Summary

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Published: January 18, 2021
doi:

Summary

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Abstract

Le muscle squelettique a une capacité remarquable à se régénérer après une blessure, qui est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes dans les tissus obligatoires. Après une blessure, la cellule souche musculaire est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. Dans de nombreuses conditions d’atrophie musculaire, y compris la dystrophie musculaire et le vieillissement, ce processus est altéré, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Le processus de régénération musculaire chez le poisson-zèbre est hautement conservé avec des systèmes mammifères fournissant un excellent système pour étudier la fonction et la régénération des cellules souches musculaires, dans des conditions d’atrophie musculaire telles que la dystrophie musculaire. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire. La première étape consiste à utiliser une plateforme de génotypage qui permet de déterminer le génotype des larves avant de provoquer une blessure. Après avoir déterminé le génotype, le muscle est blessé à l’aide d’un coup de couteau à aiguille, après quoi la microscopie à lumière polarisante est utilisée pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire. Nous fournissons donc un pipeline à haut débit qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.

Introduction

Le muscle squelettique représente 30 à 50% de la masse corporelle humaine et est non seulement indispensable à la locomotion, mais il sert également d’organe métabolique et de stockage critique1. Bien qu’il soit postmitotique, le muscle squelettique est très dynamique et conserve une énorme capacité de régénération après une blessure. Ceci est attribué à la présence de cellules souches résidentes tissulaires (également appelées cellules satellites), situées sous la lame basale des myofibres et marquées par les facteurs de transcription appariés boîte protéine 7 (pax7) et / ou protéine boîte appariée 3 (pax3), entre autres2,3. Après une blessure, la cellule satellite est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. La cascade hautement conservée de signaux pro-régénératifs régulant l’activation des cellules satellites et la réparation musculaire robuste est affectée dans diverses conditions telles que les myopathies et le vieillissement homéostatique4,5.

L’un de ces groupes diversifiés de myopathies est la dystrophie musculaire, caractérisée par une atrophie musculaire progressive et une dégénérescence6. Ces maladies sont la conséquence de mutations génétiques dans des protéines clés, dont la dystrophine et la laminine-α2 (LAMA2), responsables de la fixation des fibres musculaires à la matrice extracellulaire7,8. Étant donné que les protéines impliquées dans la dystrophie musculaire jouent un rôle central dans le maintien de la structure musculaire, on a cru pendant de nombreuses années qu’un échec de ce processus était le mécanisme responsable de la pathogenèse de la maladie9. Cependant, des études récentes ont identifié des défauts dans la régulation des cellules souches musculaires et une altération ultérieure de la régénération musculaire comme deuxième base possible pour la pathologie musculaire observée dans la dystrophie musculaire10,11. En tant que tel, d’autres études sont nécessaires pour étudier comment une altération de la fonction des cellules souches musculaires et des éléments de niche associés contribue à la dystrophie musculaire.

Au cours de la dernière décennie, le poisson-zèbre(Danio rerio)est devenu un modèle important de vertébrés pour la modélisation des maladies12. Ceci est attribué au développement externe rapide de l’embryon de poisson zèbre, associé à sa clarté optique, qui permet la visualisation directe de la formation, de la croissance et de la fonction musculaires. De plus, non seulement le développement et la structure des muscles sont hautement conservés chez le poisson-zèbre, mais ils présentent également un processus de régénération musculaire hautement conservé13. Par conséquent, le poisson-zèbre représente un excellent système pour étudier la pathobiologie des maladies musculaires et explorer comment la régénération musculaire y est affectée. À cette fin, nous avons développé une méthode qui permet l’étude opportune de la régénération musculaire squelettique dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre. Ce pipeline à haut débit implique une méthode de génotype d’embryons vivants14, à la suite de laquelle une blessure à l’aiguille est effectuée et l’étendue de la régénération musculaire est imagée à l’aide de la microscopie à lumière polarisante. L’utilisation de cette technique révélera donc la capacité de régénération du muscle dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.

Protocol

L’entretien du poisson-zèbre a été effectué conformément aux procédures d’exploitation normalisées approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Monash en vertu de la licence de colonie de reproduction ERM14481. 1. Détermination du génotype d’embryons vivants à l’aide d’une plateforme de génotypage d’embryons. Anesthésier 3 jours après la fécondation (dpf) des embryons de poisson zèbre en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à un…

Representative Results

La capacité de quantifier la biréfringence du muscle squelettique fournit une méthode non invasive mais hautement reproductible pour examiner et comparer les niveaux de lésions musculaires, et examiner la régénération musculaire in vivo. La biréfringence résulte de la diffraction de la lumière polarisée à travers le réseau pseudo-cristallin des sarcomères musculaires15, et suite à une blessure ou à une lésion du muscle, une réduction de l…

Discussion

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes des tissus obligatoires, dont la fonction est altérée dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, entravant par la suite le processus de régénération musculaire. Ici, nous décrivons un protocole à haut débit pour examiner la régénération musculaire dans des modèles vivants de poisson zèbre de maladie musculaire. La première étape du pipeline utilise une plate-forme …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le Dr Alex Fulcher et Monash Micro Imaging pour leur aide à la maintenance et à la configuration du microscope. L’Australian Regenerative Medicine Institute est soutenu par des subventions du gouvernement de l’État de Victoria et du gouvernement australien. Ce travail a été financé par une subvention de projet de la Muscular Dystrophy Association (USA) à P.D.C (628882).

Materials

24 well plates Thermo Fischer 142475
30 gauge needles Terumo NN-3013R
90 mm Petri Dishes Pacific Laboratory Products PT S9014S20
DNA extraction chips wFluidx ZEG chips
Embryo genotyping platform wFluidx ZEG base unit Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette Hirschmann 9260101
Glass plate dish WPI FD35-100 Commonly referred to as FluoroDish
Incubator Thermoline Scientific TEI-43L
Plastic pipette Livingstone PTP03-01
Polarizing microscope Abrio N/A

References

  1. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  2. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  3. Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
  4. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  5. Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
  6. Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
  7. Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
  8. Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
  9. Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
  10. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
  11. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  12. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  13. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  14. Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
  15. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
  16. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  17. Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
  18. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
  19. Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
  20. Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).

Play Video

Cite This Article
Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease. J. Vis. Exp. (167), e62071, doi:10.3791/62071 (2021).

View Video