Skelettmuskelregenerering drivs av vävnad bosatta muskelstamceller, som är nedsatta i många muskelsjukdomar såsom muskeldystrofi, och detta resulterar i oförmågan hos muskler att regenerera. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter undersökning av muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Skelettmuskeln har en anmärkningsvärd förmåga att regenerera efter skada, som drivs av obligate vävnad bosatta muskelstamceller. Efter skada aktiveras muskelstamcellen och genomgår cellproliferation för att generera en pool av myoblaster, som därefter skiljer sig från att bilda nya muskelfibrer. I många muskelförtvining villkor, inklusive muskeldystrofi och åldrande, denna process är nedsatt vilket resulterar i oförmågan hos muskler att regenerera. Processen med muskelregenerering i zebrafisk är mycket bevarad med däggdjurssystem som ger ett utmärkt system för att studera muskelstamcellsfunktion och regenerering, i muskelförtviningsförhållanden som muskeldystrofi. Här presenterar vi en metod för att undersöka muskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Det första steget innebär användning av en genotypningsplattform som gör det möjligt att bestämma larvernas genotyp innan en skada framkallas. Efter att ha bestämt genotypen skadas muskeln med hjälp av ett nålhugg, varefter polariserande ljusmikroskopi används för att bestämma omfattningen av muskelregenerering. Vi tillhandahåller därför en hög genomströmning pipeline som möjliggör undersökning av muskel regenerering i zebrafisk modeller av muskelsjukdom.
Skelettmuskulatur står för 30-50% av människokroppens massa, och är inte bara oumbärlig för rörelse, men det fungerar också som ett kritiskt metaboliskt och lagringsorgan1. Trots att det är postmitotic, skelettmuskulaturen är mycket dynamisk och behåller en enorm regenerativ kapacitet efter skada. Detta tillskrivs förekomsten av vävnad bosatta stamceller (även kallade satellitceller), som ligger under basala lamina av myofibers och markeras av transkriptionsfaktorerna parat box protein 7 (pax7) och / eller parat boxprotein 3 (pax3), blandandra 2,3. Efter skada aktiveras satellitcellen och genomgår cellproliferation för att generera en pool av myoblaster, som därefter skiljer sig åt för att bilda nya muskelfibrer. Den mycket bevarade kaskaden av pro-regenerativa signaler som reglerar satellitcellsaktivering och robust muskelreparation påverkas under olika förhållanden som myopatier och homeostatiskt åldrande4,5.
En sådan mångfaldig grupp myopatier är muskeldystrofi, kännetecknad av progressiv muskelförtvining och degeneration6. Dessa sjukdomar är följden av genetiska mutationer i viktiga proteiner, inklusive dystroin och laminin-α2 (LAMA2), ansvarig för fastsättning av muskelfibrer till den extracelluläramatrisen 7,8. Med tanke på att proteiner som är inblandade i muskeldystrofi spelar en så central roll för att upprätthålla muskelstrukturen, trodde man under många år att ett misslyckande i denna process var den mekanism som ansvarar för sjukdomspatogenes9. Nyligen genomförda studier har dock identifierat defekter i regleringen av muskelstamceller och efterföljande försämring av muskelregenerering som en andra möjlig grund för muskelpatologin som observerats i muskeldystrofi10,11. Som sådan behövs ytterligare studier för att undersöka hur en försämring av muskelstamcellsfunktionen och tillhörande nischelement bidrar till muskeldystrofi.
Under det senaste decenniet har zebrafisk (Danio rerio) dykt upp som en viktig ryggradsdjur modell för sjukdom modellering12. Detta tillskrivs zebrafiskembryons snabba externa utveckling, i kombination med dess optiska klarhet, vilket möjliggör direkt visualisering av muskelbildning, tillväxt och funktion. Dessutom är inte bara utvecklingen och strukturen av muskler mycket bevarade i zebrafisk, de visar också en mycket bevarad process av muskelregenerering13. Följaktligen representerar zebrafisk ett utmärkt system för att studera patobiologin hos muskelsjukdomar och utforska hur muskelregenerering påverkas i den. För detta ändamål har vi utvecklat en metod som möjliggör snabb studie av skelettmuskelregenerering i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Denna pipeline med hög genomströmning innebär en metod för genotyp levande embryon14, varefter en nål-stab skada utförs och omfattningen av muskelregenerering avbildas med polariserande ljusmikroskopi. Användningen av denna teknik kommer därför att avslöja muskelns regenerativa kapacitet i zebrafiskmodeller av muskelsjukdom.
Skelettmuskelregenerering drivs av obligate vävnad bosatta muskelstamceller, vars funktion ändras i många muskelsjukdomar såsom muskeldystrofi, därefter imped processen för muskelregenerering. Här beskriver vi ett högt genomströmningsprotokoll för att undersöka muskelregenerering i levande zebrafiskmodeller av muskelsjukdom. Det första steget i rörledningen använder en embryo genotypningsplattform14, som är en användarvänlig och exakt metod för att bestämma genotypen av levande …
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Alex Fulcher och Monash Micro Imaging för hjälp med underhåll och installation av mikroskop. Australian Regenerative Medicine Institute stöds av bidrag från delstatsregeringen i Victoria och australiensiska regeringen. Detta arbete finansierades av ett projektbidrag för muskeldystrofi (USA) till P.D.C (628882).
24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
Polarizing microscope | Abrio | N/A |