自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

1. 3D文化の準備 確立されたプロトコル50、51、52を使用して、ラットテールコラーゲンストックを8 mg /mLで準備します。あるいは、ラットテールコラーゲンは、適切な濃度でベンダー(材料リストを参照)から購入することができる。注:コラーゲンは、3〜10 mg / mL、またはより高い50、51、52の範囲で異なる濃度で調製または購入することができます。プロトコルの計算は8 mg/mL濃度を仮定しますが、研究者のニーズに基づいて調整することができます。 細胞株を拡張する:内皮細胞および線維芽細胞は、3Dコラーゲン真皮成分生成の開始時に播種する準備ができている必要があります(ステップ2)。ケラチノサイトは、3D培養の7日目に準備ができている必要があります。1 つの完全な VHSE コンストラクトは 7.5 x 105内皮細胞を必要とします。7.5 x 104線維芽細胞;そして1.7 x 105 5のケラチノサイトの生成 (表 1)注:これらの密度は、12ウェルの透過性組織培養インサートまたは同等の場合に適しています。細胞密度とフォーマットは、研究者のニーズに基づいてスケールアップまたはスケールダウンすることができます。明確にするために、この量の内皮細胞および線維芽細胞は1〜3個の真皮成分を播種し、表皮成分はそれぞれ1.7 x105 ケラチノサイトを必要とする。 このプロトコルで全ての細胞遠心分離を300xgで5分間行いますが、より脆弱な細胞タイプでは減少する可能性があります。 2. 3Dコラーゲン皮膚成分の生成 注: ステップ 2 は時間を重視する手順で、1 つの設定で完了する必要があります。真皮成分の播種を開始する前に適切なゲル化と均質性を確保するためにコラーゲンストックの品質チェックを完了することをお勧めします、 議論のトラブルシューティングを参照してください。 細胞コラーゲン層調製および播種1.7 mLキャップマイクロ遠心分離チューブを2つ用意し、1つは無細胞サポート用、もう1つはセルラー真皮用です。このステップで与えられた量は、(3)12ウェルサイズのVHSEに十分な3mg/mLコラーゲン(標的コラーゲン濃度)の1 mLを調製する。調整が必要な場合は、数式が一覧表示されます。研究者のニーズに基づいて体積と密度の両方をスケーリングすることができます(共通の参照番号は 表2に示されています)。 各チューブに、100 μLの培養グレード 10x リン酸緩衝生理食塩 (PBS) (1 本のチューブは 3 VHSE を得る) を加え、8.6 μLの 1 N NaOH を加えます。湿った氷の上にキャップチューブを置き、少なくとも10分間冷やします。Cs = コラーゲンストック濃度Vf = 必要なコラーゲンの最終容積Ct = ターゲットコラーゲン濃度Vs = 所望量に必要なストックコラーゲンの体積 (Vf)Vpbs = 標的コラーゲン濃度に必要な10X PBSの体積(Ct)VNaOH = Ctに必要な 1N NaOH のボリュームVメディア= Ctに必要なメディア、コール 中断、または ddH2O のボリューム 1000 μL の正の変位ピペットを使用できるように準備し、取っておきます。後のステップは時間に敏感であるため、ピペットチップとセットボリューム(それぞれ375 μLと125 μL)をロードするのが便利です。さらに、516 μLの通常の1000 μLピペットをセットします。注:正の変位ピペットは、必要に応じて通常のピペットで置き換えることができますが、コラーゲンの粘度が高く、この手順の時間/温度感度のため、正の変位ピペットは、一貫した播種結果を生成するのに役立ちます。通常のピペットを使用する場合は、動きが遅くなります。 培養挿入ウェルプレートを準備する:滅菌鉗子を使用して、3つの12ウェルサイズの培養インサートを無菌12ウェル組織培養プレートに入れ、中央列に入れます。 繊維芽細胞および内皮細胞タイプに適した冷たい培地を設定する。 キャップチューブを冷却した後、1つのチューブ(細胞サポート用)をラック上に置き、内容物を見えます。他のチューブ(セルラー真皮用)を氷の上に置いておく。 冷凍から8mg/mLコラーゲンストックを取り除き、湿った氷の上に置きます。注:これはコラーゲンを凍結するので、冷凍氷や-20°Cベンチトップクーラーを使用しないでください。 コールドキャップチューブに516 μLの培地を加え、1000 μL 正変位ピペットを使用して375 μLのコールドコラーゲンをすぐに加えます。コラーゲンを溶液に分配します(チューブの側面にはありません)。すぐに空のピペットの先端を取り外し、調製された250 μL正変位ピペットに切り替えて混合します。 泡の形成を防ぐために迅速に、しかし穏やかに混ぜ、可能であれば、溶液から先端を除去しないでください。溶液が均質な色になるまで混ぜますが、これは通常約5ピペットサイクルまたは10s(フェノールレッドの培地を使用する場合、色が明るく均一になります)。混合する際は、均一な混合のためにチューブ(底部と上)の異なる位置から描画するようにしてください。注:これは、516 μLの細胞培養グレードの水または他の細胞培養グレードの液体で行うことができますが、ほとんどの培地のフェノールレッドは混合の良い指標です。2D拡張に使用した繊維芽細胞または内皮培地のいずれかを使用してください。 125 μLの細胞コラーゲンを3つの12ウェル培養インサートの各膜にすぐに分散させます。細胞コラーゲンゲルの均一なカバレッジを確保するために、皿を揺らす;均一な膜被覆を作成しない場合は、ピペットチップを使用して、コラーゲンを穏やかに広げて膜をペイントします。膜に圧力をかけないようにしてください。ゲル化は、ほぼ即座に始まります。このステップを迅速に実行して、カバレッジを均等にします。注:余分な細胞コラーゲンがあります。しかし、1mL未満のコラーゲン懸濁液を調製すると、溶液の混合が困難になり、ゲル化が不十分になる可能性があります。 すぐに12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに移して、少なくとも20分間ゲル化します(細胞コラーゲンは必要に応じてより長くゲル化することができます。このゲル化時間中に、ステップ2.2に進みます)。氷からコラーゲン懸濁液を取り除き、冷凍に戻します(コラーゲンは4°Cで最も安定しています)。 細胞懸濁液及び播種製剤注: このプロトコルのカルチャのタイムラインでは、これはサブマーション 1 日目 (SD1) に対応します。 無細胞コラーゲン支持体のゲル化中に、トリプシン化し、内皮および線維芽細胞株をカウントする。 それぞれの培地の258 μLに7.5 x 10 5個の内皮細胞と7.5 x 104個 の線維芽細胞を懸濁し、細胞懸濁液を組み合わせて516 μLアリコを作り出します。使用するまで、湿った氷の上に細胞懸濁液を維持します。 1000 μL の正の変位ピペットを使用できるように準備し、取っておきます。後のステップは時間に敏感であるため、ピペットチップとセットボリューム(それぞれ375 μLと250 μL)をロードするのが便利です。さらに、516 μLの通常の1000 μLピペットをセットします。 真皮コンパートメントの細胞を含んだコラーゲンの播種 ゲル化期間後、インキュベーターから細胞コラーゲンの12ウェルプレートを取り除きます。注:このコラーゲンが30分後にゲル化しない場合は、播種中に間違いがあったか、コラーゲンストックに問題がある可能性があるため、手順を続行しないでください(説明のトラブルシューティングを参照)。 1.7 mLキャップチューブをウェットアイスから取り外します(10x PBSとNaOHを含む)。内容物が見えるようにチューブをラックに配置します。すべてのキャップ(セルサスペンション、コールドキャップチューブ)を緩める/開きます。 4°C冷凍からストックコラーゲン(8mg/mL)を取り出し、湿った氷の上に置きます。キャップは開いたままにしておきます。 冷たいキャップされたチューブに冷却されたセル懸濁液の516 μLを加えます。1000 μL 正の変位ピペットを使用して、375 μLのコールドコラーゲン溶液をキャップチューブの溶液に直接直接ピペットします。 ピペットからすべてのコラーゲンをチューブに排出し、正の変位ピペットチップを捨てます。すぐに250 μLの正の変位ピペットに切り替え、コラーゲン溶液を混合する。 コラーゲン溶液を先に完成した様に混ぜて(素早く、しかし、泡形成を防ぐために、穏やかに)、可能であればゲルから先端を取り除かないでください。溶液が均質になるまで混合する(約5ピペットサイクルまたは10s)。混合する場合は、均一な混合のためのチューブ(底部と上)の異なる位置から描画することを確認してください。 混合したら、3つの12ウェル培養インサートのそれぞれで250μLの細胞コラーゲン溶液を細胞内コラーゲン支持体にすぐに移す。無細胞コラーゲン支持体の均一なカバレッジを確保するために、皿を揺らすか、または細胞層を乱すことなく、新たに播種した細胞コラーゲンを穏やかに動かすために正の変位ピペットを使用してください。 12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに直ちに移動させ、少なくとも30分間ゲル化させます。使用後、コラーゲンを4°Cの冷凍に戻します。 30分のゲル時間の後、プレートを軽く傾けてゲル化を評価します。コラーゲンが固化していることを確認します。 500 μL と 1000 μL のブレンドメディア (半分の内皮および半分の線維芽細胞維持培地) を挿入器の上部チャンバーと下部チャンバーにそれぞれ加えます(上から、次に底部に、熱静圧がコラーゲンを押し上げないようにします)。コラーゲンゲルに直接ではなく、ウェルの側面にゆっくりとメディアを加え、コラーゲンの破壊を最小限に抑えます。 コラーゲンゲルが水没していることを確認し、必要に応じてさらに培地を追加します。ウェルプレートを一晩のインキュベーターに入れ、一晩インキュベーターに入れます。この段階では、メディアには 10% FBS が含まれています。各セルラインの通常のメンテナンス メディア( 図1、Aに示す回路図)。注: VHSE 培養中のメディアは、カスタムセルタイプに適合させることができます。何らかの最適化が必要な場合があります。 水中2日目(SD2)メディアの変更 VHSEウェルの10S培地を5S半繊維芽細胞に変更し、半内皮培地に100 μg/mL L-アスコルビン酸を添加します。ウェルの側面にある培養インサートの上部チャンバーに500 μLを加え(再び、サイドウォールに慎重に加えて、コラーゲンの破壊を最小限に抑える)、1000 μLを下部チャンバーに加えます。 メディアを 2 日ごとに更新 (SD4 および SD6) 日 7 日 (SD7) までします。 手動ピペットを使用して井戸からメディアを取り除きます。吸引器を使用することは可能ですが、構造の損傷または破壊につながる可能性があります。注:L-アスコルビン酸は、2〜3日ごとに新鮮に作る必要があります(これは、酸化ストレスを誘発し、最終的に細胞損傷を誘発し、酸化ストレスを誘発し、このように過酸化水素を生成するために溶液中で酸化します)。したがって、L-アスコルビン酸が存在するので、培地は、SD2からVHSE培養の終わりまで2〜3日ごとに変更されなければならない。メディアのストックを作り、毎日供給するメディアアリコートにL-アスコルビン酸の新鮮な量を追加するのが最も簡単です。培養グレードの水または培地を溶媒として使用し、100mg/mLで新鮮なL-アスコルビン酸を調製します。L-アスコルビン酸は、適切な速度で線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激し、コラーゲンの安定性を促進します54,55,56;また、内皮透過性を低下させ、血管壁の完全性を維持する56、57、および表皮バリア形成6、58に加えて寄与する。 表皮成分の播種と層化誘導 水没7日目(SD7):種子角化細胞注:SD7上の表皮を確立するためにケラチノサイトをシード。この時点は研究者のニーズに基づいてシフトすることができます。ケラチノサイトを含まない沈み物培養の持続期間は9日を超えてはならないが、より長い水中がしばしば、皮膚収縮の増加をもたらす。収縮がSD7より前に起こる場合は、SD5上で5日及び種子表皮に水没期間を短くすることが推奨される。特定の実験に必要な水没期間を最適化します(説明のトラブルシューティングを参照)。 ケラチノサイト(N/TERT-120、59または他の適切な細胞)を、VHSEにトリプシン化および播種する前に、その合流限界まで培養する。N/TERT-1細胞の場合、2D培養59におけるケラチノサイトの非望ましくない分化を防ぐために、合流率が30%を大幅に超えてはならない。他の適切な細胞株、例えばヒト表皮ケラチノサイトの他の適切な細胞株については、75〜80%の合流限界が一般的に60を使用する。 トリプシン化後、ヒト皮膚同等物(HSE)分化培地の600μLで510,000個の細胞を5Sで補う回数及び懸濁液(表1)。注:600 μL の 510,000 個のセルは、1 つの構成体(3 VHSE)に 200 μL を播種する場合に 170,000 個のセル/コンストラクトを使用できます。 手動ピペットを使用して、各構造の下部と上部のチャンバーに現在メディアを収集し、廃棄します。できるだけ多くのメディアを収集してください。ピペットチップを培養インサート膜の下にそっと置き、挿入物を一時的にノックアウトすることにより、透過膜の下に直接貼り付けることができる培地を収集します。表面張力によりメディアが動かなくなった可能性があります。挿入物は、続行する前に、彼らの井戸に平らに座っていることを確認してください。吸引器を使用することは可能ですが、構造の損傷または破壊につながる可能性があります。 各ウェルの下の部屋に5Sを補ったHSEメディアの1 mLを加えます。その後、各ウェルの上部チャンバーに200 μLのセルサスペンションを加えます。真皮構築面に直接シードします。ケラチノサイトをインキュベーターで2時間落ち着かせる。 ケラチノサイトを播種した後の2つの時間は、慎重に各コンストラクトの上部チャンバーに5Sを補ったHSE培地の300 μLを追加します。培養挿入物の側にゆっくりとピペットメディア。下層のコラーゲンゲルにしっかりと付着していない可能性のある落ち着いたケラチノサイトを邪魔しないように、メディアを極上チャンバーに非常に慎重にロードします。 媒体をロードした後、インキュベーターに構築物を戻します。 水中8/9日目(SD8またはSD9) 1Sと100 μg/mL Lアスコルビン酸を補ったHSE培地を構成します。 手動ピペッタで上部と下部の両方のチャンバーからメディアを取り外します。 最初に500 μLのメディアを上部チャンバーに加え、次に1 mLを底のチャンバに加えます。(このステップはSD8またはSD9で行うことができます) 水中9/10 (SD9またはSD10、これはステップ3.2の翌日でなければなりません) 100 μg/mL L-アスコルビン酸を使用した血清フリー HSE 分化培地を作ります。 手動ピペッタで上部と下部の両方のチャンバーからメディアを取り外します。 上部チャンバーに500 μLを、下のチャンバーに1 mLを積み込みます。 空気液体インタフェース 1日目 (ALI1)注: ALI はステップ 3.3 の翌日に実行されます。 上部チャンバーのみからメディアの無駄を取り除くことによって、各構成体を空気液体インタフェース(ALI)に持ち上げます。手動ピペットを使用して、触れたり損傷を与えたりすることなく、できるだけ表皮層に近づけることができます。 プレートを異なる角度で少し傾けて、メディアを収集します。この手順で可能な限り多くのメディアを取り外します。一貫した湿度を維持するためにプレートの周囲の井戸に約2 mLの滅菌水を加えます。井戸は、文化全体を通して水で満たされた保ちます。 ケラチノサイトがまだ空気液体界面にあることを確認するために、数日後にプレートをチェックしてください。上の部屋にメディアがある場合は、それを削除します。各VHSEウェル(上下のチャンバの初期容積(1500 μL)-除去された媒体は、ALI給餌の開始点を示す) ごとに、どれだけのメディアが取り外されているかを追跡してください。注: VHSE は、エアリフトに必ずしも同じメディアレベルを必要としません。通常、VHSEが一緒にシードされている場合、それらはエアリフトのためにメディアの同じレベルを必要としますが、必ずしもそうであるとは限りません。必要に応じてボリュームを調整して ALI を維持しますが、メディアレベルが低くなく、VHSE が乾燥しないようにします。空気リフトと水分補給のバランスが取れるまで、毎日少量の媒体を取り除く方が安全です。 アリ 2 日目 (ALI2) この時点から、100 μg/mL L-アスコルビン酸を補った無血清HSE培地のみを使用してください。ALI 2 日目 (ALI2) でメディアを変更します。上部のチャンバーにメディアがある場合は、それを取り出し、以前に記録した削除されたメディアの量に追加します。前の手順の式を使用して、必要なメディアの量を計算します。例: 200 μL のメディアが上部チャンバから取り出された場合、1300 μL を加え、ALI を確立します(1500 μL – 200 μL = 1300 μL) 計算した体積を使用して各ウェルの底部チャンバーに積み込み、プレートをセルインキュベーターに戻します。1 日に使用されるボリュームを追跡します。推奨されるコラーゲン量を12ウェル培養インサートで使用すると、通常のALI値の範囲は750 μLから1300 μLの間に収まり、通常、培養熟成に対して体積が減少し、ALIの第2/3週頃に一貫しています。カルチャの詳細に応じて、この数が変更される可能性があり、最適化する必要があります (3.4.2 – 4.1 で説明)。 4. 血管人間の皮膚相当物の定期的な維持 ALI 3日目(ALI3)から培養エンドポイントまで:100 μg/mL Lアスコルビン酸を含む無血清HSE培地を使用して、2~3日ごとに下部チャンバの培地を更新します。ステップ 3.5.2 で説明されているように、ALI の下部チャンバで必要なメディア レベルの調整と追跡を続行します。 表皮表面は空気と接触したままでなければならないので、一貫したALIレベルが確立されるまで、毎日メディアレベルを確認し、調整する必要があります。表皮層は乾燥ではなく水分補給に見えるはずですが、構築物の上にメディアをプールしないでください。ALIの8週間の文化は、最も一貫した形態と表現を提供してきました。ただし、用途によっては、4〜12週間の培養が適切である場合がある。異なる細胞および培養条件の培養期間を最適化する必要がある場合があります。注:月曜日、水曜日、金曜日にメディアを変更することは良い習慣です。VHSEは週末に健康ですが、メディアは月曜日の早い時間と金曜日遅くに変更する必要があります。ステップ 1 から 4 を完全に完了すると、VHSE の生成が完了します。プロトコルのステップ 5 エンドは、このタイプの 3D コンストラクト用に最適化されたオプションの処理およびイメージング手法です。 5. 3D構造の固定と透過 注: ステップ 5 は、プロトコルの残りの部分で概説されているこの 3D 構造に固有のイメージング技術に最適化されています。VHSE を生成するために、以下のステップは必要ありません。 固定/透過 培養期間の終点で各ウェルの上下のチャンバーからすべての媒体を慎重に取り除きます。注:表皮層はおそらく壊れやすく、注意して取り扱い、積極的なピペットで表皮を攪拌しません。 PBS(pH 6.9)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え(構築物に直接ない)上部の壁に加え、次に下の部屋に、各構成体を事前に固定する。チャンバーあたり1 mLを加え、室温で5分間曝します。注意:PFAは危険であり、目の保護を含む注意と適切な個人保護装置(PPE)で取り扱う必要があります。 5分後に4%PFA溶液を取り除き、前のステップで説明したように4%PFA溶液の0.5%トリトンX 100を上下のチャンバに加えます。室温で1時間の露出;VHSEコンストラクトは、今後無菌環境を必要としません。 1時間後、両方のチャンバーから透過/固定液を慎重に取り出し、サンプルを1x PBSで3回洗浄します。 4 °C冷凍またはすぐに汚れでPBSでサンプルを保存します。サンプルを保存するには、皿をラップで包み、ホイルして蒸発と光の露出を最小限に抑えます注: ポーズポイント – 固定および透過後、ステップ 5.1.5 で概説したとおりに準備したサンプルは数週間安定しているため、この手順は一時停止できます。あるいは、(ステップ6で説明したように)染色は、ステップ5の直後に完了することができる。 6. 3D構築物の免疫蛍光染色 構築準備注:VHSEは、培養インサートの多孔質膜から分離するとよく染色されます。膜からの分離は、非閉塞画像化のためにも必要であり、染色のための減少した体積を可能にする。 免疫蛍光染色用の構成体を調製するには、インサートを逆さまにしてウェルプレートの上に置きます(VHSEが落下した場合はPBSと共に井戸に落ちます) (補足図1A)。 細かい先端鉗子および/または精密ナイフを使用して挿入膜の円周の約半分を切断しながら、ウェルの上に片手で挿入物を安定させる。VHSE構造の損傷を防ぐために穏やかな手でプラスチックハウジングにできるだけ近く切ります。 細かい先端鉗子を使用して、切断された膜のフラップの端をつかみ、VHSE構造と同様に挿入物から多孔質膜を穏やかに剥がします。VHSE構造構造の損傷を防ぐために、これを非常に慎重かつゆっくりと行ってください。VHSE構造が簡単に分離する場合、それはチャンバーの側面に立ち往生した場合、それは井戸にそれを移動するために細かい先端鉗子または小さなスクープを使用して、下の井戸に落ちる必要があります。表皮層は通常壊れやすいので非常に注意してください(補足図1A)。注:膜が簡単に外れたり、バラバラに外れたりする場合、慎重に膜とVHSEコンストラクトを引き離すツールを使用します。必要に応じて、PBSに浸すことによって、このプロセス中にVHSEが乾燥しないようにしてください。 VHSEが井戸に入ったら、挿入膜の残りの部分を捨て、染色中にVHSEを水没位置に保持するために各ウェルに培養挿入ハウジングを保持します。 染色注:VHSEは壊れやすい可能性があるため、染色と関連する取り扱い/操作と、および、スケシュはできるだけ穏やかに行う必要があります。表皮の一部が持ち上がれば、片は別々に染色することができます。表皮の上層は壊れやすく、自然の脱生物4を経るが、分析のためには可能な限り完全性を維持することが重要である。 選択した一次抗体染色を、1つの構築物ごとのブロッキングバッファーの700 μLで調製します(通常、すべての一次抗体は同じ染色溶液に入れることができますが、これは新しい抗体について確認する必要があります)。700 μL は 12 ウェルサイズで動作しますが、他のカルチャ形式に合わせて調整できます。ブロッキングバッファーレシピを有する一次および二次抗体の推奨濃度は 、表3 に示されている(最適化が必要な場合がある)。 手動ピペットを使用して井戸からPBSを取り除き、VHSEから離れてピペットに注意してください(VHSEが浮遊しているので、真空吸引は推奨されません)。 各ウェルに一次染色液を加え、培養インサートハウジングをウェルに入れ、VHSEを液中に沈めておく(補足図1B)。ウェルプレートをラップで包みます。撹拌や揺らぎをかけずに4°C冷凍で48時間のフォイルと汚れ(ロッキングはVHSEコンストラクトを損傷する可能性があります)。 48時間後、700μLのブロッキングバッファー(ウェルあたり)で二次抗体と化学染色を調製します。 培養挿入ハウジングと一次汚れ溶液を取り出し、2次汚れ溶液を添加する前に1x PBS、5分間3倍洗います。培養インサートハウジングを井戸に戻して、VHSEコンストラクトを水没状態に保つ(補足図1B)。攪拌や揺らぎなしで4°Cの冷凍で48時間の露出。 48時間の露出後、手動ピペットで汚れ溶液を取り除き、PBSで3倍を静かに洗います。VHSEに液体をまっすぐにピペットしないでください。過剰なPBSで水分補給し、培養インサートハウジングを井戸に戻して、保管中にVHSEを水没させ、水分補給します(蒸発と光暴露を最小限に抑えるためにラップとホイルで包むことで保管) クリアリング(オプション&ターミナル)注: クリアは、イメージングのオプションです。完了した場合、クリアがさらなる染色を防止し、フッ素酸エステルの性能を変え、VHSE構造を損傷する可能性があるため、サンプルを完全に染色/イメージングした後に行う必要があります。複数の組織クリアリング方法は49、61、62存在し、特定のプロジェクトに最適化することができます。後述するメチルサリチル酸除去は、VHSEに対して単純かつ有効である。以下のクリア技術はガラス容器で完了する必要があり、ピペットの先端はガラスまたはポリプロピレン(ポリスチレンはメチルサリチル酸と接触して溶解する)でなければなりません。換気の良いエリアまたはヒュームフードですべてのクリア手順を完了します。 小さな浅いガラス容器に100%メタノールを加えます(ガラスペトリ料理はうまく機能します)。(試薬の無駄を最小限に抑えるために)構造に適合する最小の可能な容器を使用してください。 鉗子/すくずを使用してウェルプレートからコンストラクトを取り出し(補足図1C)、メタノール充填容器に入れます。コンストラクトが水没していない場合は、メタノールを追加します。 3 x 10 min浸漬用メタノールでVHSEコンストラクトを脱水する。各浸漬後メタノールを完全に交換し、最後の浴後速やかにメタノールを除去します。この手順の過程で、コンストラクトはより不透明になり、わずかに縮小する可能性があります。注: これらの持続時間と繰り返しは最適化されていますが、メタノールと以下のメチルサリチル酸手順は、特定の培養形式と汚れに応じてカスタマイズする必要があります。 メタノールを取り除いた直後に、メチルサリチル酸を加え、5 x 5分浸漬でVHSEを水没させます。各浸漬後に試薬を完全に交換し、VHSEを5番目の浸漬溶液に残して保管します。この手順の過程で、コンストラクトは透明になります。 4 °Cで構成または保管をイメージします。 クリア後、蛍光HOREが数日以内にメチルサリチル酸で分解する可能性があるため、できるだけ早くすべてのイメージングを完了します。クリアすると、構築物が脆くなり、拡張ストレージは推奨されませんが、十分な量のメチルサリチル酸があることを確認するために定期的なチェックが必要です。 7. 3次元構造の共焦点イメージング 注:組織培養プラスチックを介したイメージングは、カバースリップガラスを介してイメージングと同じ品質の画像を生成しません、この方法は、共焦点イメージング中の乾燥を防ぐためにカスタムガラス底ウェルの製造を記述します。典型的には、これは、少なくとも3時間のイメージングに対して十分である。 イメージングの2日前:ポリジメチルシロキサン(PDMS)を準備する [9:1]の推奨濃度でPDMS48、63、64を準備し、ベース:架橋器。合計PDMSの30gを準備する:27gの基本成分と3gの架橋剤。任意のクリーンな混合容器を計量バランスに置き、スケールを切ります。ベース(27 g)を加え、クロスリンカー(3g)を加え、合計30gを達成します。常にクロスリンカーの前にベースを追加します。 少なくとも4分間、溶液を激しく攪拌します。これは小さな泡を作成します。十分な混合の後、PDMSを100mmペトリ皿、または同様の平底耐熱容器に注ぎます。 混合から全ての気泡が消失し、PDMSがクリアされるまで真空チャンバ内のPDMSを脱ガスする。真空をゆっくりと解放し、PDMSを取り外します(ゆっくりと)。一晩(50-60°C)を治すためにオーブンに皿を置きます。PDMSが均等に治癒するために、皿が平らに座っていることを確認してください。注:硬化後、PDMSは明確にする必要があり、表面は滑らかで粘着性ではありません(粘着性は、不適切な混合を示す可能性があります)。 イメージングの前日:PDMSの井戸準備 スチールパンチまたはハンドヘルド精密ナイフを使用して、7.1で用意されたPDMSシートから円形ウェルをパンチまたは切り取ります。ウェルは VHSE コンストラクトと同じサイズにする必要があります。円形ウェルの周りに正方形のパッチをカットして、単一のPDMSウェルを作成します。30 g PDMS の量を準備する少なくとも 4 つのカスタムウェルを生成する必要があります。注: PDMS ウェルは VHSE コンストラクトのサイズに近いはずです。イメージング中にサンプルの動きを収縮させる必要があります。複数の井戸を一度に製造し、クリーンな容器に無期限に保管することができます。 PDMSウェルと同様のサイズのガラスカバースリップを使用して、PDMSの底面(ペトリ皿と接触していた滑らかな表面)にシアノアクリル酸接着剤(例えば、スーパー接着剤)を追加し、使い捨てのピペットチップで均等に塗ります。中央に、パンチされた円の中に透明なガラス窓を残したまま、PDMSをガラスの上に押し込みます(接着剤が表示窓の上に塗りつぶされていないことを確認してください)。注:可能であれば、カバースリップへのPDMSのプラズマ結合は代替65、66、67です。 接着剤を数時間、または一晩乾燥させてから使用してください。これらは、通常の消耗から抜け出すまで再利用可能です。メモ:イメージングに使用される接着PDMS内のサンプルを染色することはお勧めしません。これらの井戸は数時間液体を保持しますが、長い染色中に漏れる可能性があります。 VHSEイメージング注: 不明確なサンプルをイメージングする場合は、イメージング ソリューションとして PBS を使用します。クリアサンプルでイメージングする場合は、撮像液としてサリチル酸メチル(または選択したクリア溶液)を使用します。 PDMSウェルにイメージングソリューションの数滴を追加し、漏れがある場合は、漏れがある場合は、シアノアクリレートスーパー接着剤のドット/スミアでそれを修復するか、別の井戸を使用してください。 VHSEを追加する場合は、PDMS 内のイメージング ソリューションを十分に保持します。すくい板または細かい先端鉗子(補足図1C)を使用して、12ウェルプレートからコンストラクトを取り外し、PDMSをガラスカバースリップの上に入れます。目的に向かって関心の方向を持つ構造を配置します。例えば、反転した顕微鏡を使用して表皮を画像化するには、表皮がガラスに向かって下向きになっていることを確認します。 あるいは、直立顕微鏡の場合、表皮を上に向ける。以下の画像化手順は、反転顕微鏡について説明されるが、直立のために容易に適合することができる。メモ: VHSE を操作するときは、損傷を避けるため注意してください。VHSEが落下した場合に備えて、ウェルプレートの上に移動します。曲がった平らな先端のすくいは、コンストラクトを移す最も簡単な方法です(補足図1C)。 サンプルがウェル内に平らに座っていて、表皮や真皮の部分がサンプルの下に折り畳まれないことを確認してください。折り畳みが発生した場合は、そっと鉗子やすくいによってサンプルを操作します。VHSEを浮かべる余分なイメージング溶液を一時的に追加することは、それがまっすぐに役立つかもしれません。サンプルの折り畳みやしわは、目で見たり、顕微鏡を用いて見ることができます。 サンプルを水分補給するのに十分な流体を使用して、イメージングソリューションで井戸を満たします。流体が多すぎるとサンプルが浮遊し、イメージング中に動きが生じます。コンストラクトはガラスの窓の上に座っている必要があります。PDMSをうまく傾けることによって動きのためのテスト。動きがある場合は、流体を取り除きます。動きが止まるまで流体ドロップを追加および除去します。 イメージング中の蒸発を最小限に抑えるために、ウェルの上にガラススライドを置きます(補足図1D)。イメージングセッションが長い場合は、サンプルを頻繁にチェックして、適切な流体レベルを確認します。アクセス可能な場合、イメージング中に加湿されたチャンバーを使用することができます(通常は必要ありません)。 顕微鏡のステージにサンプルを置き、ガラスカバースリップウィンドウを通して画像を配置します(補足図1D)。この技術は、連続的な共焦点イメージングの少なくとも3時間を可能にするが、サンプルの水和は、必要に応じて追加されたイメージング溶液で、定期的にチェックする必要があります。注:サンプルがクリアされている場合、メチルサリチル酸塩は、時間の経過とともに接着剤を劣化させる。PDMS を接着する接着剤は、イメージングの実行間に再適用できます。またはサンプルを定期的に新しい井戸に転送することができます。プラズマボンディングを備えた井戸では、これは問題ではありません。 イメージング後、試料をできるだけウェルにイメージング液で浮かべる。スコップラまたは細かい先端鉗子を使用して、サンプルをそのストレージウェルに移します。サンプルが落下した場合に備えて、ウェルプレート上で転写を行います。 各PDMSウェルとトップガラスカバースリップは、それらが壊れるまで再利用することができます。ウェルの内側と外側の両方で、イメージングの前に底ガラスをきれいにしてください。再使用する前に、必ず漏れがないか確認し、必要に応じて接着剤で修復してください。 ステップ 6.3.6 で説明されているようにサンプルを保存し、維持するために数ヶ月ごとに PBS を追加します。サンプルがクリアされた場合は、メチルサリチル酸を使用してガラスに保存し、定期的にレベルを確認してください。クリアされたサンプルは急速に (日以内に) 劣化する可能性があり、できるだけ早く画像を作成する必要があります。