Summary

L'apparato che annulla il sonno: un metodo altamente efficiente per privare la drosophila del sonno

Published: December 14, 2020
doi:

Summary

La privazione del sonno è un potente strumento per studiare la funzione e la regolazione del sonno. Descriviamo un protocollo per privare di sonno Drosophila usando l’apparato annullante del sonno e per determinare l’entità del sonno di rimbalzo indotto dalla privazione.

Abstract

L’omeostasi del sonno, l’aumento del sonno osservato dopo la perdita di sonno, è uno dei criteri di definizione utilizzati per identificare il sonno in tutto il regno animale. Di conseguenza, la privazione del sonno e la restrizione del sonno sono strumenti potenti che sono comunemente usati per fornire informazioni sulla funzione del sonno. Tuttavia, gli esperimenti di privazione del sonno sono intrinsecamente problematici in quanto lo stimolo di privazione stesso può essere la causa dei cambiamenti osservati nella fisiologia e nel comportamento. Di conseguenza, le tecniche di privazione del sonno di successo dovrebbero mantenere gli animali svegli e, idealmente, provocare un robusto rimbalzo del sonno senza indurre anche un gran numero di conseguenze indesiderate. Qui, descriviamo una tecnica di privazione del sonno per Drosophila melanogaster. Lo Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) somministra uno stimolo ogni 10 secondi per indurre geotaxi negativi. Sebbene lo stimolo sia prevedibile, lo SNAP previene efficacemente >95% del sonno notturno anche nelle mosche con un elevato calo del sonno. È importante sottolineare che la successiva risposta omeostatica è molto simile a quella ottenuta utilizzando la privazione della mano. I tempi e la spaziatura degli stimoli possono essere modificati per ridurre al minimo la perdita di sonno e quindi esaminare gli effetti non specifici dello stimolo sulla fisiologia e sul comportamento. Lo SNAP può essere utilizzato anche per la restrizione del sonno e per valutare le soglie di eccitazione. Lo SNAP è una potente tecnica di interruzione del sonno che può essere utilizzata per comprendere meglio la funzione del sonno.

Introduction

Il sonno è quasi universale negli animali, ma la sua funzione rimane poco chiara. L’omeostasi del sonno, l’aumento compensatorio del sonno dopo la privazione del sonno, è una proprietà determinante del sonno, che è stata utilizzata per caratterizzare gli stati del sonno in un certo numerodi animali1,2,3,4,5.

Il sonno nella mosca ha molte somiglianze con il sonno umano, tra cui una robusta risposta omeostatica alla perdita di sonno4,5. Numerosi studi sul sonno nella mosca hanno utilizzato la privazione del sonno sia per dedurre la funzione del sonno esaminando le conseguenze negative che derivano dalla veglia prolungata, sia per comprendere la regolazione del sonno determinando i meccanismi neurobiologici che controllano la regolazione omeostatica del sonno. Così le mosche private del sonno hanno dimostrato di mostrare menomazioni nell’apprendimento e nella memoria6,7,8,9,10,11,12, plasticità strutturale13,14,15, attenzione visiva16, recupero da lesioni neuronali17,18, accoppiamento e comportamenti aggressivi19, 20, proliferazione cellulare21e risposte allo stress ossidativo22,23 per citarne alcuni. Inoltre, leindagini sui meccanismi neurobiologici che controllano il sonno di rimbalzo hanno prodotto informazioni critiche sul meccanismo neuronale che costituisce l’omeostato del sonno8,9,23, 24,25,26,27,28,29 . Infine, oltre a rivelare intuizioni fondamentali sulla funzione del sonno negli animali sani, gli studi sulla privazione del sonno hanno anche informato le intuizioni sulla funzione del sonno negli statipatologici 30,31.

Mentre la privazione del sonno è innegabilmente uno strumento potente, con qualsiasi esperimento di privazione del sonno, è importante distinguere i fenotipi che derivano dalla veglia prolungata, da quelli indotti dallo stimolo utilizzato per mantenere sveglio l’animale. La privazione del sonno per privazione della mano o manipolazione delicata, è generalmente considerata come lo standard per la privazione del sonno minimamente dirompente. Qui descriviamo un protocollo per privare il sonno delle mosche usando il Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Lo SNAP è un dispositivo che fornisce uno stimolo meccanico alle mosche ogni 10 secondi, mantenendo sveglie le mosche inducendo geotaxi negativi (Figura 1). Lo SNAP priva efficacemente le mosche di >98% del sonno notturno, anche nelle mosche con un elevato livello di sonno8,32. Lo SNAP è stato calibrato su mosche sensibili al botto, l’agitazione delle mosche nello SNAP non danneggia le mosche; la privazione del sonno con lo SNAP induce un rimbalzo paragonabile a quello ottenuto dalla privazione della mano7. Lo SNAP è quindi un metodo robusto per privare le mosche del sonno mentre controlla gli effetti dello stimolo eccitante.

Protocol

1. Preparazione sperimentale Raccogli le mosche mentre si chiude in fiale, separando le mosche maschili e femminili.NOTA: gli esperimenti sul sonno sono comunemente condotti con mosche femmine. È importante raccogliere femmine vergini. Le femmine accoppiate deporteranno uova che si schiudono in larve complicando l’analisi dei dati. Mosche domestiche di un solo sesso in gruppi di <20.NOTA: l’alloggiamento vola in un ambiente socialmente arricchito (gruppi di >50) modula il sonno<sup class="xre…

Representative Results

Il Canton S (Cs) è stato utilizzato come ceppo selvatico. Le mosche sono state mantenute su una luce di 12 ore: 12 ore di buio e sonno privato per 12 ore durante la notte. L’ispezione dei profili del sonno delle mosche Cs nel giorno di base (bs), nel giorno di privazione del sonno (sd) e in due giorni di recupero (rec1 e rec2)(Figura 2A)suggerisce che le mosche sono state effettivamente private del sonno nello SNAP e hanno recuperato il sonno durante il gior…

Discussion

Il sonno in Drosophila è stato caratterizzato in modo indipendente nel 2000, da due gruppi4,5. In questi studi pionieristici, le mosche sono state private del sonno da una manipolazione delicata (cioè la privazione della mano) e hanno dimostrato di mostrare una robusta risposta omeostatica alla privazione del sonno notturno. È importante sottolineare che con qualsiasi esperimento di privazione del sonno è fondamentale controllare i potenziali effetti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH 5R01NS051305-14 e 5R01NS076980-08 a PJS.

Materials

Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax Thermo Fisher 13404-122 Wax used for sealing tubes
Glass tubes Wale Apparatus 244050 We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food Genesee Scientific 66-113 Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool Dremel Multi Pro 395 Used to cut 65mm long glass tubes 
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software Trikinetics Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer Lenovo Idea Centre AIO3 A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors Trikinetics DAM2 These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor Trikinetics DEnM Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller Trikinetics LC4 A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM Trikinetics PSIU-9 Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector 7001-64PC Multicomp DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters Trikinetics SPLT5 Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire Radioshack 278-367 Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply Gw INSTEK GPS-30300 Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus Washington University School of Medicine machine shop

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Melnattur, K., Morgan, E., Duong, V., Kalra, A., Shaw, P. J. The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila. J. Vis. Exp. (166), e62105, doi:10.3791/62105 (2020).

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