فحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات
Summary
يحرك تجديد العضلات الهيكلية الخلايا الجذعية العضلية المقيمة في الأنسجة، والتي تضعف في العديد من أمراض العضلات مثل ضمور العضلات، وهذا يؤدي إلى عدم قدرة العضلات على التجدد. هنا، ونحن نصف بروتوكول يسمح بفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Abstract
العضلات الهيكل العظمي لديه قدرة ملحوظة على تجديد بعد الإصابة, التي تحركها الخلايا الجذعية العضلات المقيمة ملزمة. بعد الإصابة ، يتم تنشيط الخلايا الجذعية العضلية وتخضع لانتشار الخلايا لتوليد مجموعة من الخلايا العضلية ، والتي تفرق لاحقا لتشكيل ألياف عضلية جديدة. في العديد من حالات إهدار العضلات، بما في ذلك ضمور العضلات والشيخوخة، تضعف هذه العملية مما يؤدي إلى عدم قدرة العضلات على التجدد. يتم الحفاظ على عملية تجديد العضلات في حمار وحشي للغاية مع أنظمة الثدييات توفير نظام ممتاز لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية العضلية وتجديدها، في ظروف الهزال العضلي مثل ضمور العضلات. هنا، نقدم طريقة لفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات. تتضمن الخطوة الأولى استخدام منصة جينية تسمح بتحديد النمط الجيني لليرقات قبل الإصابة. بعد تحديد النمط الجيني ، يتم إصابة العضلات باستخدام طعنة إبرة ، وبعد ذلك يتم استخدام المجهر الخفيف المستقطب لتحديد مدى تجديد العضلات. ولذلك نحن نقدم خط أنابيب الإنتاجية العالية التي تسمح بفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Introduction
العضلات الهيكل العظمي تمثل 30-50٪ من كتلة جسم الإنسان، وليس فقط لا غنى عنه للحركة، ولكن أيضا بمثابة جهاز الأيض والتخزين الحرجة1. على الرغم من كونها ما بعد العضلات، والهيكل العظمي ديناميكية للغاية ويحتفظ قدرة تجديدية هائلة بعد الإصابة. ويعزى ذلك إلى وجود الخلايا الجذعية المقيمة في الأنسجة (وتسمى أيضا خلايا القمر الصناعي) ، وتقع تحت الصفيحة القاعدية من الألياف العضلية وتتميز بعوامل النسخ المقترنة بروتين مربع 7 (pax7) و / أو يقترن مربع البروتين 3 (pax3) ، من بين أمور أخرى2،3. بعد الإصابة ، يتم تنشيط الخلية الفضائية وتخضع لانتشار الخلايا لتوليد مجموعة من الخلايا العضلية ، والتي تفرق في وقت لاحق لتشكيل ألياف عضلية جديدة. وتتأثر سلسلة محافظة للغاية من الإشارات المؤيدة للتجدد تنظيم تنشيط الخلايا الفضائية وإصلاح العضلات قوية في ظروف مختلفة مثل اعتلالات عضلية والشيخوخة الهواستاتيكي4،5.
واحدة من هذه المجموعة المتنوعة من اعتلال عضلي هو ضمور العضلات، وتتميز الهزال التدريجي العضلات وانحطاط6. هذه الأمراض هي نتيجة للطفرات الوراثية في البروتينات الرئيسية، بما في ذلك الديستروفين واللامين-α2 (LAMA2)، المسؤولة عن تعلق ألياف العضلات إلى مصفوفة خارج الخلية7،8. وبالنظر إلى أن البروتينات المتورطة في ضمور العضلات تلعب مثل هذا الدور المركزي في الحفاظ على بنية العضلات، لسنوات عديدة كان يعتقد أن الفشل في هذه العملية هو الآلية المسؤولة عن مرض الأمراض المسببة للأمراض9. ومع ذلك ، فقد حددت الدراسات الحديثة عيوبا في تنظيم الخلايا الجذعية العضلية وضعفا لاحقا في تجديد العضلات كأساس ثان ممكن لعلم أمراض العضلات الملاحظ في ضمور العضلات10،11. على هذا النحو، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للتحقيق في كيفية ضعف في وظيفة الخلايا الجذعية في العضلات والعناصر المتخصصة المرتبطة بها يساهم في ضمور العضلات.
على مدى العقد الماضي، ظهر حمار وحشي(دانيو ريو)كنموذج الفقاريات الهامة للنمذجة المرض12. ويعزى ذلك إلى التطور الخارجي السريع لجنين الحمار الوحشي ، إلى جانب وضوحه البصري ، والذي يسمح بالتصور المباشر لتشكيل العضلات والنمو والوظيفة. بالإضافة إلى ذلك، ليس فقط هو تطوير وهيكل العضلات الحفاظ عليها للغاية في حمار وحشي، كما أنها تعرض عملية الحفاظ عليها للغاية من تجديد العضلات13. وبالتالي، تمثل سمك الحمار الوحشي نظاما ممتازا لدراسة علم الأحياء المرضية لأمراض العضلات، واستكشاف كيفية تأثر تجديد العضلات فيه. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة تمكن من الدراسة في الوقت المناسب لتجديد العضلات الهيكل العظمي في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات. يتضمن خط أنابيب الإنتاجية العالي هذا طريقة للنمط الجيني للأجنة الحية14، وبعد ذلك يتم إجراء إصابة طعنة إبرة ويتم تصوير مدى تجديد العضلات باستخدام المجهر الخفيف المستقطب. وبالتالي فإن استخدام هذه التقنية تكشف عن القدرة على تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحرك تجديد العضلات الهيكلية الخلايا الجذعية العضلية المقيمة في الأنسجة الملزمة ، والتي يتم تغيير وظيفتها في العديد من أمراض العضلات مثل ضمور العضلات ، مما يعوق في وقت لاحق عملية تجديد العضلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول الإنتاجية العالية لفحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي حية من أمراض الع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور أليكس فولتشر، وموناش مايكرو إيماجينج للمساعدة في صيانة المجهر والإعداد. 129- ويساند المعهد الأسترالي للطب التجديدي منح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة مشروع جمعية ضمور العضلات (USA) إلى P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
