JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Published: December 14, 2020
doi:
10.3791/62105
, , , ,
1Department of Neuroscience,Washington University School of Medicine

Summary

מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

Abstract

הומאוסטזיס שינה, העלייה בשינה שנצפתה לאחר אובדן שינה, הוא אחד הקריטריונים המגדירים המשמשים לזיהוי שינה ברחבי ממלכת החיות. כתוצאה מכך, מניעת שינה והגבלת שינה הם כלים רבי עוצמה המשמשים בדרך כלל כדי לספק תובנה על תפקוד השינה. עם זאת, ניסויים מניעת שינה הם בעייתיים מטבעם בכך גירוי המחסור עצמו עשוי להיות הגורם לשינויים שנצפו בפיזיולוגיה ובהתנהגות. בהתאם לכך, טכניקות מוצלחות של מניעת שינה צריכות לשמור על בעלי חיים ערים, ובאופן אידיאלי, לגרום לריבויישן שינה חזק מבלי לגרום גם למספר רב של השלכות לא מכוונות. כאן, אנו מתארים טכניקה של מניעת שינה עבור Drosophila melanogaster. מנגנון ביטול השינה (SNAP) מנהל גירוי כל 10s כדי לגרום לגיאוטקסיס שלילי. למרות הגירוי צפוי, SNAP מונע ביעילות >95% של שינה בלילה אפילו זבובים עם כונן שינה גבוהה. חשוב לציין, התגובה ההומיאוסטטית הבאה דומה מאוד לזו שהושגה באמצעות מניעת ידיים. התזמון והמרווח של הגירויים ניתן לשנות כדי למזער את אובדן השינה ובכך לבחון השפעות לא ספציפיות של הגירוי על פיזיולוגיה והתנהגות. ה- SNAP יכול לשמש גם להגבלת שינה ולהעריך את סף העוררות. ה- SNAP היא טכניקה רבת עוצמה להפרעות שינה שניתן להשתמש בה כדי להבין טוב יותר את תפקוד השינה.

Introduction

השינה קרובה לאוניברסלית בבעלי חיים, אך תפקידה עדיין לא ברור. שינה הומאוסטזיס, עלייה מפצה בשינה בעקבות מניעת שינה, הוא מאפיין מגדיר של שינה, ששימש לאפיון מצבי שינה במספר בעלי חיים1,2,3,4,5.

לישון בזבוב יש קווי דמיון רבים עם שינה אנושית, כולל תגובה הומיאוסטטית חזקה לאובדן שינה4,5. מחקרים רבים של שינה בזבוב השתמשו במחסור בשינה הן כדי להסיק את תפקוד השינה על ידי בחינת ההשלכות השליליות המצטברות מהתעוררות ממושכת, והן כדי להבין את ויסות השינה על ידי קביעת המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים בוויסות ההומיאוסטטי של השינה. לכן זבובים מחוסרי שינה הוצגו להפגין ליקויים בלמידה ובזיכרון6,7,8,9,10,11,12, פלסטיות מבנית13,14,15, תשומת לב חזותית16, התאוששות מפגיעה עצבית17,18, הזדווגות והתנהגויות אגרסיביות19, 20, התפשטות תאים21, ותגובות ללחץ חמצוני22,23 אם להזכיר כמה. יתר על כן, חקירות של המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים על שינה ריבאונד הניבו תובנות קריטיות על המכונות העצביות המהוות את הומיאוסטטייק השינה8,9,23,24,25,26,27,28,29 . לבסוף, בנוסף לחשיפת תובנות בסיסיות על תפקוד השינה בבעלי חיים בריאים, מחקרים על מניעת שינה גם הודיעו תובנות על תפקוד השינה במצביםחולים 30,31.

בעוד מניעת שינה היא ללא ספק כלי רב עוצמה, עם כל ניסוי מניעת שינה, חשוב להבחין פנוטיפים הנובעים התעוררות ממושכת, מאלה המושרה על ידי הגירוי המשמש כדי לשמור על החיה ערה. מניעת שינה על ידי מניעת ידיים או טיפול עדין, נחשב בדרך כלל כקביעת התקן למחסור מינימלי בשינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה זבובים באמצעות מנגנון ביטול השינה (SNAP). ה-SNAP הוא מכשיר המספק גירוי מכני לטסים כל 10s, ושומר על זבובים ערים על ידי גרימת גיאוטקסיס שלילי(איור 1). ה-SNAP מונעת ביעילות זבובים >98% משנת הלילה, אפילו בזבובים עם הנעה בשינה גבוהה8,32. ה-SNAP מכויל על זבובים רגישים למפץ, תסיסה של זבובים ב-SNAP לא פוגעת בזבובים; מניעת שינה עם SNAP מעורר ריבאונד דומה לזה המתקבל על ידי מניעת יד7. ה- SNAP הוא אפוא שיטה חזקה למניעת זבובים בשינה תוך שליטה על ההשפעות של הגירוי המעורר.

Protocol

1. הכנה ניסיונית לאסוף זבובים כשהם מתחלקים לתוך בקבוקונים, הפרדת זבובים זכר ונקבה.הערה: ניסויי שינה נערכים בדרך כלל עם זבובים נשיים. חשוב לאסוף נקבות בתולות. נקבות מויזות יטילו ביצים שבוקעות לתוך זחלים מה שמסבך את ניתוח הנתונים. זבובי בית של מין אחד בקבוצות של <20.הערה: דיור טס …

Representative Results

קנטון S (Cs) שימש כזן פראי. הזבובים נשמרו באור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות, ושינה נמנעה במשך 12 שעות בלילה. בדיקת פרופילי השינה של זבובי Cs ביום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ושני ימי התאוששות (rec1 ו rec2) (איור 2A) עולה כי זבובים היו למעשה מניעת שינה SNAP, ושינה התאו…

Discussion

שינה בדרוסופילים אופיינה באופן עצמאי בשנת 2000, על ידי שתי קבוצות4,5. במחקרים חלוציים אלה, זבובים נשללו שינה על ידי טיפול עדין (כלומר, מניעת ידיים) והוכחו להפגין תגובה הומיאוסטטית חזקה למחסור בשינה בלילה. חשוב לציין, עם כל ניסוי מניעת שינה זה חיוני כדי לשלו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH 5R01NS051305-14 ו 5R01NS076980-08 ל- PJS.

Materials

Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax Thermo Fisher 13404-122 Wax used for sealing tubes
Glass tubes Wale Apparatus 244050 We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food Genesee Scientific 66-113 Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool Dremel Multi Pro 395 Used to cut 65mm long glass tubes 
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software Trikinetics Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer Lenovo Idea Centre AIO3 A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors Trikinetics DAM2 These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor Trikinetics DEnM Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller Trikinetics LC4 A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM Trikinetics PSIU-9 Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector 7001-64PC Multicomp DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters Trikinetics SPLT5 Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire Radioshack 278-367 Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply Gw INSTEK GPS-30300 Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus Washington University School of Medicine machine shop
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
  2. Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
  3. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  4. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  5. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  6. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
  7. Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
  8. Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
  9. Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
  10. Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
  11. Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
  12. Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
  13. Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
  14. Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
  15. Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
  16. Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  17. Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
  18. Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
  19. Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
  20. Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
  21. Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
  22. Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
  23. Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
  24. Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
  25. Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
  26. Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
  27. Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
  28. Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
  29. Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
  30. Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
  31. Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
  32. Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
  33. Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
  34. Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
  35. Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
  36. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
  37. Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
  38. Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
  39. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
  40. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
  41. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
  42. Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
  43. Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
  44. Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).

Tags

Sleep DeprivationSleep RestrictionDrosophilaSleep HomeostasisSleep RegulationSNAP (Sleep Nullifying Apparatus)Activity MonitoringLocomotor ActivitySleep BoutSleep Recovery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Melnattur, K., Morgan, E., Duong, V., Kalra, A., Shaw, P. J. The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila. J. Vis. Exp. (166), e62105, doi:10.3791/62105 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image