Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen
Summary
Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.
Abstract
Die Skelettmuskulatur hat eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich nach einer Verletzung zu regenerieren, die von obligaten Gewebe-ansässigen Muskelstammzellen angetrieben wird. Nach einer Verletzung wird die Muskelstammzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Bei vielen Muskelschwundzuständen, einschließlich Muskeldystrophie und Alterung, ist dieser Prozess beeinträchtigt, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Der Prozess der Muskelregeneration bei Zebrafischen ist hoch konserviert, wobei Säugetiersysteme ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung der Muskelstammzellfunktion und -regeneration bei Muskelschwunderkrankungen wie Muskeldystrophie bieten. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen zu untersuchen. Der erste Schritt beinhaltet die Verwendung einer Genotypisierungsplattform, die die Bestimmung des Genotyps der Larven ermöglicht, bevor eine Verletzung hervorgeschleudert wird. Nach der Bestimmung des Genotyps wird der Muskel mit einem Nadelstich verletzt, worauf hin die Polarisationslichtmikroskopie verwendet wird, um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen. Wir bieten daher eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.
Introduction
Die Skelettmuskulatur macht 30-50% der menschlichen Körpermasse aus und ist nicht nur für die Fortbewegung unverzichtbar, sondern dient auch als kritisches Stoffwechsel- und Speicherorgan1. Obwohl sie postmitotisch ist, ist die Skelettmuskulatur hochdynamisch und behält nach einer Verletzung eine enorme Regenerationsfähigkeit. Dies wird auf das Vorhandensein von geweberesidenten Stammzellen (auch Satellitenzellen genannt) zurückgeführt, die sich unter der Basallamina von Myofibern befinden und durch die Transkriptionsfaktoren gepaartes Boxprotein 7 (pax7)und/oder gepaartes Boxprotein 3 (pax3)gekennzeichnetsind,unter anderem2,3. Nach einer Verletzung wird die Satellitenzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Die hochkonservierte Kaskade von pro-regenerativen Signalen, die die Aktivierung von Satellitenzellen und die robuste Muskelreparatur regulieren, ist unter verschiedenen Bedingungen wie Myopathien und homöostatischem Altern betroffen4,5.
Eine solche vielfältige Gruppe von Myopathien ist die Muskeldystrophie, die durch fortschreitenden Muskelschwund und Degeneration gekennzeichnet ist6. Diese Krankheiten sind die Folge genetischer Mutationen in Schlüsselproteinen, einschließlich Dystrophin und Laminin-α2 (LAMA2), die für die Bindung von Muskelfasern an die extrazelluläre Matrix verantwortlich sind7,8. Angesichts der Tatsache, dass Proteine, die an Muskeldystrophie beteiligt sind, eine so zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Muskelstruktur spielen, wurde viele Jahre lang angenommen, dass ein Versagen in diesem Prozess der Mechanismus war, der für die Krankheitspathogenese verantwortlich war9. Neuere Studien haben jedoch Defekte in der Regulation von Muskelstammzellen und anschließende Beeinträchtigungen der Muskelregeneration als zweite mögliche Grundlage für die bei Muskeldystrophie beobachtete Muskelpathologie identifiziert10,11. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zu untersuchen, wie eine Beeinträchtigung der Muskelstammzellfunktion und der damit verbundenen Nischenelemente zur Muskeldystrophie beiträgt.
In den letzten zehn Jahren hat sich zebrafisch (Danio rerio) zu einem wichtigen Wirbeltiermodell für die Krankheitsmodellierung entwickelt12. Dies ist auf die schnelle äußere Entwicklung des Zebrafischembros zurückzuführen, gepaart mit seiner optischen Klarheit, die die direkte Visualisierung von Muskelaufbau, Wachstum und Funktion ermöglicht. Darüber hinaus ist nicht nur die Entwicklung und Struktur der Muskeln bei Zebrafischen hoch konserviert, sie zeigen auch einen hochkonservierten Prozess der Muskelregeneration13. Folglich stellen Zebrafische ein ausgezeichnetes System dar, um die Pathobiologie von Muskelerkrankungen zu untersuchen und zu untersuchen, wie die Muskelregeneration darin beeinflusst wird. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, die die rechtzeitige Untersuchung der Skelettmuskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht. Diese Hochdurchsatz-Pipeline beinhaltet eine Methode zur Genotypisierung lebender Embryonen14, nach der eine Nadelstichverletzung durchgeführt wird und das Ausmaß der Muskelregeneration mit Polarisationslichtmikroskopie abgebildet wird. Die Anwendung dieser Technik wird daher die Regenerationsfähigkeit der Muskeln in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen aufdecken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch obligate geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, deren Funktion bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie verändert wird und in der Folge den Prozess der Muskelregeneration behindert. Hier beschreiben wir ein Hochdurchsatzprotokoll zur Untersuchung der Muskelregeneration in lebenden Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen. Der erste Schritt der Pipeline verwendet eine Embryo-Genotypisierungsplattform14, eine benutzerfreundliche u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Alex Fulcher und Monash Micro Imaging für die Unterstützung bei der Wartung und Einrichtung des Mikroskops. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaates Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium der Muscular Dystrophy Association (USA) an P.D.C (628882) finanziert.
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
