G. S., Mulder, A., Rietveld, M., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  83. Bouwstra, J. A., Groenink, H. W. W., Kempenaar, J. A., Romeijn, S. G., Ponec, M. Water distribution and natural moisturizer factor content in human skin equivalents are regulated by environmental relative humidity. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 378-388 (2008).
  84. Thakoersing, V. S., van Smeden, J., Mulder, A. A., Vreeken, R. J., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Increased Presence of Monounsaturated Fatty Acids in the Stratum Corneum of Human Skin Equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  85. Smola, H., Thiekötter, G., Fusenig, N. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. The Journal of Cell Biology. 122 (2), 417 (1993).
  86. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal Human Primary Fibroblasts Undergo Apoptosis in Three-Dimensional Contractile Collagen Gels. Journal of Investigative Dermatology. 110 (2), 153-157 (1998).
  87. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-Term Culture of Fibroblasts in Contracted Collagen Gels: Effects on Cell Growth and Biosynthetic Activity. Journal of Investigative Dermatology. 93 (6), 792-798 (1989).
  88. Smith, L. E., Bonesi, M., Smallwood, R., Matcher, S. J., MacNeil, S. Using swept-source optical coherence tomography to monitor the formation of neo-epidermis in tissue-engineered skin. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4 (8), 652-658 (2010).
  89. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Park, H., Cense, B., De Boer, J. F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Biomed Opt. 2 (2), 287-291 (2004).
  90. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Hyle Park, B., Cense, B., de Boer, J. F. Advances in Optical Coherence Tomography Imaging for Dermatology. Journal of Investigative Dermatology. 123 (3), 458-463 (2004).
  91. Yeh, A. T., Kao, B., Jung, W. G., Chen, Z., Nelson, J. S., Tromberg, B. J. Imaging wound healing using optical coherence tomography and multiphoton microscopy in an in vitro skin-equivalent tissue model. Journal of Biomedical Optics. 9 (2), 9 (2004).
  92. Derr, K., et al. Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Contructs with Validated Morphology and Barrier Funtion. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  93. Park, B. H., de Boer, J. F. Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , 1055-1101 (2015).
  94. Batheja, P., Song, Y., Wertz, P., Michniak-Kohn, B. Effects of Growth Conditions on the Barrier Properties of a Human Skin Equivalent. Pharmaceutical Research. 26 (7), 1689-1700 (2009).
  95. Dos Santos, M., Metral, E., Boher, A., Rousselle, P., Thepot, A., Damour, O. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biology. 47, 85-97 (2015).

Tags

Self-assembledVascularizedHuman Skin EquivalentsSkin ModelVasculatureVolumetric ImagingCollagenCell SuspensionAir-liquid InterfaceCell CulturePersonalized Medicine

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sanchez, M. M., Morgan, J. T. Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents. J. Vis. Exp. (168), e62125, doi:10.3791/62125 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image